Абстрацт

ЦиљДа би се истражио ефекат снижавања мокраћне киселине и процена безбедности ехинакозида (Ецх) екстрахованог изЦистанцхе тубулоса. МетодеУ тесту акутне токсичности КМ мишевима је орално даван Ецх у максималној концентрацији два пута дневно ради посматрања акутне токсичности. Модел хиперурикемије (ХУА) пацова је успостављен коришћењем 1,5 г·кг⁻¹ калијум оксоната + 0.1 г·кг⁻¹ аденина. Пацови модела ХУА су насумично подељени у моделску групу, групу алопуринола (30 мг·кг⁻¹) и групе са ниским, средњим и високим дозама Ецх (50, 75, 100 мг·кг⁻¹), са нормалном контролном групом (н=10 по групи). Лекови су давани интрагастрично једном дневно током 28 узастопних дана. Након примене, пацови су жртвовани, а серум је сакупљен да би се открили релевантни биохемијски индикатори и нивои ксантин оксидазе (КСОД); примећене су бубрежне хистопатолошке промене. Органи су вагани да би се израчунали коефицијенти органа; откривени су нивои експресије сродних гена и протеина у бубрежном ткиву.РезултатиУ тесту акутне токсичности нису примећене очигледне токсичне реакције. Ецх је значајно смањио нивое мокраћне киселине у серуму, значајно побољшао бубрежну функцију и бубрежне тубуларне/интерстицијске лезије код пацова модела ХУА и значајно регулисао нивое транскрипције и експресије протеина гена повезаних са транспортером урата у бубрежном ткиву.ЗакључакЕфекат Ецх на снижавање мокраћне киселине код пацова модела ХУА може бити повезан са смањењем производње мокраћне киселине ин виво, регулацијом бубрежне функције и модулацијом експресије транспортера урата, уз повољну безбедност.Кључне речи: Цистанцхе тубулоса; Ецхинацосиде; Хиперурикемија; Уриц ацид; Транскрипција гена; Експресија протеина; Механизам деловања; Процена безбедности

 

 

 

Цистанцхе тубулоса(Сцхенк) Р. Вигхт је биљка која се обично користи у традиционалној кинеској медицини (ТЦМ). Како је забележено уКинеска фармакопеја, надокнађује јанг бубрега, обнавља суштину и крв, а клинички се користи за импотенцију и неплодност, недостатак есенције и крви и болове у струку и коленима. Фенилетаноид гликозиди су најзаступљеније и биолошки активне компоненте уЦистанцхе тубулоса, показујући велики потенцијал за развој и примену. Наш истраживачки тим је претходно путем мрежне фармакологије и прелиминарних експеримената на мишевима открио да ехинакозид (Ецх) изЦистанцхе тубулосаекстракт може имати ефекте на смањење мокраћне киселине, док се о његовом механизму и безбедности ретко извештава. Ова студија узима патогенезу хиперурикемије као улазну тачку за испитивање фармаколошког ефекта Ецх на снижавање мокраћне киселине, са циљем да се разјасни његов механизам и процени његова безбедност.

1 Материјали и методе

1.1 Инструменти, реагенси и животиње

7100 Аутоматски биохемијски анализатор (Хитацхи, Јапан); Читач микроплоча Мултискан ГО 1510 (Тхермо, САД); БГ-Повер600и систем за електрофорезу (Беијинг Баијинг Биотецхнологи Цо., Лтд.); 7500 Брзи флуоресцентни квантитативни ПЦР систем у реалном времену (Апплиед Биосистемс, САД).

Цистанцхе тубулоса extract (Ech, self-prepared, chromatographic purity >98%); калијум оксонат, аденин (Схангхаи Аладдин Биоцхемицал Тецхнологи Цо., Лтд.); сетови за тестирање креатинина (ЦРЕА), мокраћне киселине (УА), урее (УРЕА), аденозин деаминазе (АДА), аланин трансаминазе (АЛТ), аспартат трансаминазе (АСТ), алкалне фосфатазе (АЛП) (Схензхен Миндраи Био-Медицал Елецтроницс Цо., Лтд.); КСОД сет за анализу активности (Схангхаи Мацклин Биоцхемицал Тецхнологи Цо., Лтд.); антитела УРАТ1, ГЛУТ9, ОАТ1, ОАТ3 (Јиангсу Кинке Биотецхнологи); коњугат козји анти-зечји ИгГ/ХРП (Беијинг Зхонгсхан Јинкиао Биотецхнологи Цо., Лтд., Лот: 245440113); ДЕПЦ (Амресцо, САД); М5 ХиЦлеар ДЛ2000 ДНК маркер (Беијинг Јухемаи Биотецхнологи Цо., Лтд.); ТРИзол™ реагенс (Тхермо Фисхер Сциентифиц, САД); 5× Алл-Ин-Оне РТ МастерМик, ЕваГреен Екпресс 2× кПЦР МастерМик-Лов РОКС (Аибименг Биотецхнологи Цо., Лтд.).

Четрдесет КМ мишева СПФ разреда (мужјаци и женке, 18–22 г) и 90 СПФ мушких СД пацова (150–180 г) обезбедио је Центар за експерименталне животиње Медицинског универзитета Синђианг (лиценца за производњу бр. СЦКСК Ксин 2023-0001).

1.2 Методе и резултати

1.2.1 Тест акутне токсичности

Експерименте на животињама одобрио је Етички комитет Института за истраживање лекова Синђианг (бр. одобрења ИАЦУЦ-(Зхун)-2024-008, ИАЦУЦ-(Зхун)-2024-009). Четрдесет КМ мишева СПФ разреда је насумично подељено у контролну групу и групу за третман (н=20, мужјаци и женке) након карантина и аклиматизације. Мишеви су држани на гладовању преко ноћи са слободним приступом води пре примене. ПремаСмернице за испитивање токсичности једне дозе традиционалних кинеских лекова и природних производа, припремљен је раствор максималне концентрације (250 мг·мЛ⁻¹) који може да се прође кроз иглу за гаважу од 12. КМ мишевима је орално давана 40 мЛ·кг⁻¹ два пута дневно у интервалу од 4 сата, са кумулативном дозом од 20 г·кг⁻¹. Општа стања, боја длаке, активност, ход, ментално стање, измет и урин су пажљиво посматрани у погледу симптома токсичности, времена почетка, трајања и опоравка. Нису уочене нежељене токсичне реакције (нпр. ограничена активност, прострација, безвољност, смрт) у групи која је третирана. Боја длаке, активност, ход, ментално стање, измет и урин остали су нормални током периода посматрања. Телесна тежина и унос хране нису показали значајне разлике између третиране и контролне групе. Груба обдукција на крају посматрања није открила абнормалности у запремини органа, боји или текстури.

 

Слика 1 Ефекти Ецхо телесне тежине (АБ) и узимања хране (Ц, Д) мишева

 

1.2.2 Успостављање модела, груписање и администрација

Шездесет мушких СД пацова (150–180 г) је аклиматизовано и подељено у нормалну контролну групу (н=10) и групу за моделирање (н=50). Групи за моделирање је интрагастрично примењено 100 мг·кг⁻¹ аденин + 1.5 г·кг⁻¹ калијум оксоната (суспендованог у 0,5% ЦМЦ-На) у количини од 10 мЛ·кг⁻¹ једном дневно током 14 дана; контролна група је примила 0,5% ЦМЦ-На. Након моделирања, сакупљена је орбитална крв да би се открила УРЕА, ЦРЕА и серумска мокраћна киселина (СУА). Модел се сматра успешним када су УРЕА, ЦРЕА и СУА значајно повишене. Успешни пацови ХУА модела су подељени у групу модела, групу алопуринола (30 мг·кг⁻¹) и групе са ниским, средњим и високим дозама Ецх (50, 75, 100 мг·кг⁻¹) (н=10 по групи). Да би се одржала стабилна хиперурикемија, свим групама осим контролне, интрагастрично је давано 100 мг·кг⁻¹ аденин + 500 мг·кг⁻¹ калијум оксоната (0,5% ЦМЦ-На суспензија) сваког јутра, и одговарајући лекови сваког поподнева током 14 дана. Агенси за моделирање су тада заустављени, док је примена лека настављена још 14 дана.

1.2.3 Одређивање СУА и мокраћне киселине у урину (УУА) код пацова

Након последње администрације, пацови су гладовани преко ноћи са слободним приступом води. Урин је сакупљен, центрифугиран (3×10³ р·мин⁻¹, 10 мин), разблажен 1:9 физиолошким раствором и тестиран на УУА коришћењем биохемијског анализатора. Крв је сакупљена под анестезијом, а серум је одвојен (3×10³ р·мин⁻¹, 10 мин) за детекцију СУА. У поређењу са контролном групом, група модела показала је значајно повећану СУА (П<0.05) and decreased UUA (P<0.01). The allopurinol group and low-, medium-, and high-dose Ech groups had significantly reduced SUA (P<0.05); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly increased UUA (P<0.05 or P<0.01).

 

Слика 2 Ефекат Ецх на СУА(А) и УУА(Б) код пацова модела хиперурикемије

 

1.2.4 Одређивање нивоа АДА и КСОД у серуму код пацова

АДА у серуму је мерена коришћењем биохемијског анализатора; КСОД активност је откривена ензимским имуносорбентним тестом (апсорбанца на 290 нм). У поређењу са нормалном групом, група модела имала је значајно повишене АДА и КСОД (П<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced ADA (P<0.01); the allopurinol group and high-dose Ech group had significantly reduced XOD (P<0.01).

1.2.5 Одређивање нивоа УРЕА, ЦРЕА, АЛТ, АСТ, АЛП у серуму

У поређењу са нормалном групом, група модела је имала значајно повишене вредности УРЕА и ЦРЕА (П<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group had significantly reduced UREA (P<0.01); all Ech dose groups had significantly reduced UREA and CREA (P<0.05 or P<0.01); medium-/high-dose Ech groups had significantly reduced ALT (P<0.01); low-dose Ech group had significantly increased ALP (P<0.01).

1.2.6 Одређивање коефицијента бубрежног органа код пацова

Коефицијент органа=маса органа (мг)/телесна тежина (г). У поређењу са нормалном групом, група модела имала је значајно смањење телесне тежине наташте (П<0.01) and increased kidney and adrenal gland coefficients (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, all Ech dose groups had significantly increased body weight (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced kidney coefficients (P<0.01).

 

Табела 1 Ефекти Ецх на нивое УРЕА, ЦРЕА, АЛТ, АСТ и АЛП код пацова модела хиперурикемије (кˉ±с, н=10)

 

Група	Доза / мг·кг⁻¹	УРЕА / ммол·Л⁻¹	ЦРЕА / μмол·Л⁻¹	АЛТ / У·Л⁻¹	АСТ / У·Л⁻¹	АЛП / У·Л⁻¹
Контрола	–	8.00 ± 0.71	34.11 ± 3.33	51.22 ± 3.80	109.11 ± 11.62	206.00 ± 42.20
Модел	–	23.20 ± 6.05**	100.10 ± 43.59*	62.00 ± 9.64	109.10 ± 7.92	173.10 ± 27.30
Аллопуринол	30	10.70 ± 1.95##	55.20 ± 13.27	52.70 ± 12.79	117.50 ± 21.71	198.40 ± 52.66
Ецх	50	11.20 ± 3.33##	44.80 ± 21.01#	55.70 ± 12.59	106.10 ± 13.80	242.11 ± 55.04##
	75	9.90 ± 1.45##	41.20 ± 4.54#	46.50 ± 5.72##	102.10 ± 16.11	183.70 ± 22.31
	100	8.90 ± 1.10##	35.20 ± 2.74#	46.50 ± 5.72##	106.00 ± 15.19	195.20 ± 33.96

Напомена:У поређењу са контролном групом: *П<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

Табела 2 Ефекти Ецх на коефицијенте органа код пацова модела хиперурикемије (кˉ±с, н=10)

 

Група	Доза / мг·кг⁻¹	Телесна тежина наташте / г	Коефицијент јетре	Коефицијент бубрега	Коефицијент надбубрежне жлезде	Коефицијент слезине	Тхимус Цоеффициент
Контрола	–	403.6 ± 28.0	26.92 ± 3.15	6.57 ± 0.55	0.14 ± 0.04	1.88 ± 0.26	1.07 ± 0.15
Модел	–	352.5 ± 38.5**	26.60 ± 1.78	11.52 ± 1.67**	0.18 ± 0.03*	2.12 ± 0.23	1.03 ± 0.17
Аллопуринол	30	367.5 ± 26.3	25.76 ± 1.14	7.93 ± 0.51##	0.16 ± 0.03	1.93 ± 0.35	1.08 ± 0.27
Ецх	50	392.3 ± 28.3#	27.04 ± 2.14	8.06 ± 0.54##	0.16 ± 0.04	2.09 ± 0.24	1.09 ± 0.19
	75	388.4 ± 34.8#	26.78 ± 2.37	7.80 ± 0.78##	0.16 ± 0.02	2.00 ± 0.20	0.99 ± 0.25
	100	386.3 ± 41.4#	25.91 ± 1.46	7.58 ± 0.33##	0.18 ± 0.03	2.09 ± 0.28	1.17 ± 0.31

Напомена:У поређењу са контролном групом: *П<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

 

 

1.2.7 Хистопатолошко посматрање бубрега пацова (ХЕ бојење)

Ткива бубрега су фиксирана, дехидрирана, уграђена, исечена (4 μм), обојена ХЕ и запечаћена. Група модела показала је осипање бубрежних тубуларних епителних ћелија, некротичне и инфламаторне ћелијске инфилтрације и фокалне инфламаторне инфилтрације у интерстицијуму бубрега. Група алопуринола је показала благе лезије; Групе за третман Ецх су показале олакшано одвајање епителних ћелија, некрозу и инфламаторну инфилтрацију.

 

 

Слика 4 ХЕ бојење слике фраткиног ткива контролне групе (А), групе модела (Б), алопуринол групе (Ц, Д), ниске (Е) и високе
(Ф)групе дозе Ецх(×400)

 

1.2.8 Протеинска експресија УРАТ1, ГЛУТ9, ОАТ1, ОАТ3 у бубрезима пацова

Урађена је имунохистохемија да би се открила експресија протеина (интегрисана оптичка густина, ИОД). У поређењу са нормалном групом, група модела је значајно повећала УРАТ1 и ГЛУТ9 (П<0.01) and downregulated OAT1 and OAT3 (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 and GLUT9 (P<0.05, P<0.01) and upregulated OAT1 (P<0.05, P<0.01); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly upregulated OAT3 (P<0.05, P<0.01).

 

Слика 5 Ефекти ЕцхонУРАТ1/ИОДвалуес(А),ГЛУТ9/ИОДвалуес(Б),ОАТ1/ИОДвалуес(Ц),иОАТ3/ИОДвалуес(Д)ин
бубрежно ткиво хиперурикемије модела пацова

 

Слика 6 Ефекти Ецх на експресију УРАТ1 бубрега код пацова са моделом хиперурикемије

(Контролна група (А), група модела (Б), алопуринолна група (Ц) и 50, 75, 100 мг·кг⁻¹ Ецх групе (Д–Ф); ИХЦ ×400)

 

Слика 7 Ефекти Ецх на експресију ГЛУТ9 бубрега код пацова са моделом хиперурикемије

(Контролна група (А), група модела (Б), алопуринолна група (Ц) и 50, 75, 100 мг·кг⁻¹ Ецх групе (Д–Ф); ИХЦ ×400)

Слика 8 Ефекти Ецх на експресију ОАТ3 бубрега код пацова са моделом хиперурикемије

(Контролна група (А), група модела (Б), алопуринолна група (Ц) и 50, 75, 100 мг·кг⁻¹ Ецх групе (Д–Ф); ИХЦ ×400)

Слика 9 Ефекти Ецх на експресију ОАТ1 бубрега код пацова са моделом хиперурикемије

(Контролна група (А), група модела (Б), алопуринолна група (Ц) и 50, 75, 100 мг·кг⁻¹ Ецх групе (Д–Ф); ИХЦ ×400)

 

 

1.2.9 мРНА Експресија УРАТ1, ГЛУТ9, ОАТ1, ОАТ3 у бубрезима пацова

Укупна РНК је екстрахована и реверзно транскрибована; кПЦР је изведен коришћењем 2⁻ΔΔЦт методе. У поређењу са нормалном групом, група модела имала је значајно повећану регулацију УРАТ1 и ГЛУТ9 мРНА (П<0.05) and downregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and low-/medium-dose Ech groups had significantly downregulated GLUT9 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly upregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05).

 

Табела 3 Прајмер секвенце

 

Име прајмера	Секвенца (5′ до 3′)	Величина производа
УРАТ1-	Ф: ГТТЦЦЦАТГГЦЦТЦЦАГАТТР: ЦАТАТГЦАТГЦЦАЦАЦАГЦЦ	121 bp
ГЛУТ9	Ф: ТЦТГЦЦТТГГЦТГАГТАТТГАР: АТГТГТЦЦЦЦЦАЦАТЦАТТГТ	2147 bp
ОАТ1	Ф: ТГТГААГЦЦЦТТЦЦГТТЦТЦР: ТГТГААГЦЦЦТТЦЦГТТЦТЦ	218 bp
ОАТ3	Ф: ТАЦЦТГЦАТГТГАЦЦТТГЦТГР: ГАГАЦАЦТТЦТЦАГГЦТТЦЦЦ	171 bp
-Актин	Ф: ЦЦЦАТЦТАТГАГГГТТАЦГЦР: ТТТААТГТЦАЦГЦАЦГАТТТЦ	150 bp

 

1.2.10 Статистичка анализа

Подаци су анализирани коришћењем СПСС 20.0, изражених као средња вредност ± стандардна девијација (к±с). Једносмерна АНОВА је коришћена за групна поређења, а ЛСД или Тамханеов Т2 за пост-хоц тестове. П<0.05 was considered statistically significant.

Слика 5 Ефекти ЕцхонУРАТ1/ИОД вредности (А), ГЛУТ9/ИОД вредности (Б), ОАТ1/ИОД вредности (Ц) и ОАТ3/ИОД вредности (Д) у бубрежном ткиву хиперурикемије модела пацова

 

2 Дискусија

Перзистентна хиперурикемија изазива повреду бубрега изазвану мокраћном киселином и мења биомаркере функције бубрега. Ова студија је успоставила модел ХУА пацова користећи аденин у комбинацији са калијум оксонатом, са УРЕА, ЦРЕА и СУА као кључним индикаторима. Резултати су показали да Ецх изЦистанцхе тубулосапобољшана бубрежна функција и смањена СУА код ХУА модела пацова, испољавајући терапеутске ефекте. Хиперурикемија настаје услед прекомерне производње мокраћне киселине и поремећеног излучивања. Хепатична КСОД и АДА су кључни ензими у синтези мокраћне киселине; прекомерна производња је главни узрок ХУА. Отприлике две трећине дневне мокраћне киселине се излучује преко бубрега, што доводи до дисфункције излучивања бубрега примарним покретачем. УРАТ1 и ГЛУТ9 посредују у реапсорпцији мокраћне киселине, док ОАТ1 и ОАТ3 олакшавају излучивање мокраћне киселине – сви су кључни циљеви за развој лекова за снижавање мокраћне киселине. Ецх је значајно смањио хепатичку АДА и КСОД, смањио ренални УРАТ1/ГЛУТ9 (протеин и мРНА) и повећао ОАТ1/ОАТ3 (протеин и мРНА), што указује да његов ефекат снижавања мокраћне киселине делује кроз смањење синтезе и регулисање транспортера. У испитивању акутне токсичности, код мишева није примећена смртност или очигледна акутна токсичност. Ецх је побољшао бубрежну функцију и снизио јетрени АЛТ код ХУА пацова без утицаја на АСТ или коефицијенте органа, потврђујући повољну безбедност. У закључку, Ецх испољава значајне ефекте на снижавање мокраћне киселине код пацова ХУА изазваних аденин-калијум оксонатом тако што потискује АДА/КСОД-посредовану синтезу мокраћне киселине, штити бубрежну функцију и балансира експресију транспортера урата, уз поуздану сигурност за потенцијалну клиничку примену.

Референце

Зханг МХ, Ду ЈВ, Зханг Т, ет ал. Механизам Бикие Фенкинг Ван-а у интервенцији пацова са хиперурикемијом регулацијом експресије транспортера урата [Ј]. Кинески часопис експерименталних традиционалних медицинских формула, 2023, 29(3): 1–8.

Ниу ИФ, Зхоу ИФ, Лин Х, ет ал. Инхибиција 3,5,2′,4′-тетрахидроксихалкона на производњу мокраћне киселине код хиперурикемичних мишева изазваних хипоксантином [Ј]. Биолошки и фармацеутски гласник, 2018, 41(1): 99–105.

Фредериц Л. Гоут: ажурирање [Ј]. Часопис за хирургију костију и зглобова, 2019, 86(1): 103–115.

Такео Н, Коухеи О, Схо С, ет ал. Функционална сарадња УРАТ1 (СЛЦ22А12) и УРАТв1 (СЛЦ2А9) у бубрежној реапсорпцији урата[Ј]. Трансплантација нефролошке дијализе, 2013, 28(3): 603–611.

Лее СИ, Цхо СС, Хан КМ, ет ал. Корејски црвени гинсенг побољшава нивое мокраћне киселине у серуму кроз смањење УРАТ1 и повећање ОАТ1 и ОАТ3[Ј]. Биолошки и фармацеутски билтен, 2024, 47(11): 1876–1882.

Фалах К, Зханг П, Нигам АК, ет ал. Ин виво регулација природних производа малих молекула, антиоксиданата и хранљивих материја помоћу ОАТ1 и ОАТ3[Ј]. Нутриентс, 2024, 16(14): 2242.

 

Хигх-ЦонтентЦистанцхеИзвор залиха за снижавање мокраћне киселине

За институције, практичаре и појединце фокусиране набиљне терапије за смањење мокраћне киселинеи лечење хиперурикемије,високе чистоћеЦистанцхе тубулосаекстрактје поуздана природна сировина са провереном ефикасношћу.

Основне предности извора снабдевања

Високо стандардизоване активне компоненте

Ехинакозид (Ецх): веће или једнако 10%–40%

Актеозид: већи или једнак 4%-16%

Укупни фенилетаноидни гликозиди: Већи или једнаки 40%–85% (Задовољава спецификације за храну и екстракте за истраживање и развој и развој производа)

 

База и фабрика Цистанцхе

Контактирајте сада

 

Служба подршке Вецистанцхе-За више детаља о сарадњи
Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

 

Верификовани механизам за смањење мокраћне киселине

Инхибира КСОД/АДА за смањење синтезе мокраћне киселине

Регулише УРАТ1/ГЛУТ9/ОАТ1/ОАТ3 ради промовисања излучивања мокраћне киселине

Штити функцију бубрега и ублажава оштећење бубрега узроковано хиперурикемијом

Безбедан и добро подношљив

Тест акутне токсичности: Нема очигледних нежељених реакција при високим дозама

Нема значајних оштећења јетре, бубрега или главних органа

У складу са захтевима за исхрану и дијететске додатке

Ауторитативна веза за снабдевање

хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/цистанцхе-ектрацт-продуцт/хербал-цистанцхе-диетари-супплемент-цапсулес.хтмл

 

Овај извор пружа стандардизованеЦистанцхе тубулосаекстракт, капсуле, таблете, оралне течности и услуге обраде по мери, подржавајући развој биљних производа за снижавање мокраћне киселине, клиничка истраживања и формулацију дијететских суплемената.