Абстрацт

Овом студијом установљена је метода танкослојне хроматографије (ТЛЦ) заснована на дигитализацији слике за брзо, једноставно и јефтино откривање четири главна фенилетаноидна гликозида (ПхГ) у Цистанцхеу. Четири ПхГ-а су екстрахована коришћењем 50% метанола и раздвојена на полиамидној плочи са мобилном фазом која се састоји од метанол-хлороформ-глацијалне сирћетне киселине-воде (3,5:1,5:1:7, В/В/В/В). Спот слике су снимљене под УВ светлом од 365 нм и дигитално анализиране коришћењем софтвера ИмагеЈ, који је генерисао интегрисане вредности сиве боје за брзу квантитативну анализу. Метода је показала одличну линеарност заехинакозид, тубулозид А, актеозид и изоактеозид, са коефицијентима корелације (р) од 0,9974, 0,9931, 0,9923 и 0,9890, респективно. Опорави су се кретали у распону од 87,1% до 96,5%, 88,4% до 109,7%, 94,1% до 105,1%, односно 97,0% до 115,1%. Квантитативни резултати добијени овом методом били су у складу са резултатима течне хроматографије високих перформанси (ХПЛЦ). Ова студија пружа брзу и тачну методу за квантитативну анализу четири кључна ПхГ у Цистанцхеу.

Кључне речи:Цистанцхе тубулоса; фенилетаноидни гликозиди; танкослојна хроматографија; ИмагеЈ; брза анализа квалитета цистанцхе

 

Екстракт Цистанцхе са високим садржајем ехинакозида

 

 

 

 

1. Увод

Цистанцхе је вишегодишња паразитска биљка из породице Оробанцхацеае, која се првенствено налази у регионима Синђанг, Унутрашња Монголија и Нингсија у Кини. Као биљни ресурс са лековитом и јестивом вредношћу, његове осушене сочне стабљике су показале значајан економски потенцијал у више индустрија. Међу разним врстама Цистанцхе,Цистанцхе десертицолаиЦистанцхе тубулосасу званично наведени уКинеска фармакопеја, док обе врсте, узЦистанцхе салса, су у јапанској фармакопеји препознати као сирови лек "Никујуиоу". Штавише, Цистанцхе игра кључну улогу у побољшању еколошког окружења у сушним регионима, јер његова ко-садња са биљкама домаћинима доноси значајне еколошке и економске користи пустињским и полупустињским подручјима.

 

Екстракт Цистанцхе са специфичним садржајем флавоноида

У традиционалној кинеској медицини (ТЦМ), Цистанцхе се високо цени као одличан тоник. Године 2020. одобрен је као нови састојак хране у Кини, значајно проширујући њено тржиште и развој производа. Цистанцхе се не користи само за лечење недостатка бубрега-јанга, исцрпљивања крви и есенције, импотенције и неплодности и затвора, већ такође показује обећавајући потенцијал у лечењу фиброзе јетре. Студије хемијског састава су идентификовале фенилетаноидне гликозиде (ПхГ) као једну од главних активних компоненти у Цистанцхеу. Ова једињења – укључујући ехинакозид, актеозид, тубулозид А и изоактеозид – показују широк спектар фармаколошких ефеката, укључујући својства против старења, антиоксиданса, против умора и лаксатив. Ехинакозид и актеозид су званичне компоненте маркера за контролу квалитета Цистанцхеа у фармакопејским стандардима. Тубулозид А показује значајне антиинфламаторне и антиоксидативне активности, док је изоактеозид повезан са когнитивним побољшањем и цитопротективним ефектима.

Традиционалне аналитичке методе за докторске студијеу Цистанцхе укључују течну хроматографију високих перформанси (ХПЛЦ), течну хроматографију ултра високих перформанси (УПЛЦ) и течну хроматографију-масену спектрометрију (ЛЦ-МС). Међутим, ове методе се ослањају на скупу инструментацију, захтевају дуготрајну припрему узорака и захтевају високо квалификоване оператере. Иако блиска инфрацрвена (НИР) спектроскопија нуди брзу и недеструктивну алтернативу, она и даље зависи од великих НИР инструмената и није лако преносива. Сходно томе, постоји хитна потреба за јефтином, лаком за руковање и преносивом методом погодном за квалитативну и квантитативну анализу на лицу места, посебно за примарне апликације тестирања.

Последњих година, напредак у технологији компјутерског вида омогућио је препознавање и обраду слике како би се побољшале традиционалне аналитичке технике, чинећи ТЛЦ ефикасном квантитативном методом. Овај приступ корелира сиву вредност узорака мрља са њиховом концентрацијом. ИмагеЈ, софтвер за обраду слика отвореног кода, истиче се својом једноставношћу и свестраношћу. На пример, Баи ет ал. развио ТЛЦ-ИмагеЈ метод за квантификацију аминобутерне киселине (ГАБА) у пиринчу, потврђујући изводљивост овог приступа за квантитативну анализу засновану на слици.

У овој студији смо снимили ТЛЦ спот слике четири главна ПхГ у Цистанцхе-у, успоставили линеарну везу између садржаја ПхГ и интегрисаних вредности сиве боје и постигли квантитативну анализу сва четири једињења. Овај приступ нуди ново решење за брзо и јефтино откривање на лицу места и има широк потенцијал примене.

О Цхенгду Вецистанцхе Био-Тецх Цо., Лтд.- највећа светска компанија за прераду Цистанцхеа, са базом за узгој Цистанцхеа од 200.000 јутара, ГМП фабриком која може да преради 20.000 тона свежег Цистанцхеа годишње и преко 14 патената који се односе на технологије екстракције Цистанцхеа, укључујући напредну технологију мембранског одвајања. Специјализовани смо за екстракте Цистанцхе пореклом из Хотана, Синђианга, а наши производи испуњавају међународне стандарде квалитета Сједињених Држава и Европске уније. Важно је да се фокусирамо наЦистанцхе тубулосаекстракт, који природно садржи већи садржај фенилетаноидних гликозида – укључујући ехинакозид, актеозид, тубулозид А и изоактеозид – што га чини врхунским избором за нутрацеутске и функционалне примене у храни.

 

Екстракт Цистанцхе са специфичним садржајем актеозида

2. Материјали и методе

2.1 Инструменти и реагенси

Опрема:1000Т мултифункционална брусилица (МинИе Индустри анд Траде Цо., Ионгканг, Кина); АБ135‑С аналитичка вага (Меттлер-Толедо, Швајцарска); ГАМАГ ЛИНОМАТ 5 полуаутоматски споттер (ЦАМАГ, Швајцарска); УВ лампа (ЦАМАГ, Швајцарска); ХПЛЦ систем серије 1200 (Агилент, САД); Адванцед‑ИИИ‑18В систем ултра чисте воде (Танг'с Кангнинг Тецхнологи, Цхенгду, Кина); полиамидне ТЛЦ плоче (10 цм × 10 цм, 10 цм × 20 цм; Сијиа Биоцхемицал Пластицс, Таизхоу, Кина); Двострука комора за развијање (200 мм × 200 мм).

Реагенси:Метанол (аналитичка квалитета, Беилиан Фине Цхемицалс, Тиањин, Кина); метанол и ацетонитрил (класа хроматографије, Сигма-Алдрицх, Шангај, Кина); глацијална сирћетна киселина (аналитичка квалитета, Зхииуан Цхемицал Реагентс, Тиањин, Кина); мравља киселина и хлороформ (аналитичка квалитета, Дамао Цхемицал Реагентс, Тиањин, Кина); ултра чиста вода. Референтни стандарди за ехинакозид, тубулозид А, актеозид и изоактеозид (чистоћа већа или једнака 98%, Иинглаи Тецхнологи, Пекинг, Кина).

Узорци:Свежи узорци Цистанцхеа су набављени из Синђианга, Кина, и обрађени од стране Цхенгду Вецистанцхе Био-Тецх Цо., Лтд. Укупно 51 серијаЦистанцхе тубулосаи 8 серијаЦистанцхе десертицоласакупљени, исечени, осушени, млевени у прах и затворени за складиштење.

Стицање слике:иПхоне 15 Про (резолуција 12МП, отвор бленде Ф2.2, 2× оптички зум).Софтвер за дигитализацију слике:Ф Цолор Пицкер (Девеибо) и ИмагеЈ (верзија 1.54п, Национални институт за здравље, САД).

2.2 Експерименталне методе

2.2.1 Припрема референтних стандардних раствора

Референтни стандарди ехинакозида, тубулозида А, актеозида и изоактеозида су прецизно измерени, растворени у 50% (В/В) метанола и разблажени до запремине у боцама од 10 мЛ да би се добили основни раствори у концентрацијама од 1,003, 1,007, и 1,104 мг/мЛ, респективно

Аликвоти сваког основног раствора (ехинакозид 2 мЛ, тубулозид А 0,5 мЛ, актеозид 1 мЛ, изоактеозид 0,5 мЛ) су пребачени у боцу од 10 мЛ, разблажени до запремине са 50% метанола и филтрирани кроз 0,22 μм стандардне мембране да би се добио мешани раствор стандарда. 210,02, 52,40, 101,12 и 51,14 уг/мЛ, респективно.

2.2.2 Припрема раствора тестних узорака

Цистанцхе узорци су исечени, осушени и млевени да прођу кроз сито од 0,425 мм. Прашак Ц. тубулоса (0,5 г) или прах Ц. десертицола (1,0 г) је тачно измерен, помешан са 30 мЛ 50% метанола, обрађен ултразвуком 40 минута и поново измерен да би се надокнадио губитак тежине. Раствор је филтриран кроз мембрану од 0,22 μм да би се добио раствор тестног узорка.

2.2.3 ТЛЦ развија избор растварача

На основу поларитета растварача, јачине елуирања и прелиминарних експерименталних резултата, процењена су три система растварача у развоју:

Систем 1: Метанол-глацијална сирћетна киселина-вода (2:1:7, В/В)

Систем 2: метанол-хлороформ-глацијална сирћетна киселина-вода (2:1,5:1:7, В/В)

Систем 3: метанол-хлороформ-глацијална сирћетна киселина-вода (3,5:1,5:1:7, В/В)

Аликвоти (сваки по 5 μЛ) мешаног референтног стандардног раствора и раствора тест узорка су нанети као траке на полиамидне ТЛЦ плоче. Након развоја, плоче су осушене и израчунати су фактори ретардације (Рф вредности).

2.2.4 Снимање и обрада слике

ТЛЦ плоче су фиксиране и испитане под УВ светлом од 365 нм. иПхоне 15 Про монтиран на постоље коришћен је за снимање слика из уједначеног угла и висине. Ф Цолор Пицкер и ИмагеЈ софтвер су коришћени за дигиталну квантитативну анализу, претварајући ТЛЦ слике у РГБ вредности, вршне површине и интегрисане вредности сиве. Одузимање позадине и инверзија слике изведени су помоћу ИмагеЈ. Слике су затим конвертоване у 8-битне нијансе сиве, поново инвертоване и контрастно прилагођене за визуелизацију. Циљне траке су одабране за интеграцијску анализу коришћењем сивих вредности за квантификацију.

 

Листа спецификација екстракта Цистанцхе

Посетите светску продавницу Цистанцхе

 

 

 

 

3. Резултати и дискусија

3.1 Избор растварача за развијање

Вредности Рф четири ПхГ-а су систематски упоређене у три тестирана растварача у развоју. Системи растварача 1 и 2 су показали недовољан поларитет, што је резултирало местима која нису мигрирала преко половине висине плоче и лошим одвајањем. Систем растварача 3 (метанол-хлороформ-глацијална сирћетна киселина-вода, 3,5:1,5:1:7, В/В/В/В) дао је оштре и јасно раздвојене тачке са Рф вредностима од 0,67 (ехинакозид), 0,38 (тубулозид А), 0,68осидеозид (0,68). Стога је систем 3 изабран за све наредне ТЛЦ анализе.

3.2 Валидација методе

3.2.1 Калибрациона крива и избор метода обраде слике

Припремљени су мешани референтни стандардни раствори на пет нивоа концентрације, а 5 μЛ сваког је анализирано ТЛЦ. Слике су обрађене коришћењем ИмагеЈ, а калибрационе криве су конструисане цртањем концентрације (к, уг/мЛ) у односу на интегрисану вредност сиве боје (и). Линеарни распони су били 21–210 уг/мЛ за ехинакозид, 5,2–52 уг/мЛ за тубулозид А, 10,1–101 уг/мЛ за актеозид и 5,2–52 уг/мЛ за изоактеозид.

Упоређене су три методе дигитализације слике:

Интегрисана сива вредност– коришћењем ИмагеЈ за мерење средње вредности сиве тачке × површине пиксела (Цтрл + М).

Пеак ареа– генерисање контурних дијаграма и мерење површине врха тачке помоћу алата за штапић.

РГБ вредности– коришћење Ф Цолор Пицкер за добијање интензитета Р, Г, Б канала у центру тачке, са оптимизованим комбинацијама (2Г+Б за ехинакозид, Р за тубулозид А, 2Р+Г за актеозид и изоактеозид).

Међу овим методама, приступ интегрисане вредности сиве вредности дао је највише коефицијенте корелације (р већи или једнак 0,9890), што указује на супериорну тачност за дигитализацију ТЛЦ слике.

3.2.2 Границе детекције и квантификације

ЛОД и ЛОК су израчунати као ЛОД=3.3σ/С и ЛОК=10σ/С (где је σ=стандардна девијација пресека и С=нагиб калибрационе криве). ЛОД вредности су биле 0,041 уг/трака (ехинакозид), 0,005 уг/трака (тубулозид А), 0,008 уг/трака (актеозид) и 0,011 уг/трака (изоактеозид). Одговарајуће вредности ЛОК биле су 0,138, 0,017, 0,026 и 0,037 уг/опсег, респективно.

3.2.3 Прецизност, стабилност и поновљивост

Релативна стандардна девијација (РСД) интегрисаних вредности сиве боје за четири ПхГ-а кретала се од 0,56% до 2,4% за прецизност, 0,76% до 2,2% за стабилност и 0,61% до 1,9% за поновљивост, што све указује на добре перформансе методе.

3.2.4 Опоравак

Просечан опоравак се кретао од 87,1% до 96,5% (ехинакозид), 88,4% до 109,7% (тубулозид А), 94,1% до 105,1% (актеозид) и 96,9% до 115,1% (изоактеозид), што показује задовољство.

3.3 Анализа стварног узорка: ТЛЦ‑ИмагеЈ наспрам ХПЛЦ

Метода ТЛЦ-ИмагеЈ примењена је за квантификацију четири ПхГ у 51 серијиЦистанцхе тубулосаи 8 серијаЦистанцхе десертицола. Квантитативни резултати су потврђени у односу на ХПЛЦ анализу коришћењем упарених т-тестова, који нису показали статистички значајне разлике између две методе за сва четири ПхГ у Ц. тубулоса и за ехинакозид и актеозид у Ц. десертицола (П > 0,05).

Резултати су потврдили да ТЛЦ-ИмагеЈ може прецизно квантификовати не само компоненте фармакопејског маркера (ехинакозид и актеозид), већ и тубулозид А и изоактеозид, који обично нису укључени у рутинску контролу квалитета. Добар договор између ТЛЦ‑ИмагеЈ и ХПЛЦ потврђује изводљивост овог брзог аналитичког приступа за анализу квалитета Цистанцхе.

3.4 Предности ТЛЦ-ИмагеЈ методе за анализу квалитета Цистанцхе

Метода ТЛЦ‑ИмагеЈ нуди неколико кључних предности:

Нема додатног корака бојења– мрље су директно видљиве под УВ светлом од 365 нм као плава флуоресценција.

Висока пропусност– 8–10 узорака се може анализирати истовремено на једној ТЛЦ плочи.

Брза анализа– комплетна квантитативна анализа у року од 30 минута.

Преносив и јефтин– захтева само основну ТЛЦ опрему и паметни телефон, елиминишући зависност од фиксних лабораторијских објеката.

Свестран– применљиво на више ПхГ-ова изван фармакопејских маркера, омогућавајући свеобухватну анализу квалитета.

ЗаЦистанцхе тубулосаДобављачи екстракта као што је Цхенгду Вецистанцхе Био-Тецх Цо., Лтд., ова метода пружа практичан алат за брзу анализу квалитета у процесу и финалног производа, осигуравајући конзистентан садржај ПхГ у серијама како би се испунили високи стандарди које очекују нутриционистичке, функционалне прехрамбене и фармацеутске индустрије на тржишту САД и Европе.

 

 

4. Закључак

Ова студија је успоставила метод дигитализације ТЛЦ слике за брзу квантитативну анализу четири главна фенилетаноидна гликозида у Цистанцхеу: ехинакозид, тубулозид А, актеозид и изоактеозид. Метода је усклађена са физичко-хемијским својствима циљних једињења, не захтева додатно бојење и омогућава истовремену анализу 8-10 узорака на једној ТЛЦ плочи у року од 30 минута. Квантитативни резултати добијени овом методом су у складу са онима из ХПЛЦ-а, потврђујући његову тачност и поузданост.

Метода је посебно погодна за примарне апликације за тестирање и анализу квалитета на терену, јер се ослања на преносиву, јефтину опрему и смањује зависност од лабораторијске инфраструктуре. Већ је имплементиран у објектима за култивацију, прераду и истраживање Цистанцхеа у Синђангу, Кина, демонстрирајући његову практичну корисност.

 

Вецистанцхе Фабрика за узгој и прераду цистанцхе

 

Служба подршке Вецистанцхе-За више детаља о сарадњи
Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

 

Цхенгду Вецистанцхе Био-Тецх Цо., Лтд., највећа светска компанија за прераду Цистанцхе, са поносом примењује и промовише ову напредну, али приступачну методологију анализе квалитета. Са нашом Цистанцхе базом од 200.000 јутара, производним погонима са ГМП сертификатом и најсавременијим технологијама за одвајање мембрана, испоручујемо врхунскеЦистанцхе тубулосаекстракти са природно вишим нивоима фенилетаноидних гликозида - до водећих спецификација у индустрији. Наши производи испуњавају међународне стандарде квалитета САД и ЕУ и погодни су за широк спектар примена, укључујући ТЦМ децокције, функционалну храну, здравствене производе, дијететске суплементе, фармацеутске производе и козметику.

Како глобална потражња за Цистанцхе суплементима наставља да расте – са предвиђањем да ће тржиште достићи 1,13 милијарди долара до 2033. године, вођено повећањем интересовања потрошача за природне производе против старења, когнитивно здравље и виталност – важност поузданих, брзих метода анализе квалитета постаје најважнија. Метода ТЛЦ‑ИмагеЈ која је овде представљена пружа практично решење за произвођаче, добављаче и регулаторна тела како би се обезбедио доследан квалитет производа, чиме се подржава континуирано ширење индустрије Цистанцхе у Сједињеним Државама, Европи и шире.

 

 

Референце

[Оригиналне референце су сачуване и прилагођене према потреби за енглески превод.]

Цхенгду Вецистанцхе Био-Тецх Цо., Лтд.

Веб сајт: ввв.кјцистанцхе.цом

Специјализован за високо-фенилетаноидне гликозидеЦистанцхе тубулосаекстракти

Сертификован са сертификатима СЦ, ХАЦЦП, СОЦА, НОП (УС Органиц Програм) и Међународног удружења за побољшање органских усева (ОЦИА)

Усклађен са тржиштем САД и ЕУ