Полисахариди Цистанцхе Десертицола побољшавају старење црева инхибирајући активацију НЛРП3 инфламазома

 

 

Старење доводи до постепеног опадања вишеструких физиолошких функција и повећава ризик од болести повезаних са старењем [1]. Истраживања су показала да старење има значајан утицај на структуру и функцију црева [2]. Као кључни орган за варење, метаболизам и имунолошку одбрану, старење црева може изазвати малапсорпцију хранљивих материја, метаболичке поремећаје и оштећену имунолошку функцију [3–4], чиме се повећава подложност гастроинтестиналним болестима [5]. Хронична упала је обележје старења црева, али њени молекуларни механизми још увек нису у потпуности разјашњени. Тренутно, агенси против старења углавном укључују бета-никотинамид мононуклеотид (НМН), рапамицин, дасатиниб плус кверцетин и друге [3]. Међу њима, НМН је кључни прекурсор есенцијалног коензима НАД+, а више студија је потврдило да значајно одлаже старење црева код природно остарелих мишева; широко је признат у овој области као ефикасна интервенција [4–5]. Стога је истраживање релевантних механизама и стратегија интервенције од великог значаја.

Цистанцхе орални ликер за болести повезане са старењем

Контактирајте сада упознајте фармере цистанцхе у Кини

Услуга подршке Вецистанцхе-а - највећи извозник цистанцхеа у Кини:
Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

Инфламазом 3 (НЛРП3) породице рецептора за олигомеризацију који се везује за олигомеризацију, који садржи 3 (НЛРП3) је кључни регулатор урођеног имунитета и игра важну улогу у болестима повезаним са старењем. За његово активирање потребна су два сигнала. Први сигнал: молекуларни обрасци повезани са патогеном (ПАМП) и молекуларни обрасци повезани са оштећењем (ДАМП) индукују експресију НЛРП3 и прекурсора интерлеукина-1 (про-IL-1). Други сигнал (као што је ефлукс калијума и оштећење митохондрија) покреће склапање инфламазома, активира каспазу-1 и цепа про-IL-1 и про-IL-18 да би се генерисале зреле IL-1 и IL-18, чиме се изазива упала [6]. Током старења, хомеостаза црева је поремећена, што доводи до ослобађања проинфламаторних фактора као што је липополисахарид (ЛПС), који упорно активира НЛРП3 инфламазом, формирајући хроничну инфламацију ниског степена. Ово додатно погоршава оштећење цревне баријере и дисбиозу, мења експресију протеина тесних спојева, повећава цревну пермеабилност и убрзава старење црева [7–10].

Цистанцхе десертицола, цењена традиционална кинеска лековита и храна хомологна биљка позната као „пустињски женшен“, тонификује јанг бубрега, храни суштину и крв и влажи црева како би ублажио затвор. Његови активни полисахариди показују својства против старења, антиоксиданса и заштиту црева [11–12]. Што се тиче заштите црева, полисахариди Цистанцхе десертицола (ЦДП) могу да модулишу равнотежу цревне микробиоте инхибирајући активацију Толл-лике рецептора 4 (ТЛР4)/нуклеарни фактор-капа Б (НФ-κБ) пута, чиме се смањују нивои ЛПС-а и поправља функција цревне баријере [13–14]. ЦДП такође могу побољшати функцију митохондрија кроз активацију пута протеин киназе активиране АМП (АМПК)/сиртуин 1 (СИРТ1), одложити ћелијско старење, регулисати метаболизам липида и ублажити липотоксичне повреде у ћелијама епитела црева [15].

Иако су доказани интестинални заштитни ефекти ЦДП-а, остаје нејасно да ли они побољшавају старење црева сузбијањем пута НЛРП3 инфламасома. Ова студија има за циљ да истражи механизам којим ЦДП инхибирају активацију инфламасома НЛРП3 допобољшати старење црева.

Материјали

 

1.1 Експерименталне животиње

Педесет здравих мужјака мишева Ц57БЛ/6Ј (10 са 2 месеца старости; 40 са 20 месеци старости) купљено је од Беијинг Спеифу Биотецхнологи Цо., Лтд. Лиценца за производњу: СИКСК (Пекинг) 2023-0011. Животиње су биле смештене у баријерном окружењу у установи за експерименталне животиње у болници традиционалне кинеске медицине у провинцији Хебеи под следећим условима: температура 22 ± 2 степена, релативна влажност 50% ± 10% и циклус светлости од 12 х/12 х таме. Сви мишеви су аклиматизовани 1 недељу. Ову студију је одобрио Комитет за институционалну негу и употребу животиња у болници традиционалне кинеске медицине у провинцији Хебеи (ИАЦУЦ-ХПХЦМ-2025001).

 

1.2 Инструменти и реагенси

 

Криостат (Тхермо Фисхер; ЦриоСтар НКС50)

Конфокални микроскоп за ласерско скенирање (Никон; АКС)

ПЦР систем у реалном времену (Тхермо Фисхер; 7500)

Мултимоде читач плоча (Тецан; Спарк)

Бета-никотинамид мононуклеотид (Бонтац, Кина; кат. БТ05Н120А005)

СА- - комплет за бојење (Соларбио, Пекинг; Цат. 250003003)

ЛПС ЕЛИСА комплет за миш (ЦУСАБИО/Хуамеи, Вухан; кат. ЦСБ-Е13066м)

ТрансЗол Уп Плус РНА комплет (ТрансГен Биотецх, Пекинг; кат. ЕР501-01-В2)

МонАмп ЦхемоХС кПЦР микс (Монад; Цат. МК00501С)

Лгр5 поликлонско антитело (Вухан Саниинг; Цат. 30007-1-АП)

ZO-1 моноклонско антитело, НЛРП3 моноклонско антитело, каспаза-1 моноклонско антитело, АСЦ моноклонско антитело, ГАПДХ моноклонско антитело, Ки67 моноклонско антитело (Абцам; Цатс. аб307799, аб263899, аб179515, аб308)

Методе

 

2.1 Припрема полисахарида Цистанцхе десертицола

Цистанцхе материјал (50 г) је екстрахован два пута декоцијом са 8-струким запреминама воде, сваки пут по 1 сат. Филтрати су комбиновани и охлађени на собну температуру. За преципитацију је додат анхидровани етанол до коначне концентрације од 80%. Након центрифугирања, супернатант је одбачен. Преципитат је растворен у води, дијализован, затим лиофилизован да би се добио узорак.

 

2.2 Груписање животиња и администрација

Након аклиматизације, четрдесет 20-месечних мишева Ц57БЛ/6Ј насумично је распоређено у: групу природног старења, групу са ниским дозама ЦДП (2,5 г·кг-1), групу са високим дозама (5,0 г·кг-1) и НМН групу (200 мг·кг-1). Додатних десет двомесечних СПФ Ц57БЛ/6Ј мишева служило је као млада контролна група. Ниске и високе дозе ЦДП дате су оралном гаважом од 2,5 г·кг−1 и 5,0 г·кг−1, респективно. Користећи конверзију површине тела и фактор конверзије од човека до миша од 12 [16], они одговарају приближно 1× и 2× клиничкој еквивалентној дози за одрасле. НМН група је примила НМН 200 мг·кг-1 путем сонде. Младе контролне групе и групе природног старења добијале су једнаке количине физиолошког раствора (10 мЛ·кг-1). Третмани су примењивани непрекидно 2 месеца.

 

2.3 Припрема смрзнутих делова

Мишеви су анестезирани интраперитонеалном ињекцијом натријум пентобарбитала (30 мг·кг-1) и еутаназирани. Абдомен је брзо отворен, мезентеријум је одвојен, а илеално ткиво је сакупљено и исечено на 5 μм за замрзнуте пресеке [17].

 

2.4 СА- -гал тест за активност интестиналне галактозидазе

Бојење је обављено према упутствима за СА- -гал комплет. После инкубације, раствор за бојење је уклоњен и пресеци су испрани са ПБС. Слике су сакупљене помоћу обрнутог микроскопа.

 

2.5 ПЦР у реалном времену за секреторни фенотип повезан са старењем (САСП)

Укупна РНК из илеалног ткива је екстрахована коришћењем ТрансЗол Уп Плус комплета. Реверзна транскрипција је извршена ГоСцрипт системом под следећим условима: 42 степена 15 мин, 70 степени 15 мин, 4 степена 10 мин. ПЦР у реалном времену је спроведен коришћењем МонАмп ЦхемоХС кПЦР мешавине са следећим циклусима: 95 степени 10 мин; затим 40 циклуса од 95 степени 15 с, 60 степени 1 мин. Крива топљења: 95 степени 15 с, 60 степени 15 с, 95 степени 15 с. ГАПДХ је служио као интерна референца, а релативна квантификација је користила 2^-ΔΔЦт метод. Прајмери ​​су купљени од Промеге. Прајмер секвенце су приказане у табели 1.

 

2.6 Имунофлуоресцентно бојење за експресију ZO-1

Илеално ткиво је фиксирано у 4% параформалдехида и парафинско пресечено на 5 μм. Секције су пермеабилизоване са 0,3% Тритон X-100 током 15 минута и блокиране са 10% козјег серума током 1 х на собној температури. Примарно антитело против ZO-1 (1:200) је примењено преко ноћи на 4 степена. После испирања ПБС-ом, Ци3-коњуговано секундарно антитело (1:500) је инкубирано 1 х на собној температури у мраку. Језгра су обојена ДАПИ током 5 минута. Слајдови су постављени са антифаде медијумом и снимљени конфокалном микроскопијом. Интензитет флуоресценције је квантификован коришћењем софтвера Имаге-Про.

2.7 Имунохистохемија експресије Ки67 и Лгр5

Секције илеума су инкубиране са примарним антителима Ки67 (1:1000) и Лгр5 (1:200) преко ноћи на 4 степена према протоколу ИХЦ кита, затим са одговарајућим секундарним антителима. ДАБ је коришћен за хромогени развој. Резултати су посматрани светлосном микроскопијом. Средња оптичка густина је квантификована коришћењем софтвера Имаге-Про.

 

2.8 ЕЛИСА за нивое ЛПС

Стандарди и узорци (100 μЛ по бунарчићу) су додати на плочу и инкубирани на собној температури 1,5 х. Затим је додат раствор стрептавидина коњугован са ХРП (100 μЛ по бунарчићу) и инкубиран 30 мин. Супстрат је додат под условима заштићеним од светлости и реаговао је 30 мин. Реакција је прекинута са стоп раствором, а апсорбанца је измерена на 450 нм.

 

2.9 Вестерн блот за НЛРП3, каспазу-1 и АСЦ

Приближно 30 мг илеалног ткива је млевено у течном азоту. додат је РИПА пуфер за лизу који садржи инхибиторе протеазе/фосфатазе; лизати су инкубирани на леду 30 минута и центрифугирани на 12.000 × г, 4 степена током 15 минута да би се сакупили супернатанти. Концентрација протеина је одређена БЦА тестом и подешена на 2 уг/μЛ. Једнаке количине протеина (20-40 уг) су раздвојене помоћу СДС-ПАГЕ и пренете на ПВДФ мембране. Мембране су блокиране са 5% немасног млека у трајању од 1 х на собној температури, инкубиране са примарним антителима (НЛРП3 1:1000, Цаспасе-1 1:500, АСЦ 1:1000) преко ноћи на 4 степена, затим са ХРП-коњугованим секундарним антителима: 500 х на собној температури. Након ТБСТ прања, развијени су сигнали. Интензитет опсега је нормализован на ГАПДХ.

 

2.10 Статистичка анализа

Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација. Статистичка анализа и графички приказ извршени су коришћењем СПСС 26.0 и ГрапхПад Присм 8.0.2, респективно. Једносмерна АНОВА је коришћена за процену разлика међу групама, након чега је уследио Тукеијев пост хоц тест. Статистичка значајност је постављена на П < 0,05.

 

Практичне напомене за читаоце заинтересоване за покретљивост црева и развој суплемената

 

Функционални фокус Цистанцхе десертицола: Традиционално се користи за влажење црева и ублажавање опстипације; модерна подршка за баријеру података, модулацију упале (ТЛР4/НФ-κБ) и митохондријалну функцију преко АМПК/СИРТ1.

Потенцијални механизам црева против старења истражен овде: супресија активације НЛРП3 инфламасома; смањење запаљења ниског степена изазваног ЛПС; очување тесних спојева (нпр. ZO-1); одржавање маркера епителне пролиферације/стемнесс (Ки67, Лгр5).

Типичне експерименталне оралне дозе код мишева: 2,5–5,0 г·кг-1 ЦДПс током 2 месеца; NMN 200 mg·kg−1 as positive control.

Translational caution: Mouse doses are not direct human recommendations. The study uses body surface area scaling; human-equivalent formulation and safety, identity testing, and GMP manufacturing are necessary before product development.