Нови екран за регулаторе експресије теломерног протеина ТРФ2 идентификованих малих молекула који ометају имуносупресију и раст тумора зависну од ТРФ2

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Једноставан резиме:Теломерни протеин ТРФ2 (теломерни фактор везивања понављања 2) је појачан код канцера код људи и повезан је са лошом прогнозом. Онкогена својства ТРФ2 се ослањају на његову интринзичну заштитну улогу теломера, али и на ћелијске екстринзичне ефекте кроз имуносупресивне и ангиогене активности. Стога се циљање ТРФ2 појављује као обећавајућа терапијска стратегија против рака. У овој студији развили смо метод заснован на ћелијама за скрининг ТРФ2 инхибитора који нам омогућава да идентификујемо два једињења која отупљују проонкогена својства ТРФ2 ин виво.

Апстракт: Теломерни фактор везивања понављања 2 (ТРИФ2) је подјединица комплекса протеина схелтерина, која се везује за теломере и штити их од нежељене активације ДНК оштећења (ДДР). Експресија ТРФ2 игра кључну улогу у старењу и канцеру, јер је смањена током ћелијског старења и прекомерно експримирана током онкогенезе. Ракови који прекомерно експримирају ТРФ2 често показују лошу прогнозу. У ћелијама рака, ТРФ2 игра вишеструке функције, укључујући заштиту теломера и нећелијске аутономне улоге, промовишући нео-ангиогенезу и имуносупресију.пуритански витамин цОвде представљамо оригиналну стратегију скрининга, која омогућава идентификацију малих молекула који смањују или повећавају експресију ТРФ2. Прегледом мале библиотеке лекова које је одобрила Агенција за храну и лекове (ФДА), идентификовали смо два молекула (АР-А014418 и алексидин-2ХЦл) који су пореметили раст тумора, нео-ангиогенезу и имуносупресију тако што су смањили експресију ТРФ2 код миша. модел ксенографта. Ови резултати подржавају хемотерапеутску стратегију смањења експресије ТРФ2 за лечење агресивних хуманих тумора и валидацију овог теста заснованог на ћелијама способног за скрининг за потенцијалне молекуле против рака и против старења модулацијом нивоа експресије ТРФ2.

Кључне речи:ТРФ2; рак; старење; тест скрининга заснован на ћелијама; нео-ангиогенеза; супресија имунитета

Кликните овде да бисте сазнали више

1. Представљање

Теломери су специјализоване нуклеопротеинске структуре које се налазе на крајевима линеарних хромозома које су регулисане факторима повезаним са теломером као што су теломераза, комплекси протеина схелтерина и некодирајућа РНК која садржи теломерно понављање [1]. Када су правилно регулисани, теломери штите хромозоме од нестабилности и старења. Скраћивање теломерне ДНК јавља се као део програмираног физиолошког развоја и старења [2]. Међутим, прекомерно скраћивање ДНК теломера изазива ретке прогероидне синдроме, као што је дискератоза цонгенита [3]. Штавише, дисрегулисана стања теломера су умешана у бројне болести које су уобичајене у општој популацији, укључујући скоро све врсте рака и неколико дегенеративних болести [4]. Стога, развој фармаколошких третмана за циљање специфичних компоненти теломера обећава за спречавање и лечење таквих болести.

Што се теломера и рака тиче, контролне тачке одговора на оштећење виталне ДНК (ДДР) понекад не успевају; ово може довести до прекомерног скраћивања теломерне ДНК и аберантног преуређивања хромозома, што заузврат може допринети онкогенези. Штавише, повећање теломеразе је кључни догађај у развоју око 90 процената свих карцинома, јер то може дати неограничен раст ћелијама рака [5]. Из тог разлога, инхибиција теломеразе је била мета неколико студија које су покушавале да развију третмане рака [6]. Упркос недавном напретку, постоје нека ограничења у клиничкој употреби лекова против теломеразе. На пример, да би се зауставила пролиферација ћелија рака, мора се постићи критично кратка дужина теломерне ДНК, а антионкогени ефекти скраћених теломера се губе у одсуству гена за супресор тумора п53 [7,8]. Овај период кашњења смањује терапијску ефикасност и повећава нежељене ефекте про-старења ограничавајући обнављање ћелија и фаворизујући активацију алтернативних механизама елонгације теломера заснованих на рекомбинацији [9,10].систанцхеСтога, стратегије против теломеразе могу бити погодније за циљање ћелија рака које већ имају критично кратке теломере [11].

Поред теломеразе, промене у експресији и активности подјединица схелтерин комплекса (ТРФ1,ТРФ2,РАП1,ТИН2,ТПП1 и ПОТ1) су укључене у туморигенезу, ау неким случајевима независно од дужине теломера [12-16]. Стога би циљање склоништа за лечење рака могло бити занимљива алтернатива интервенцијама против теломеразе. Подјединица шел-терина ТРФ2 представља занимљивог кандидата; ТРФ2 је прекомерно експримиран у неколико хуманих малигнитета, како у ћелијама рака тако иу васкуларним ћелијама и то је типично повезано са лошом прогнозом [17-20]. Посебно, прекомерна експресија ТРФ2 може аутономно да подстакне туморигенезу нећелијску, што доводи до имуносупресије и нео-ангиогенезе[13,18-20]Нарочито, појачана регулација ТРФ2 ствара снажно имуносупресивно микроокружење. Променом експресије протеогликана хепаран сулфата, ТРФ2 директно регрутује и активира супресивне ћелије изведене из мијелоида (МДСЦ) кроз ТЛР2 пут [21]. Док прекомерна експресија ТРФ2 у ћелијама рака снажно инхибира регрутовање НК ћелија у микроокружењу тумора регулацијом синтезе ХСПГ[13], ТЛР2 активација МДСЦ изазвана прекомерном експресијом ТРФ2 доводи до снажне инхибиције имунонадзора НК ћелија са снажним смањењем. дегранулације НК ћелија, производње и убијања ИФНгама [21].шта је цистанчеПрема томе, прекомерна експресија ТРФ2 снажно отупљује рану фазу антитуморског имунонадзора тако што директно инхибира регрутовање НК ћелија и индиректно функционалност НК ћелија кроз обликовање МДСЦ-зависног имуносупресивног микроокружења. Сходно томе, циљање на ТРФ2 код карцинома може бити вредна стратегија са вишеструким погоцима путем ћелијских аутономних и нећелијских аутономних процеса промовисањем старења, као и нарушавањем нео-ангиогенезе и имунолошког бекства.

цистанцхе може против старења

До данас, сва идентификована мала једињења која циљају на ТРФ2 нарушавају његову способност да заштите крајеве хромозома од ДДР-а, што има потенцијалне нежељене ефекте против старења [22]. Наш претходни рад је показао да делимична редукција експресије ТРФ2 може да преокрене туморигеност код модела миша кроз нећелијске аутономне ефекте, без изазивања ДДР-а [13]. Стога смо закључили да би фокусирање на смањење вишка ТРФ2 код карцинома који је резултат његове прекомерне експресије могла бити занимљива стратегија за лечење рака без нежељених ефеката који промовишу старење. У овој студији представљамо оригиналну платформу за скрининг за идентификацију малих једињења које циљају на стабилност ТРФ2. Показали смо да су два главна поготка инхибирала туморигену активност прекомерне експресије ТРФ2. Ова студија је показала да експресија ТРФ2 може бити фармаколошки модулисана и да је наш скрининг тест поуздан метод за одабир лекова способних да модулишу нивое експресије ТРФ2, са потенцијалним својствима против рака и старења.

2. Материјали и методе 2.1. Ћелије

Људски ембрионални бубрег (ХЕК)293-Т ћелије (АТЦЦ ЦРЛ-1573) и ћелије БЈ-ХЕЛТрас[13] су узгајане у Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (ДМЕМ) (Лонза, Леваллоис Перрет, Француска) са додатком 10 посто феталног телећег серума (ФЦС), 100 ИУ/мЛ пеницилина и 100 уг/мЛ стрептомицина (Инвитроген, Церги Понтоисе, Француска).

2.2.СДС-ПАГЕ и Вестерн блоттинг

Укупни ћелијски лизати су припремљени, раздвојени електрофорезом и блотирани као што је претходно описано [14]. Укратко, ћелије су сакупљене и лизиране у пуферу за лизу (8,76 г/Л НаЦл 10 мМ Трис-ХЦЛ пХ7,2, 0,1 проценат СДС,0,1 проценат Тритон Кс -100,10 г/Л натријум деоксихолата, 5 мМ етилендиаминтетрасирћетне киселине (ЕДТА), 1{{50}} уг/мЛ леупептина, 1 мМ АЕБСФ и 19 уг/мЛ апротинин). Узорци су затим титрирани коришћењем комплета за анализу БЦА протеина (Интерцхим, Монлуцон, Француска). Узорци (60 уг/трака) су загревани на 95 степени током 5 минута у пуферу за пуњење (500 мМ Трис-ХЦл, 100 мМ ДТИ, 2 процента СДС, 0,1 процента бромофенол плава, 10 процената глицерол пХ 6,8). Затим су узорци напуњени на 10% полиакриламидних гелова и пуштени у рад 45 минута на 160 В. Протеини су затим пребачени на Иммобилон-ФЛ мембране (Миллипоре, савезна држава Њујорк, САД) коришћењем Транс-Блот СД полу-суве електрофоретске ћелије за пренос (Био- Рад, Херкулес, Калифорнија, САД). Мембране су блокиране 1 х у пуферу за блокирање интерцепта (ЛИ ЦОР, Линколн, НЕ, САД) пре инкубације преко ноћи на 4 степена са мешавином примарних антитела (моуселгГл анти-ТРФ2 разблажен у 1: 250; и зечји ИгГанти-Бета-актин разблажен у 1:10,000) у интерцепт Блоцкинг пуферу који садржи 0,5 процената Твеен20. Након испирања у ПБС 0,1% Твеен20, мембране су инкубиране 1 х на собној температури у Интерцепт блокирајућем пуферу који садржи 0,25% Твеен20 са мешавином секундарних антитела: козји-анти-миш ИРДие 680 за анти-ТРФ2 антитело и козји анти-зечји ИРДие 800ЦВ за антитело на бета-актин (1:15, 000 разблаживање).Цистанцхе против старењаПримарна и ИРДие секундарна антитела која су коришћена наведена су испод у табели антитела (Табела 1). Коначно, протеинске траке су визуелизоване коришћењем ЛиЦор Одиссеи 9120 система за снимање (ЛИ-ЦОР). Експресија ТРФ2 је измерена нормализовањем интензитета ТРФ2 траке на интензитет актинске траке и позадине.

2.3.Стратегија клонирања

Хумана ТРФ2 цДНК секвенца је клонирана између БамХИ/БцлИ рестрикционих места лентивирусног СФФВ-ГПР плазмида који је дериват ХИВ-СФФВ-ГФП-ВПРЕ [23]. СФФВ-ГПР плазмид садржи промотор вируса који формира фокус слезине (СФВ) који контролише полицистронски ген ГПР који садржи цДНК секвенце за зелени флуоресцентни протеин (ГФП), протеин резистенције на пуромицин и Таг-црвени флуоресцентни протеин (РФП)-Т (С158Т мутирани Таг -РФП), свака одвојена секвенцама Е2 и Т2 Пицорнавиридае. хТРФ2 цДНК је уметнута у Ц-терминални регион РФП-Т, да би се омогућила експресија РФП-ТРФ2 фузионог протеина.

2.4. Производња Лентивируса

За производњу лентивируса, 5 × 10* ХЕК 293-Т ћелије су трансфектоване са 8,6 уг празног СФФВ-ГПР или РФП-ТРФ2-који експримује СФФВ-ГПР вектор, 8,6 уг Ленти -Делта 8,91 и 2,8 уг ВСВ-г преко трансфекције посредоване калцијум фосфатом. Трансфектоване ћелије су култивисане у ДМЕМ са додатком 10 процената ФЦС на 37 степени са 5 процената ЦО2 у посудама од 10- цм. Супернатанти који садрже новоконструисане вирусе су сакупљени након 48 х, а затим су пропуштени кроз 0.45- μм Миллипоре филтер. Након титрације вируса, однос 1∶1 (вирус∶ћелија) је коришћен за инфицирање ћелијске линије БЈ-ХЕЛТрас, изабране због њене отпорности на ТРФ2 дефекте[13].цистанцхе бенефициосКлон који је експримирао ГФП и фузионисани РФП-ТРФ2 протеин до умерених нивоа је затим изолован флуоресцентно активираним сортирањем ћелија (ФАЦС).

2.5. Скрининг проточном цитометријом

Ћелије клонске линије БЈ-ХЕЛТрас које садрже СФФВ-ГПР вектор и експримирају РФП-ТРФ2 фузиони протеин су култивисане у 96-плочама у ДМЕМ медијуму са додатком 10 процента ФЦС и 1 процента пеницилина/стрептомицина. После 24 х третмана лековима, ћелије су затим трипсинизоване и испране у физиолошком раствору пуферованом фосфатом (ПБС) који садржи 0.5 мМ ЕДТА и 2 процента ФЦС пре фиксирања са 0,5 процената формалдехида (ФА). Фиксиране ћелије су затим подвргнуте за проточну цитометрију користећи ФацсЦалибур високопропусни узоркивач (БД Биосциенцес, Франклин Лакес, Њ, САД).

2.6. Квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену (РТ-кПЦР)

Укупна РНК је изолована коришћењем РНеаси Мини Кит (Киаген, Венло, Холандија). Реверзна транскрипција је изведена коришћењем Суперсцрипт ИИ реверзне транскриптазе (Инвитроген) са 1 уг укупне РНК. Експресија сваког гена је нормализована на ону ГАПДХ. Коришћени су следећи прајмери: хТРФ2 Фв 5'-ГЦТГЦЦТГАЦТИГААЦАГТ-3';хТРФ2 Рв 5'-ЦЦГТТЦТЦААЦЦААЦЦЦЦТЦ-3';хГАПДХФв5'-АГЦЦАЦАТЦГЦТЦАГАЦАЦ-3'хГАПЦАЦЦАЦЦ Рв 14}}. 2.7.АламарБлуе

У 96-плочи са равним дном бунара, 5 × 103 ћелије по бунарчићу је засејано у 200 уЛ ДМЕМ суплемента са 10 процената ФЦС. 24 х након третмана леком, додато је 10 уЛ АламарБлуе (Био-Рад) и мерена је апсорпција на 570 нм и 600 нм током 36 х у Спецтростар Нано читачу плоча (БМГЛабтецх, Ортенберг, Немачка). Проценат оксидације-редукције АламарБлуе-а је одређен како је описано од стране произвођача.

2.8.Животиње

Експерименти су изведени на 8- до 12-недељним НМРИ голим женкама мишева из Јанвиер Лабс (Француска). Сви експерименти на мишевима су спроведени у складу са локалним и међународним институционалним смерницама и одобрени су од стране Комитета за бригу о животињама ИРЦАН-а и регионалног (ЦИЕПАЛ Цоте д'Азур #187 и #188) и националног (Француско Министарство за истраживање #03482.01/02482.2 и #02973.01/02973.2) власти.

2.9. Експерименти раста тумора

Сваки НМРИ голи миш је убризган субкутано у леђа са 1 к 106 БЈ-ХЕЛТрас ћелија суспендованих у 100 μЛ ПБС (н=8 мишева по групи). Мишеви су третирани 16., 18., 20. и 22. дана интраперитонеалним ињекцијама од 100 уЛ ДМСО (45 процената), алексидин-2ХЦл (1 мг/кг) или АР-А014418 (5 мг/кг), затим праћено до 26. дана. Изглед тумора је процењиван палпацијом сваког дана. Величина тумора је мерена сваких 2-3 дана помоћу калипера. Запремина тумора је затим одређена коришћењем хемиелипсоидне формуле: π×(Л×1× х)/6, где Л одговара дужини, И ширини и х висини тумора, респективно.

2.10. Матригел тестови утикача

БЈ-ХЕЛТрас ћелије су третиране ДМСО (1 проценат), алексидин-2ХЦл (1 уМ) или АР-А014418 (10 μМ) током 2 дана. Затим је 100 μЛ ћелија третираних 1 × 10 степени суспендованих у ПБС-у заједно са 400 уЛ Матригела са смањеним фактором раста (Цорнинг, Њујорк, САД) инокулисано супкутано у леђа НМРИ голих мишева под анестезијом изофлураном. Петог дана након инокулације, Матригел чепови су сакупљени, а инфилтрирајуће ћелије су сакупљене ензимском дисоцијацијом путем диспазе (Цорнинг), колагеназе А (Роцхе, Бале, Швајцарска) и ДНАсеИ (Роцхе) дигестије током 30 минута на 37 степени [13]. ]. Ћелије су засићене 15 минута на леду са Фе-Блоцк анти-ЦД16/ЦД32 антителима (клон 2.4Г2) пре бојења спојеним антителима током 30 минута на 4 степена. Коњугована антитела која се користе наведена су у табели антитела. Ћелије су испране у ПБС са 0,5 мМ ЕДТА, 2 процента ФЦС и фиксиране са 0,5 процента ФА. Обојене ћелије су анализиране коришћењем АРИА ИИИ цитометра са софтвером ДИВА6 (БД Биосциенцес) и ФловЈо 10 (ЛЛЦ).

2.11.Статистика

Сви графикони и статистичке анализе су направљени коришћењем софтвера ГрапхПад Присм (Сан Дијего, Калифорнија, САД). Сви резултати су представљени као средња вредност ± стандардна девијација (сд) или средња вредност ± стандардна грешка средње вредности (СЕМ). Значајне разлике између средњих вредности утврђене су коришћењем Манн-Вхитнеи теста са две стране. Лог-ранк (Мантел-Цок) тест је коришћен за одређивање броја тумора. За сваки тест, стр<0.05 was="" considered="" statistically="">

3.Резултати

3.1. Идентификација ТРФ2 инхибиторних молекула

Да бисмо прегледали лекове који могу да модулишу нивое протеина ТРФ2, користили смо лентивирусни систем за ко-транскрипцију ГФП гена и РФП спојеног на Н-терминус ТРФ2. Пратећи општу стратегију описану на другом месту [23], конструисали смо ГРТ лентивирус, у коме је СФФВ промотер контролисао експресију поли-цистронског гена који кодира ГФП, протеин отпорности на пуромицин и РФП-ТРФ2 или РФП само као контролу (Слика 1А). Сходно томе, све трансдуковане ћелије су експримовале и ГФП и РФП-ТРФ2. Овај систем је дизајниран да идентификује лекове који модулирају експресију ТРФ2, мерењем интензитета РФП помоћу проточне цитометрије, док ГФП интензитет служи као интерна контрола за транскрипцију репортерске конструкције.

Трансдуцирали смо ГРТ лентивирусе у хумане БЈ-ХЕЛТрас фибробласте који су овековечени помоћу СВ40 и хТЕРТ и учињени онкогеним помоћу Рас в12[13]. Да би се олакшала мерења регулације ТРФ2 навише и наниже, клон отпоран на пуромицин који је умерено експримирао и ГФП и РФП-ТРФ2 протеине изолован је коришћењем ФАЦС сортирања и назван ГРИ-БЈ-ХЕЛТрас (слика 1А). Као позитивну контролу, третирали смо ГРТ-БЈ-ХЕЛТрас ћелије са 10 уМ гемцитабином, претходно описаним модулатором стабилности ТРФ2 [24], током 24 сата. Иако није откривена РФП модулација у ћелијама трансдукованим празним вектором, примећено је значајно смањење односа РФП/ГФП средњег интензитета флуоресценције (МФИ) у ГРТ-БЈ-ХЕЛТрас ћелијама третираним гемцитабином у поређењу са контролом третираном ДМСО (82 процента контроле; стр<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Користећи проточну цитометрију, затим смо прегледали 396 фармаколошких једињења које је одобрила Управа за храну и лекове (ФДА) способна да циљају шест главних категорија биолошких процеса: јонски канали, фосфатазе, киназе, епигенетски фактори, лиганди нуклеарних рецептора и Внт пут (Слика С1Ц ).ГРТ-БЈ-ХЕЛТрас ћелије су прво третиране са 10 уМ сваког од 396 једињења или ДМСО током 24 сата пре анализе проточном цитометријом (слика С1Д). У овом случају, утврђено је да 84 једињења модулирају нивое протеина ТРФ2 (Слика С1Д, десни панел; Табела С1), и коришћена су за секундарни екран (Слика С1Е; Табела С1). У овом секундарном прегледу, поред третмана ГРТ-БЈ-ХЕЛТрас ћелија са 10 уМ одабраних једињења, нетрансдуковане БЈ-ХЕЛТрас ћелије или БЈ-ХЕЛТрас ћелије трансдуковане празним вектором третиране су на сличан начин како би се одбацили лажни позитивни резултати који емитују црвену боју. или зелена аутофлуоресценција или утиче на РФП или ГФП протеине. Затим је одабрано 18 најбољих једињења да би се утврдила њихова способност да модулишу експресију ендогеног ТРФ2 у нетрансдукованим БЈ-ХЕЛТрас ћелијама, на основу Вестерн блотинга (Слика С2А, Б Табела С1). Дефинисали смо поготке као једињења која модулирају за најмање 20 процената дозе ТРФ2 (било навише или наниже). Користећи ове критеријуме, од 18 лекова процењених Вестерн блот-ом, њих 9 је смањило, а један повећао нивое ендогеног ТРФ2 протеина (Слика С2А, Табела С1) Затим смо одлучили да изаберемо два једињења међу овим лековима за ин виво експерименте како бисмо утврдили да ли могу супротставити проонкогеним ефектима прекомерне експресије ТРФ2. Да бисмо избегли активацију ДДР-а и нежељене ефекте у не-тумогеним ћелијама, одабрали смо једињења која нису редуковала ни на највише ни на најниже дозе ТРФ2. Међу њима, АР и АД су одговарали тим критеријумима. Оба једињења су смањила РФП-ТРФ2 у ГРТ-БЈ-ХЕЛТрас ћелијама анализирано проточном цитометријом (Слика 1Ц), нивое ендогеног ТРФ2 протеина као што је приказано Вестерн блоттинг анализом (Слика 1Д; Слика С2А, Б) и нивое ТЕРФ2 мРНА како је одређено преко РТ -кПЦР (слика 1Е). Штавише, третман са одговарајућим концентрацијама ЛД50 АР и АД смањио је експресију мРНА ТЕРФ2 у БЈ-ХЕЛТрас ћелијама и у ТРФ2-која прекомерно експресирају БЈ-ХЕЛТрас ћелије (слика С3А-Ц).

3.2.АР-А014418 и Алексидин-2ХЦл су преокренули туморигеност коју дају високи нивои експресије ТРФ2

Затим смо проценили утицај АР и АД на раст тумора. Да бисмо контролисали њихову способност да циљају карциноме са прекомерном експресијом ТРФ2-, анализирали смо потенцијалне антитумогене ефекте АР и АД на стандардне БЈ-ХЕЛТрас ћелије и ТРФ2-ћелије са прекомерном експресијом БЈ-ХЕЛТрас. БЈ-ХЕЛТрас ћелије су трансдуциране са ТРФ2лентивирусним вектором или празним вектором, а затим су убризгане супкутано голим мишевима. Мишеви су затим третирани са ДМСО, 1 мг/кг АД или 5 мг/кг АР у данима 16, 18, 20 и 22 након ињекције [26, 27] (Слика 2А). Као што је раније објављено [13,21], прекомерна експресија ТРФ2 је промовисала ини тумор. цијација и раст ин виво (Слика 2Б-Д; стр<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.АР-А014418 и Алексидин-2ХЦИ супротстављени ТРФ2-зависна имуносупресија и нео-ангиогенеза

Да бисмо утврдили да ли антитуморски ефекти АР и АД могу да циљају на нећелијска аутономна онкогена својства ТРФ2, испитали смо инфилтрацију и активацију имунолошких ћелија, као и ангиогенезу у леченим туморима. Третирали смо стандардне и ТРФ2- ћелије са прекомерном експресијом БЈ-ХЕЛТрас (слика С3А) са 1 уМ АД, 10 уМ АР или ДМСО током 48 сати пре њихове поткожне ињекције са Матригелом голим мишевима. Матригел чепови су затим сакупљени 5 дана након ињекције да би се анализирало микроокружење тумора проточном цитометријом (Слика 3А). Као што се очекивало [13,21], прекомерна експресија ТРФ2 није променила глобалну инфилтрацију имуних ћелија (ЦД45 плус ћелије) (слика 3Б; слика С4А), али је инхибирала регрутовање ћелија природног убице (НК) (слика 3Ц; слика С4Б) и НК функцију -алитет (Слика 3Ц-Е; Слика С4Ц) и повећање МДСЦ инфилтрације (Слика 3Ф). Посебно код ТРФ2-са прекомерном експресијом БЈ-ХЕЛТрас ћелија, третман са било којим од ових лекова повећао је глобалну имунолошку инфилтрацију (Слика 3Б; Слика С4А), као и количину и функционалност интратуморалних НК ћелија (Слика 3Ц-Е; Слика С4Б,Ц). Значајно је да су оба лека у потпуности спасила инхибицију имунолошког надзора посредованог НК ћелијама (ЦД107а плус и ЦД69 плус НК ћелија) изазвану прекомерном експресијом ТРФ2 (слика 3Ц). Ово је било повезано са драматичним смањењем регрутовања МДСЦ (Слика 3Ф; Слика С4Д) и са повећаним ангажовањем моноцита и макрофага (Слика 3Г).

Као што је раније објављено [14,20], ангиогенеза тумора је била већа код тумора са прекомерном експресијом ТРФ2-у поређењу са контролним туморима. Док је прекомерна експресија ТРФ2 повећала количину ЦД31 плус ЦД45-ендотелних ћелија унутар туморског слоја (Слика 3Х; Слика С4Е), није откривена разлика између празног вектора или тумора са прекомерном експресијом ТРФ2- после третмана са било којим леком. ТРФ2 (ТРФ2 вектор) или празан вектор третирани су са 1уМ алексидин-2ХЦл или 10 μМ АР-А014418 или ДМСО 2 дана пре поткожне ињекције са Матригелом (1 × 10 степени ћелија) у НМРИ голе мишеве ( н=8). Инфилтрација имунолошких и ендотелних ћелија је затим процењена 5 дана након ињекције помоћу проточне цитометрије. (БХ). Анализа проточне цитометрије имунолошке инфилтрације Матригел чепа. Приказани су бројеви имуних ћелија које се инфилтрирају у Матригел чепове међу живим ћелијама. Укупна инфилтрација имуних ћелија (ЦД45 плус ћелије) је приказана у (Б); инфилтрација ћелија природног убице (НК) (НКп46 плус ћелије) је приказана у (Ц); инфилтрација активираних НК ћелија (ЦД107а плус и ЦД69 плус НК ћелије) приказана је у (Д,Е); супресорске ћелије изведене из мијелоида (МДСЦ; ЦД11б плус ГР1 плус )) инфилтрација је приказана у (Ф); инфилтрација моноцита-макрофага је приказана у (Г), а инфилтрација ендотелних ћелија је приказана у (Х).п вредности су одређене коришћењем Манн- Витни тест (*стр<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Дискусија

Овде извештавамо о развоју теста заснованог на ћелијама за скрининг једињења која модулирају експресију теломерног протеина ТРФ2. Прегледом мале библиотеке молекула које је одобрила ФДА, идентификовали смо једињења која могу или повећати или смањити нивое експресије ТРФ2. Открили смо да АД и АР смањују ТРФ2 и показују анти-тумогену активност специфичну за туморске ћелије које прекомерно експримирају ТРФ2. Даље демонстрирање њихове ТРФ2-специфичне активности, лечење АР и АД је спасило имуносупресију и нео-ангиогенезу изазвану прекомерном експресијом ТРФ2. Запањујуће, чињеница да је глобална имунолошка инфилтрација повећана за туморе са прекомерном експресијом ТРФ2 након третмана АР или АД сугерише да су ти лекови снажнији у побољшању имунолошког одговора када је ТРФ2 прекомерно експримиран. Ови лекови инхибирају имуносупресивни ефекат прекомерне експресије ТРФ2 обнављањем функционалности НК ћелија (ЦД107а и ЦД69 плус НК ћелије) и снажно смањују инфилтрацију МДСЦ. Ово сугерише да ти лекови отупљују ТРФ{17}}специфичан програм који покреће имунолошки бекство и имуносупресију и могу да појачају ослобађање молекула повезаних са опасношћу (ДАМП) који појачавају имуни одговор посебно када је ТРФ2 прекомерно експримиран. Треба напоменути да су АР и АД спасили имуносупресивне и про-ангиогене функције прекомерне експресије ТРФ2, две карактеристике прекомерне експресије ТРФ2 које смо претходно показали као ДДР независне. Стога смо претпоставили да су ефекти АР и АД на раст тумора независни од ДДР, механизам који остаје да се у потпуности опише у даљим студијама. Ова студија доказа о концепту пружа доказе да фармаколошко смањење експресије ТРФ2 може бити вредна стратегија против рака

Иако је метода скрининга разматрала нивое протеина ТРФ2 независно од нивоа транскрипта, оба лека су смањила нивое ендогене ТЕРФ2 мРНА, што имплицира да АР и АД циљају више нивоа регулације ТРФ2. У прилог томе, АР је инхибитор Внт сигнализације [28], који је активатор ТЕРФ2 транскрипције [29]. Уопштено говорећи, лекови који циљају на сигнални пут Внт су обогаћени током корака скрининга (слика С1Б-Д). Остаје да се утврди како АД, агенс који циља на митохондрије, утиче на експресију ТРФ2. Пошто канцери који показују високе нивое ТРФ2 имају лошу прогнозу и показују повећану отпорност на хемотерапију [21], АР и АД су терапеутски агенси од интереса за такве туморе. Потенцијал да се раздвоје теломерне и проонкогене активности ТРФ2[13] подиже могућност фармаколошке регулације ТРФ2 на ниже нивое, чиме се доносе вишеструке предности против рака без штетних нуспојава против старења. Стога су будуће студије оправдане да би се утврдили синергистички ефекти ових лекова на нивое експресије ТРФ2 у клиничким студијама.

Иако је ТРФ2 појачан код различитих карцинома код људи [13,21], његова експресија је смањена током нормалног и патолошког старења многих ткива [30,31] Штавише, неколико извештаја који укључују мишје моделе дисрегулације ТРФ2 наглашавају важност ТРФ2 на раскрсница између старења и рака [31-35]. Према томе, молекули идентификовани поступком скрининга који је овде описан су интересантни кандидати за лек, и као агенси против рака за смањење ТРФ2 као што је потврђено у овој студији, и потенцијално као агенси против старења повећањем ТРФ2.

Овај чланак је преузет из Цанцерс 2021, 13, 2998. хттпс://дои.орг/10.3390/цанцерс13122998 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/цанцерс