Абстрацт

Депресија представља веома распрострањен и онемогућавајући психијатријски поремећај на глобалном нивоу. Све већи докази показују да прекомерна неуроинфламаторна активација у хипокампусу значајно доприноси настанку и напредовању симптома депресије. Цистанцхе фенилетанол гликозиди (ЦПхГ), главни биоактивни састојци екстраховани из традиционалног јестивог лековитог биљаЦистанцхе десертицолаиЦистанцхе тубулоса, су показали вишеструка неуропротективна фармаколошка својства у претходним студијама. Ово садашње истраживање имало је за циљ да истражи терапеутске утицаје и молекуларне механизме које врше ЦПхГ на фенотипове понашања налик депресији изазване хроничним непредвидивим благим стресом (ЦУМС) код Ц57БЛ/6 мишева.

Шездесет мишева Ц57БЛ/6 СПФ-класе насумично је подељено у шест експерименталних кохорти: контролна група, група ЦУМС-модела, група са високим дозама ЦПхГс (700 мг/кг), група са средњом дозом ЦПхГс (350 мг/кг), ниска доза (175 мг/кг), група са ниском дозом (175 мг/кг) група флуоксетина (15 мг/кг). Након четворонедељне интервенције давања лека након ЦУМС моделирања, примењене су свеобухватне неуробихејвиоралне процене укључујући тест преференције сахарозе (СПТ), тест отвореног поља (ОФТ), тест вешања репа (ТСТ) и тест принудног пливања (ФСТ). Комплети за ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА) квантификују серумске концентрације неуротрансмитера моноамина, заједно са хипокампалним проинфламаторним цитокинима и инфламаторним медијаторима. Бојење хематоксилин-еозином (ХЕ) и Ниссл бојење визуализује патолошке повреде неурона унутар региона зупчастог гируса хипокампуса. Имунохистохемија је детектовала интензитет експресије глијалног фибриларног киселог протеина (ГФАП), јонизованог адаптерског молекула који везује калцијум-1 (Иба-1), НЛРП3 и протеина каспазе-1. Имунофлуоресцентно бојење додатно је проценило статус активације узводне ТЛР4/НФ-κБ сигналне каскаде.

Наши експериментални резултати су показали да орална примена ЦПхГ-а значајно ублажава абнормалности понашања повезане са депресијом. ЦПхГ-ови су повећали проценат преференције сахарозе и смањили трајање непокретности у парадигмама понашања заснованим на очају. Штавише, третман ЦПхГс је вратио осиромашени ниво серума и хипокампалног серотонина (5‑ХТ), као и нивое допамина (ДА). Биохемијска детекција је открила значајну супресију хипокампалних проинфламаторних медијатора и прекомерну производњу цитокина. Хистопатолошка запажања су илустровала дозно-зависно олакшање ЦУМС-провоцираног оштећења неурона хипокампуса. Имунохистохемијски резултати су показали да је ЦПхГс повећао густину астроцита обележену ГФАП-ом, инхибирао патолошку хиперактивацију Иба-1-позитивне микроглије и смањио обиље протеина везаних за НЛРП3 инфламазом. Тестови имунофлуоресценције су потврдили да ЦПхГс ограничавају прекомерну активацију ТЛР4 и фосфорилисане НФ-κБ п65 унутар хипокампалног ткива.

Заједно, ови налази потврђују да ЦПхГ испољавају истакнуту ефикасност налик антидепресивима против ЦУМС-стимулисаних манифестација сличних депресији код мишева. Његов фармаколошки механизам је делимично посредован кроз двоструке регулаторне функције: обнављање хомеостазе моноаминских неуротрансмитера и обуздавање неуроинфламаторних одговора посредованих сигналном осом ТЛР4/НФ‑κБ/НЛРП3. Ова студија на животињама пружа претклиничку експерименталну основу која подржава даљу експлоатацију ЦПхГ-а као обећавајућих природних кандидата или функционалних састојака хране за помоћне интервенције депресије.

Кључне речи: Цистанцхе фенилетанол гликозиди (ЦПхГс); депресија; хронични непредвидиви благи стрес; неуроинфламација; астроцити; микроглија; ТЛР4/НФ‑κБ/НЛРП3 пут инфламасома

1. Увод

Депресија је вишеструка афективна психијатријска болест коју карактеришу основне клиничке манифестације које се састоје од трајног лошег расположења, анхедоније, психомоторне ретардације, поремећаја спавања и будности и соматске дисфункције. Тешке депресивне епизоде ​​потенцијално доводе до самоповређивања и суицидалних идеја, намећући огромна оптерећења за јавно здравље широм света. Подаци епидемиолошког истраживања из Кине показују да је национална преваленција депресије достигла 2,1%, а Светска здравствена организација је класификовала велики депресивни поремећај међу болестима које су највише рангиране које доприносе глобалном губитку животних година прилагођених инвалидности.

Ипак, комплетна молекуларна етиологија која лежи у основи патогенезе депресије остаје непотпуно разјашњена, што омета савршена клиничка терапијска решења. Савремене патофизиолошке хипотезе су помериле фокус ка неуро-имуним механизмима преслушавања. Акумулирајућа претклиничка и клиничка истраживања наглашавају упорну неуроинфламацију као витални патогени покретач депресивних поремећаја. Под хроничним психолошким или физиолошким стресним изазовима, популације хипокампалних глијалних ћелија пролазе кроз абнормалну активацију. Претерано активирана микроглија и дисфункционални астроцити покрећу снажно ослобађање вишеструких проинфламаторних медијатора, стварајући ефекте каскаде проинфламаторних цитокина. Такви неуро-инфламаторни инзулти даље изазивају морфолошко погоршање неурона, поремећај метаболизма неуротрансмитера и оштећење синаптичке пластичности, на крају олакшавајући патолошку прогресију налик депресији.

Тренутне главне клиничке интервенције антидепресива претежно се ослањају на синтетичке хемијске антидепресиве које представља флуоксетин, селективни инхибитор поновног преузимања серотонина (ССРИ). Упркос делимичном ублажавању симптома код одређених пацијената, синтетички антидепресиви поседују добро познате недостатке: незадовољавајући однос потпуне ремисије, чести резидуални симптоми депресије, велика вероватноћа релапса након престанка узимања лекова, плус нежељена гастроинтестинална, хепатичка и метаболичка нуспојава током дуготрајне примене. Насупрот томе, традиционални биљни лекови имају вишециљне модулаторне карактеристике и релативно благе безбедносне профиле, због чега привлаче све већи истраживачки интерес за помоћну терапију поремећаја расположења.

Цистанцхе десертицолаиЦистанцхе тубулоса, који се обично назива "пустињски гинсенг", припада породици Оробанцхацеае. Њихове меснате стабљике служе као класична хомологна лековита сировина за храну у традиционалној азијској биљној пракси. Савремена фармаколошка истраживања документују вишеструку неуропротективну биоактивност заЦистанцхеекстракти, укључујући анти-неуродегенеративне ефекте против Алцхајмерове болести и Паркинсонове болести. Фенилетанол гликозиди чине главне биоактивне фракције унутраЦистанцхеекстракти, који углавном садрже ехинакозид и вербаскозид. Цистанцхе фенилетанол гликозиди (ЦПхГ) показују анти-туморске, антиоксидативне, имуномодулаторне и неурозаштитне биоактивности на више експерименталних платформи.

Претходни прелиминарни лабораторијски рад је показао да ЦПхГ могу повећати концентрацију допамина у стријату и ублажити депресивне фенотипове повезане са менопаузом код животињских модела глодара. Међутим, да ли ЦПхГ производе заштитне утицаје на депресију изазвану хроничним стресом, и детаљним каскадама трансдукције сигнала које посредују у таквим биоактивностима још увек недостаје систематско истраживање. Животињска парадигма хроничног непредвидивог благог стреса (ЦУМС) стоји као један добро успостављен модел претклиничке депресије. Излажући лабораторијске глодаре разноврсним насумичним благим стресорима током узастопних недеља, ЦУМС поуздано рекапитулира основне депресивне карактеристике као што су анхедонија, очај у понашању и неуропатолошка оштећења хипокампуса.

Сходно томе, ово истраживање је конструисало модел депресивног миша изазваног ЦУМС-ом да би систематски проценио ин-виво потенцију налик антидепресивима три градијентне дозе ЦПхГ-а. Посебно смо се фокусирали на опоравак моноаминских неуротрансмитера, фенотипску трансформацију глијалних ћелија хипокампуса и неуроинфламаторни пут НЛРП3 инфламасома којим управља ТЛР4/НФ‑κБ. Ова студија има за циљ да пружи објективне експерименталне доказе који ће подржати будући фармацеутски развој и функционалну примену ЦПхГ-а у храни који циљају на побољшање симптома депресије.

2. Материјали и методе

2.1 Експериментални материјали, реагенси и инструменти

Стандардизовани сирови екстракт ЦПхГс набављен је од Хотан Дицхен Пхармацеутицал Биологицал Цо., Лтд (серија бр.. 20231221, Ксињианг, Кина). Укупан садржај фенилетанол гликозида већи или једнак 85%, који садржи ехинакозид већи или једнак 40% и вербаскозид већи или једнак 16%. Флуоксетин хидрохлорид капсуле су набављене од Патхеон Франце. Комерцијални комплети за ЕЛИСА тестове за 5‑ХТ, ДА, иНОС, ЦОКС‑2, ПГЕ2, ТНФ‑, ИЛ‑1, ИЛ‑18, ИЛ‑6, ИФН‑ набављени су од квалификованих добављача биолошких реагенса. Примарна антитела примењена за имунохистохемију и имунофлуоресценцију укључивала су анти-ГФАП, анти-Иба-1, анти-НЛРП3, анти-Цаспасе-1, анти-ТЛР4 и анти-фосфо-НФ-κБ антитела п65. Комплети за хистолошко бојење за ХЕ и Ниссл бојење припремљени су за обраду парафинског пресека мозга.

Кључни лабораторијски аналитички инструменти покривали су прецизну електронску аналитичку вагу, Милли-К радну станицу за пречишћавање ултра-чисте воде, СпецтраМак мулти-моде читач микроплоче, Леица усправни флуоресцентни микроскоп, плус комплетан хардвер за анализу понашања глодара и софтверски систем за праћење кретања СМАРТ 3.0.

Шездесет мужјака Ц57БЛ/6 СПФ-класе мишева, старих седам недеља са почетним распоном телесне тежине 18-22 г, купљени су од Беијинг Витал Ривер Лаборатори Анимал Тецхнологи Цо., Лтд. ИД одобрења: СУЦМДЛ20231015003). Мишеви су смештени у објектима за смештај животиња без специфичних патогена. Параметри животне средине су одржавани на температури околине (21 ± 2) степена, релативној влажности 60 % ± 10 %, применом стандардних 12-часовних циклуса осветљења светло-тамно. Храна за глодаре и вода за пиће били су доступни ад либитум. Једнонедељни период адаптивне аклиматизације је обављен пре покретања формалних експерименталних токова рада.

2.2 Груписање животиња, моделирање ЦУМС-а и администрација лекова

Након једнонедељног адаптивног подизања, прелиминарни скрининг преференције сахарозе искључио је појединачне мишеве са инхерентним ниским преференцијама да пију шећер. Квалификовани експериментални мишеви су рандомизирани у шест студијских група (н = 10 животиња у свакој групи):

Контролна група (Цон): нема ЦУМС стреса, интрагастрична примена изоволуметријске дејонизоване воде;

Група модела ЦУМС (Мод): примање пуне ЦУМС стимулације, гаважа са дејонизованом водом једнаке запремине;

Група са високим дозама ЦПхГс (ЦПхГс‑Х): изложеност ЦУМС, ЦПхГс 700 мг/кг телесне тежине дневном гаважом;

Група средњих доза ЦПхГс (ЦПхГс‑М): изложеност ЦУМС, ЦПхГс 350 мг/кг дневном гаважом;

Група са ниским дозама ЦПхГс (ЦПхГс‑Л): изложеност ЦУМС, ЦПхГс 175 мг/кг дневном гаважом;

Флуоксетин позитивна контролна група (ФЛКС): изложеност ЦУМС, флуоксетин 15 мг/кг гаважа једном дневно.

За конструкцију ЦУМС модела, усвојено је десет различитих врста благих стресора: физичко ограничење (60 мин), хоризонтално мућкање (60 мин), суспензија репа (60 мин), угао нагнутог кавеза од 45 степени (24 х), влажно окружење (24 х), празан кавез, изолација преко ноћног светла (24 х). пливање у топлој води на 41 степен у трајању од 5 минута, пливање у хладној води на 4 степена у трајању од 5 минута и стимулација репа у трајању од 2 минута. Два различита стресора примењивана су насумично сваког дана; идентични стресор се не би појављивао узастопно у два суседна дана. ЦУМС процедура моделирања је трајала четири недеље.

По завршетку четворонедељног моделирања стреса, одговарајуће тестне супстанце или растварач су испоручени интрагастрично једном дневно током још четири недеље непрекидно. У осмој експерименталној недељи, сви пројекти неуробихејвиоралне детекције су имплементирани узастопно.

2.3 Батерија за неуро-бихејвиорални тест

2.3.1 Тест преференције сахарозе (СПТ)

Тест преференције сахарозе процењује депресивни фенотип сличан анхедонији код глодара. Пре формалног мерења, сваки миш је био појединачно смештен. Извршена је тродневна фаза адаптације на пиће са сахарозом. Први дан: две боце 1% раствора сахарозе стављене у сваки кавез на 24 х. Други дан: једна боца раствора сахарозе упарена са једном боцом пречишћене воде. Трећи дан: замените положај контејнера за шећер-воду и чисту воду да бисте елиминисали утицај пристрасности локације. Након циклуса адаптације, мишеви су постили храну и воду 24 сата. Након тога, обезбеђене су претходно измерена боца за воду од 1% сахарозе и боца са пречишћеном водом. Положаји боца су замењени након 12 х. Након укупног трајања тестирања од 24 сата, преостала тежина течности обе боце је тачно забележена. Стопа преференције сахарозе (%)=(потрошња раствора сахарозе)/(потрошња раствора сахарозе + потрошња пречишћене воде) × 100%.

2.3.2 Тест отвореног поља (ОФТ)

Апарат отвореног поља формирао је кубичну кутију са отвореним врхом величине 50 цм × 50 цм × 50 цм. Централни квадратни регион је дефинисан као централна зона димензија 25 цм × 25 цм са средиштем унутар арене. Сваки миш је нежно позициониран на централну површину кутије отвореног поља. Дозвољено је петоминутно слободно време за адаптацију. Снимање понашања и анализа података концентрисани су на следећи период посматрања од пет минута. Примарни индикатори очитавања садржали су укупну удаљеност кретања, време проведено унутар централне зоне и учесталост уласка у централну зону. Ови параметри одражавају спонтану локомоторну активност и истраживачку спремност у непознатим условима средине.

2.3.3 Тест задњег вешања (ТСТ)

Део мишјег репа био је безбедно фиксиран омогућавајући животињи да виси наопачке изнад површине земље. Укупно време снимања било је шест минута. Документовано је трајање непокретног времена током каснијег сегмента од четири минута. Продужено време непокретности представља побољшани статус налик депресивном понашању и очају.

2.3.4 Тест присилног пливања (ФСТ)

Провидно цилиндрично буре за пливање (пречник 15 цм, висина 50 цм) напуњено је водом одржаване на (25 ± 2) степена; дубина воде достигла 20 цм. Сваки миш је нежно стављен у посуду за пливање у укупном интервалу снимања од шест минута. Плутајуће време непокретности у последња четири минута је статистички квантификовано. Дужи период непокретности указује на појачане перформансе понашања у вези са очајем.

2.4 Сакупљање узорака и припрема ткива

У експерименталној терминалној тачки 8. недеље, мишеви су подвргнути интраперитонеалној ињекцији 3% пентобарбитал натријума (10 мЛ/кг) за дубоку анестезију. Узорци крви су узети техником крварења за уклањање очне јабучице. Након тога је извршена еутаназија цервикалне дислокације. Хладна нормална физиолошка перфузија срца очистила је циркулишућу крв унутар церебралних ткива. Комплетни узорци целог мозга брзо су сецирани. Половина можданог ткива је уроњена у 4% раствор параформалдехида за 72 сата фиксације ткива за каснију хистологију. Регије мозга хипокампуса су брзо изоловане од преосталих узорака мозга на претходно охлађеној леденој платформи и сачуване у окружењу за складиштење течног азота. За биохемијско мерење, узорак ткива хипокампуса од 10 мг је помешан са претходно охлађеним нормалним физиолошким раствором у односу масе и запремине 1:9, подвргнут механичкој хомогенизацији у леденом купатилу. Хомогенат ткива је центрифугиран на 4000 р/мин током 15 мин, а фракције супернатанта су сакупљене за квантификацију биомаркера ЕЛИСА.

2.5 Мерење биохемијског индекса

Према упутствима произвођача за употребу комерцијалних ЕЛИСА комплета, измерени су узорци супернатанта серума и хомогената хипокампуса да би се добиле вредности концентрације моноаминских неуротрансмитера укључујући 5‑ХТ и ДА. Супернатант хипокампалног хомогената је даље испитан на индикаторе инфламаторних медијатора иНОС, ЦОКС-2, ПГЕ2, поред проинфламаторних цитокина ТНФ‑, ИЛ‑1, ИЛ‑18, ИЛ‑6 и ИФН‑. Очитавања апсорбанције оптичке густине су снимљена спектрофотометром на микроплочи. Концентрација протеина у узорку је калибрисана применом комплета за квантификацију БЦА протеина пре детекције цитокина.

2.6 Хипокампално хистопатолошко бојење

Фиксни узорци можданог ткива су уграђени у парафински восак и исечени на хистолошке пресеке дебљине 4 µм. За ХЕ бојење: парафинске секције су прошле кроз депарафинацију ксиленом, градијентну хидратацију етанола, нуклеарно бојење хематоксилином, контра-бојење еозином, диференцијацију хлороводоничног алкохола, градијентну дехидратацију етанола, третман провидности ксиленом и неутралну гуму. Микроскопско посматрање фокусирано је на ћелијску морфологију, нуклеарни статус и структурни интегритет цитоплазме у региону хипокампалног зупчастог гируса.

Ниссл бојење визуализује неуронска Ниссл корпускула која одражавају биосинтетичку активност неурона и виталност ћелије. Депарафинске кришке су инкубиране у Ниссл радном раствору за бојење. Након корака прања дестилованом водом, секције су дехидриране, провидне процедуре и запечаћене. Под оптичким микроскопом уочене су хистоморфолошке варијације неурона хипокампуса.

2.7 Имунохистохемијски тест

Секције ткива хипокампуса уграђене у парафин су девоскане и хидриране. Кораци преузимања антигена, блокирања ендогене пероксидазе и блокирања неспецифичног везивања протеина су узастопно спроведени. Резови ткива су инкубирани преко ноћи на температури од 4 степена са разблаженим примарним антителима: анти-ГФАП (1:400), анти-Иба-1 (1:400), анти-НЛРП3 (1:300), анти-Цаспасе-1 (1:400). Након инкубације секундарних антитела, изведена је ДАБ хромогена реакција. Процедуре против бојења језгра, дехидрације и монтаже су завршене. Светлосни микроскоп је снимио дигиталне слике видног поља. Софтвер за обраду слике Имаге‑Ј израчунао је просечне вредности оптичке густине да би полуквантитативно проценио интензитет експресије циљног протеина.

2.8 Имунофлуоресцентно бојење

Припремљени парафински пресеци хипокампуса су доживели операцију депаравања, узимања антигена и блокирања. Примарна антитела анти‑ТЛР4 (1:400) и анти‑фосфо‑НФ‑κБ п65 (1:200) су примењена и инкубирана преко ноћи на условима од четири степена Целзијуса. Флуоресцентно обележена секундарна антитела су додата за једносатну инкубацију под статусом заштите од светлости. ДАПИ нуклеарна контра-боја је укључена у медијум за монтажу. Ласерско-флуоресцентни микроскоп је фотографисао флуоресцентне сигнале. Имаге-Ј софтвер је израчунао просечан интензитет флуоресценције који представља магнитуду активације протеина ТЛР4 и п-НФ-κБ п65.

2.9 Статистичка анализа

Оригинални експериментални подаци су обрађени помоћу СПСС 26.0 статистичког софтвера и ГрапхПад Присм 9.0 графичког програма. Сви квантитативни подаци о исходу су изражени као средња вредност ± стандардна девијација (\\(\\бар{к} \\пм с\\)). Међугрупна статистичка поређења су спроведена одговарајућим статистичким тестовима. П-вредност мања од 0,05 оцењена је као статистички значајна разлика; П< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Експериментални резултати

3.1 ЦПхГс побољшао симптом анхедоније и вратио ниво моноаминских неуротрансмитера

Пре почетка ЦУМС моделирања, основне стопе преференције сахарозе нису показале очигледну статистичку варијацију у свим експерименталним животињским кохортама. Након четворонедељног ЦУМС стреса плус четворонедељних циклуса интервенције, група ЦУМС модела је показала изразито смањен однос преференције сахарозе у односу на контролне животиње без стреса (П< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

У поређењу са кохортом модела Мод, групе третмана са високим, средњим и ниским дозама ЦПхГс, као и флуоксетин позитивна група су генерисале значајно повећање процента преференције сахарозе, серумског 5‑ХТ, серумског ДА, хипокампалног 5‑ДА и садржаја хипокампалног садржаја< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 ЦПхГс побољшана истраживачка активност у тесту отвореног поља

У процени понашања на отвореном пољу, мишеви ЦУМС модела су показали значајно смањење укупне удаљености кретања, времена боравка у централној зони и учесталости уласка у централни регион у односу на контролне мишеве (П< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 ЦПхГс скраћено време непокретности у парадигмама понашања заснованим на очајању

Тест овјеса репа и тест присилног пливања откривају очај у понашању, што представља кључна очитања понашања налик депресивном. Група Мод је показала драстично продужено време непокретности и у ТСТ и ФСТ (П< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 ЦПхГс смањују прекомерно изражене проинфламаторне цитокине хипокампуса

Концентрације проинфламаторних цитокина хипокампуса (ТНФ‑, ИЛ‑1, ИЛ‑18, ИЛ‑6, ИФН‑) код животиња ЦУМС модела су биле драстично повишене у поређењу са контролним панданима (П< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3.5 Биомаркери инфламаторног медијатора хипокампуса регулисани наниже ЦПхГс

Хипокампални инфламаторни медијатори иНОС, ЦОКС‑2 и ПГЕ2 код мишева ЦУМС модела значајно су порасли (П< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 ЦПхГс ослабљена патолошка повреда неурона хипокампуса изазвана ЦУМС-ом

Резултати бојења ХЕ: неурони хипокампалног зупчастог гируса из Мод групе су показали тешке патолошке лезије: поремећен ћелијски распоред, пикноза језгра, цитоплазматска вакуолна дегенерација, манифестујући изражено оштећење неурона. ЦПхГс‑Л група је показала само тривијалан ефекат побољшања. Средње дозе и високе дозе ЦПхГ очигледно су поништиле такве патолошке промене; група са високим дозама ЦПхГс‑Х показала је супериорни ефекат заштите неурона у поређењу са групом са флуоксетином у делимичним видним пољима.

Исходи бојења по Ниссл-у: Хипокампални неурони мод-групе су показали неорганизован распоред, упадљиво смањење количине Ниссл-ових ћелија, што је одражавало оштећену синтетичку функцију неурона и ниску виталност ћелије. Примена ЦПхГ-а је дозно-зависно обновила обиље Ниссл-тела. Морфологија неурона и густина Ниссл-телешаца унутар ЦПхГс-Х групе приближиле су се нормалном нивоу контролне групе. Хистопатолошки налази су потврдили да ЦПхГ штити интегритет хипокампалног неурона од уништавања изазваног хроничним стресом.

3.7 ЦПхГс регулисан статус активације хипокампалне глијалне ћелије

ГФАП је специфичан биомаркер за популацију астроцита. У поређењу са Цон групом, интензитет позитивног сигнала ГФАП хипокампалне групе Мод-групе је значајно опао (П< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Иба-1 протеински маркер представља микроглију. Група модела ЦУМС показала је драматично повећан Иба-1 сигнал позитивне експресије (П< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 ЦПхГс инхибирао експресију протеина повезану са хипокампалним НЛРП3‑инфламазомом

Имунохистохемијска детекција је показала да је експресија НЛРП3 и каспазе-1 протеина унутар хипокампуса групе Мод-групе била значајно повећана (П< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 ЦПхГс потиснута прекомерна активација ТЛР4/НФ‑κБ сигналног пута

Детекција имунофлуоресценције је показала да мишеви ЦУМС-модела показују значајно повећан интензитет флуоресценције ТЛР4 рецептора и фосфорилисане НФ-κБ п65 подјединице (П< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Дискусија

Велики депресивни поремећај представља тешку неуропсихијатријску болест. Последњих година, неуроинфламаторна теорија депресије привукла је широку истраживачку пажњу. Хронични поновљени психолошки стрес може изазвати активацију урођеног имуног система унутар централног нервног система. Хипокампус, један регион мозга који је веома рањив на увреде стреса, уско је повезан са модулацијом расположења, обрадом награда и функцијом памћења. Под трајном стресном стимулацијом, хомеостаза глијалних ћелија хипокампуса пада. Хиперактивирана микроглија и оштећени астроцити луче велике количине проинфламаторних цитокина, што доводи до повреде структуре неурона, метаболичког поремећаја моноамин-неуротрансмитера, што на крају промовише појаву понашања налик депресији.

Традиционални активни природни производи добијени из биљне медицине поседују вишециљне фармаколошке предности, постајући обећавајући ресурси кандидата за откривање антидепресивних лекова. ЦПхГ су препознатљиве биоактивне компоненте изоловане изЦистанцхелековито биље. Ово истраживање је конструисало ЦУМС-индуковану хроничну стресну депресију код миша, свеобухватно потврђујући ин-виво ефикасност ЦПхГ-ова са градијентом дозе налик антидепресивима. Експериментални резултати у понашању показали су да је третман ЦПхГс значајно побољшао симптом анхедоније, побољшао истраживачку активност и смањио време непокретности у вези са очајем код мишева модела депресије, показујући јасну корелацију дозе и ефекта.

Хипотеза моноаминског неуротрансмитера је класична теорија о депресији и патогенези. Серотонин и допамин преузимају кључне регулаторне улоге које покривају емоционалну стабилизацију, перцепцију повратних информација о награди и модулацију понашања у вези са мотивацијом. ЦУМС стрес је довео до очигледног пада концентрација 5‑ХТ и ДА у серуму и хипокампалном ткиву код наших моделних животиња. Интервенција ЦПхГ-а је ефикасно обновила ова два нивоа моноаминских неуротрансмитера. Овај исход је у складу са раније објављеним истраживачким извештајима у вези саЦистанцхеекстракти који модулирају мождане моноаминске неуротрансмитере.

Даље тестирање биохемијских биомаркера открило је да ЦУМС изазива снажно повећање вишеструких проинфламаторних цитокина (ТНФ‑, ИЛ‑1, ИЛ‑18, ИЛ‑6, ИФН‑) плус инфламаторних медијатора ткива (иНОС2, ЦОКС‑цам) унутар хиппокама. Интервенција ЦПхГ-а значајно је преокренула такав статус прекомерне експресије упале. Хистопатолошко ХЕ и Ниссл бојење интуитивно су доказали да ЦПхГ ублажавају оштећење хипокампалног неурона изазвано стресом и штите морфолошки интегритет неурона.

Популације глија ћелија служе као централни учесници који посредују у неуро-инфламаторним одговорима. Астроцити одржавају рециклирање неуротрансмитера, структурну стабилност крвно-мождане баријере и снабдевање неурона исхраном. Микроглија функционише као резидентне ефекторске ћелије урођеног имунитета унутар можданог паренхима. Хронични стрес изазива губитак астроцита или функционалну неспособност, уз патолошку хиперактивацију микроглије. Наши имунохистохемијски подаци су показали да је третман ЦПхГс повећао густину ГФАП-позитивних астроцита, у међувремену смањио Иба-1-означену количину прекомерно активиране микроглије у хипокампусу. Ово регулаторно својство фенотипа глија ћелија може делимично да лежи у основи неурозаштитне и фармаколошке моћи ЦПхГ-а против депресије.

НЛРП3 инфламазом представља виталну молекуларну платформу која посредује неуро-инфламаторну каскаду. Његова активација покреће сазревање и лучење низводних ИЛ-1 и ИЛ-18 проинфламаторних цитокина. ТЛР4/НФ-κБ сигнална оса делује као есенцијални узводни примарни сигнал за активацију инфламасома НЛРП3. Стимулација ТЛР4 рецептора промовише фосфорилацију НФ-κБ подјединице и нуклеарну транслокацију, даље транс-активира транскрипцију НЛРП3, про‑ИЛ-1 гена. У нашој садашњој студији, ЦУМС стрес је покренуо истовремено побољшање експресије протеина ТЛР4, фосфорилисаног НФ-κБ п65, НЛРП3 и каспазе-1. Интервенција ЦПхГ-а изразито је инхибирала активацију ове целе сигналне каскаде. Стога закључујемо да ЦПхГ делимично ублажава неуро-инфламаторну повреду ограничавањем ТЛР4/НФ-κБ-посредоване активације инфламазома НЛРП3.

Узети заједно, експериментални докази нашег животињског модела подржавају механистички модел: ЦПхГ стварају ефекте сличне антидепресивима код депресивних мишева изазваних ЦУМС-ом кроз две примарне димензије: (1) обнављање хомеостазе моноаминских неуротрансмитера повезаних са расположењем (5‑ХТ, ДА); (2) модулација хомеостазе хипокампалне глијалне ћелије и сузбијање неуроинфламаторне патолошке каскаде зависне од ТЛР4/НФ-κБ НЛРП3 зависне од инфламазома.

Неколико ограничења ове истраге заслужују разматрање. Овај рад је искључиво имплементирао експерименте ин виво на нивоу животиња. Нисмо спровели механичку валидацију на нивоу ћелије нити клиничка испитивања на људима. Према томе, транслациони закључак према терапији људске депресије треба да остане опрезан. Осим тога, ово истраживање није анализирало доприносе појединачних мономерних једињења (ехинакозид, вербаскозид) у мешаном екстракту ЦПхГс. Будућа истраживања могу се концентрисати на механичку верификацију ћелијске културе, поређење активности појединачних компоненти, као и на прелиминарно пилот посматрање човека и субјекта.

5. Закључак

Цистанцхе фенилетанол гликозиди (ЦПхГ) производе значајна фармаколошка дејства налик антидепресивима против хроничних непредвидивих фенотипова понашања налик депресији изазваних благим стресом код Ц57БЛ/6 мишева. Његови терапијски повезани механизми су повезани са опоравком серумских и хипокампалних нивоа серотонина и неуротрансмитера допамина, очувањем интегритета неуронске структуре хипокампуса, модулацијом функционалне равнотеже астроцита-микроглије, као и супресијом ТЛР4/НФ-НФ-ЛРП-ома у медијуму ТЛР4/НФ-НРПκБ. неуро-инфламаторна патолошка каскада. Ова претклиничка студија на животињама даје експерименталну референцу за даљи развој ЦПхГ-а као природне терапеутске помоћне супстанце или функционалног састојка хране који циља на побољшање симптома депресије.

Референце

Рен Л, Схао ИТ, Кин СХ. Студија о идентификацији циља и ефекту сапонина А на депресивни поремећај. Нат Прод Рес Дев, 2024, 36:44‑51.

Фан Л, Пенг И, Ванг ЈВ, ет ал. Укупни гликозиди из стабљика Цистанцхе тубулоса ублажавају понашања налик депресији: двосмерна интеракција фитокемикалија и цревне микробиоте. Фитомедицина, 2021, 83:153471.

Фан Л, Пенг И, Цхен КСН, ет ал. Интегрисана анализа фитокемијског састава, фармакокинетике и мрежне фармакологије за испитивање разлика између стабљика Цистанцхе десертицола и Ц. тубулоса на основу антидепресивне активности. Храна и функција, 2022, 13:8542‑8557.

Иирмииа Р, Риммерман Н, Ресхеф Р. Депресија као микроглијална болест. Трендс ин Неуросциенцес, 2015, 38:637‑658.

Јиа КСН, Гао ЗХ, Ху ХЛ. Микроглија у депресији: тренутне перспективе. Сциенце Цхина-Лифе Сциенцес, 2021, 64:911-925.

Ву Б, Ган АН, Ванг РКС, ет ал. Алпиниа окипхилла Мик. испарљиво уље побољшава депресивно понашање и инхибира неуроинфламацију код мишева изложених ЦУМС-у тако што инхибира сигнални пут МиД88/НФ‑κБ посредован ТЛР4. Јоурнал оф Цхемицал Неуроанатоми, 2023, 130:102270.