Трансгени модел открива улогу Клотхо-а у развоју рака панкреаса и утире пут за нову терапију засновану на Клотхо-у

кликнитеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Једноставан резиме:Циљ нам је био да проучимо улогу протеина клотхо против старења и његове излучене изоформе, УК, у раку панкреаса. Три ин виво модела, укључујући нови генетски модел миша и биоинформатичке анализе, указали су на клото као на супресор тумора код дукталног аденокарцинома панкреаса и открили јединствени образац хиперметилације клото ДНК у туморима панкреаса. Ови резултати поседују значајну прогностичку вредност и даље сугеришу да она може послужити као терапеутски агенс за аденокарцином дукталног панкреаса.

Кликните овде да бисте сазнали више

Апстракт: Клотхо је трансмембрански протеин против старења, који се може излучити и може да функционише као хормон. Акумулирајући подаци указују на то да је клото супресор тумора у широком спектру малигнитета, и означавају поддомен КЛ1 као активни регион протеина за ову активност. Циљ нам је био да проучимо улогу клотоа као супресора тумора код дукталног аденокарцинома панкреаса (ПДАЦ). Биоинформатичке анализе скупова података Атласа генома рака (ТЦГА) откриле су корелацију између преживљавања пацијената са ПДАЦ, нивоа клото експресије и метилације ДНК, и демонстрирала јединствени образац хиперметилације клотоа у туморима панкреаса. Ин виво ефекти клотоа и КЛ1 испитани су коришћењем три модела миша. Користећи нови генетски модел, комбинујући нокдаун панкреаса клото са мутацијом у Красу, недостатак клотоа је допринео ПДАЦ генерацији и смањеном преживљавању мишева. У моделу ксенотрансплантата, примена вирусних честица које носе ски, спојене клото изоформе која садржи КЛ1 домен, инхибирала је туморе панкреаса.купити цистанцхеНајзад, третман растворљивим небом продужио је преживљавање Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус ; Трп53Р172Х/ плус (КПЦ) мишеви, познато је да модел рекапитулира људски ПДАЦ.биофлавоноиди,У закључку, ова студија пружа доказе да је клото супресор тумора у ПДАЦ-у. Штавише, ови подаци сугеришу да би нивои клото експресије и метилације ДНК могли имати прогностичку вредност код пацијената са ПДАЦ, и да примена егзогеног сКЛ може послужити као нова терапијска стратегија за лечење ПДАЦ.

Кључне речи:клотхо; КЛ1; сКЛ; тумор супресор; канцер панкреаса; ПДАЦ

1. Представљање

Рак панкреаса је међу најагресивнијим карциномима, са 5-годишњом стопом преживљавања од 9 процената. Инциденција и морталитет расту, са 60.430 нових случајева и 48.220 смртних случајева који се очекују само у САД-у 2021. Дуктални аденокарцином панкреаса (ПДАЦ) представља 85-90 процената свих малигних неоплазми панкреаса. Садашњи модели указују на његов развој од бенигне интраепителне неоплазије панкреаса (ПанлН)1-3 до инвазивног карцинома, заједно са стицањем генетских мутација. Активација Краса се сматра првим кораком ка малигному [2], а на моделима мишева доводи до развоја ПанИН-а за 9 месеци [3]. Иако је очигледна ПДАЦ код ових мишева ретка, у моделу КПЦ, комбинујући Крас мутацију са губитком туморског супресора п53 [4], ПДАЦ се обично развија до 3-6 месеци старости [5].

Цистанцхе може против старења

Клото (овде се користи као клото) је трансмембрански протеин типа И који је укључен у регулацију старења [6]. Код мишева, недостатак клотоа доводи до синдрома који подсећа на убрзано старење, док прекомерна експресија клото продужава животни век [7,8]. Клото екстрацелуларни регион се састоји од два хомологна домена, КЛ1 и КЛ2, који се могу одвојити од мембране и деловати као циркулишући хормони [9-11]. Секретује се друга, различито спојена клото изоформа (УК). Небо је идентично КЛ1, плус 15 додатних аминокиселина на Ц-терминусу. Описане су различите активности клотхо-а, укључујући активацију сигнализације фактора раста фибробласта (ФГФ)23 [12,13], регулацију калцијумског канала потфамилије В потфамилије катјонских канала пролазног рецептора (ТРПВ)5 [14,15] и инхибицију путеви инсулина и инсулину сличног фактора раста (ИГФ)-1 [8,16,17].

Клото је изражен претежно у бубрезима и мозгу, али иу различитим ткивима, укључујући егзокрини и ендокрини панкреас [7,17-20]. Његове физиолошке активности у панкреасу тек треба да се утврде; међутим, постоје докази за његово учешће у регулацији хомеостазе глукозе. Клотхо индукује производњу и лучење инсулина ин витро и ин виво, смањује осетљивост на инсулин код мишева и исцрпљује се код панкреасних острва код пацијената са дијабетес мелитусом типа 2 (Т2ДМ) [8,19-22]. Клотхо је моћан супресор тумора код бројних малигнитета, укључујући карцином гастроинтестиналног тракта [16,17,23-30]. Код рака је епигенетски утишан, а и клото и Карл смањују раст ћелија рака ин витро и ин виво [16,17,23,25,26,28,31-33]. Код карцинома панкреаса, смањење клотоа је у корелацији са преживљавањем пацијената. Ин витро, клотхо смањује раст ћелија рака панкреаса и инхибира путеве ИГФ-И и бФГФ[17,34].

У овој студији, имали смо за циљ да дешифрујемо улогу клотоа као супресора тумора у ПДАЦ-у коришћењем три ин виво модела. Користећи нови генетски модел, показали смо да је нокдаун клото панкреаса допринео развоју ПДАЦ-а и смањеном преживљавању Крас мутантних мишева. У другом моделу, показали смо да примена вирусних честица које носе сКЛ инхибира туморе панкреаса у моделу ксенографта. На крају, третман растворљивим рекомбинантним небом продужио је преживљавање КПЦ мишева. Ови резултати манифестују улогу котоа као важног играча у развоју ПДАЦ-а и сугеришу клото као терапијску стратегију за лечење пацијената са ПДАЦ-ом.

2. Материјал и методе

2.1. ТЦГА анализа помоћу УЦСЦ Ксена претраживача

Скупови података РНАсег (ИллуминаХиСек) експресије гена (ИллуминаХиСек) и метилације ДНК (Метхилатион450к) за кохорту Атлас генома рака (ТЦГА) рака панкреаса (ПААД) проучавани су коришћењем Ксена претраживача Универзитета Калифорније Санта Цруз (УЦСЦ) (хттп://кена.уцсцеду/, приступљено 19. јула 2020.)[35].цистанцхКористећи Ксена Бровсер, укупно преживљавање и интервал без прогресије пацијената са карциномом панкреаса анализирани су према клото експресијама или метилацији КЛОТХО ДНК, и направљене су Каплан-Меиерове дијаграме. Дуплирани појединачни подаци су уклоњени филтрирањем само за примарне туморе. Подаци о експресији гена, дати у лог2(к плус 1) јединицама, подељени су у две групе према медијани; Подаци о метилацији ДНК подељени су у две групе према доњем и горњем квартилу.

За метилацију КЛОТХО ДНК специфичну за локацију, даље су анализирани узорци са ниским или високим нивоом клото експресије, као што је дефинисано доњим, односно горњим квартилима. Израчунате су вредности 36] за свако место метилације, а корелација са клото експресијом у одговарајућем узорку је испитивана преко Пирсоновог коефицијента корелације (р).

2.2. Хемикалије, антитела и конструкције

Хемикалије коришћене у овој студији укључивале су растворљиву варијанту спајања људи клото, која се састоји од аминокиселина34-549(ски домен; приступни број БАА24941.1), са 15-јединственом секвенцом аминокиселина на Ц-терминусу ({ {6}}; ПепроТецх Инц, Роцки Хилл, Њ, САД); глукоза (Флорис, Мисгав, Израел), хумани инсулин (Ацтрапид); Ново Нордиск А/С, Багсвӕрд, Данска) и луциферин (122799; ПеркинЕлмер, Валтхам, МА, САД).

Антитела коришћена у овој студији укључивала су контролу изотипа ИгГ2а пацова (02-9688; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) и анти- - актин (А5441; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) . Анти-клотхо антитела усмерена против КЛ1 домена (КМ2076) била су љубазан поклон од Киова Хакко Когио Цо., Лтд., Токио, Јапан.

2.3.ААВ векторска производња и пречишћавање

ААВ9 вектори, нулти празан вектор и небо (који садрже излучену изоформу варијанте клото споја, приступни број БАА24941.1) су произведени и пречишћени у објектима нивоа 2 биолошке безбедности Унитед Микта УАБ-ВХИР и Векторске производне јединице (ВПУ) Укратко , вектори су генерисани коришћењем система троструке трансфекције у ћелијама ХЕК293. После 48 х, ААВ вектори су сакупљени, третирани бензоназом, пречишћени у градијенту јодиксанола и титрирани коришћењем ПицоГреен-а [37]. Експресију трансгена покретао је ЦМВ промотер, као што је претходно описано [37].

2.4. Одржавање животиња

Одржавање мишева и експерименти су спроведени у Медицинском центру Соураски (Тел Авив, Израел), ау складу са прописима и стандардима Комитета за негу и употребу животиња Медицинског центра Соураски.

Сви сојеви мишева који су коришћени за трансгене моделе били су на мешовитој позадини Ц57БЛ/6 и ЈВБ/Њ. Пдк1-Цре, ЛСЛ-КрасГ12Д/ плус и ЛСЛ-Трп53Р172Х/ плус т мишеви су били љубазни поклони др Зив Гила (Технион-Израелски технолошки институт у Рамбаму, Хаифа, Израел).

2.5. КЛОТХО Кноцкдовм модели мишева специфични за панкреас

Како би се циљано срушило КЛОТХО на панкреату миша, генерисани су мишеви који носе флоксиране КЛОТХО алеле (КЛлок), као што је претходно описано [38].цистанцхе АустралиаКефлек/флок мишеви су укрштени са Пдк1-Цре мишевима, експримирајући Цре рекомбиназу контролисану промотором Пдкл, чиме се добија Пдк1-Цре; КЛ-/-мишеви. Обарање КЛОТХО панкреаса је потврђено имунохистохемијом и нивоима мРНА, као што је описано у наставку.

Да би се генерисали мишеви који носе КЛОТХО кноцкдовн контролисан Пдкл промотором и мутантну Крас експресију, ЛСЛ-КрасГ12Д/ плус мишеви [3], који носе Лок-Стоп-Лок секвенцу праћену мутантним Крас алелом, укрштени су са КЛфлок/флок мишевима. Ови мишеви су даље укрштени са Пдк1-Цре мишевима, дајући Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус мишеви. ЛСЛ-КрасГ12Д/ плус су такође укрштени са Пдк1-Цре мишевима одвојено, а овај Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус мишеви су коришћени као контрола. Мишеви су свакодневно прегледани на знаке патње, укључујући тешко дисање, велике промене тежине и велике туморе (више од 1 цм), а они који су испуњавали критеријуме које је поставила етичка комисија жртвовани су. Мишеви су праћени за преживљавање, при чему је смрт дефинисана или спонтано или знаковима који захтевају жртвовање. Због брзог варења ткива панкреаса панкреасним течностима, могли смо да прегледамо само панкреату мишева који су жртвовани. Ткива су сакупљена и држана у формалдехиду 24 сата, који је затим замењен са 70% етанола.

2.6. Студије ксенотрансплантата тумора мишева

Женке голих мишева атимуса (БАЛБ/ц позадина), старости {{0}} недеља, купљене су од Енвиго РМС (Јерусалем, Израел). Мишеви су смештени и одржавани у кабинетима са ламинарним протоком у специфичним условима без патогена. Првог дана експеримента, МИА ПаЦа-2 ћелије које стабилно експримирају м-Цхерри/луциферазу су субкутано(сц) инокулиране у њихове бокове (н=21, 1 × 10 степени ћелија у 100 μЛ од 5 проценат ФЦС ДМЕМ медијум). Десет дана након инокулације тумора, интрамускуларно је убризгана висока доза (5× 1011 ГЦ/мЛ, н=7) или ниска доза (5×1010ГЦ/мЛ,н=6) хуманог ААВ-а (им).ААВ-нулл је служио као контрола (5×1010 ГЦ/мЛ, н=8). Тумори су мерени дигиталном калипером три пута недељно, а запремина је израчуната по формули за израчунавање запремине елипсоида (0,5×дужина×ширина2). Двадесетог дана експеримента, тумори су процењени ин виво праћењем активности луциферазе МИА ПаЦа-2 ћелија ињекцијом 150 уг/мЛ луциферина интраперитонеално, а интензитет луциферазе је мерен помоћу Биоспасе.

Истог дана експеримент је завршен и мишеви су еутаназирани. Тумори су уклоњени, измерени и измерени дигиталном калипером. Крв је сакупљена пре еутанизације, а нивои хуманог клотоа су мерени у серуму коришћењем ЕЛИСА (ИБЛ, Миннеаполис, МН, САД). За ЕЛИСА је коришћено 50 микролитара серума по узорку (у дупликату), а анализа је спроведена према упутствима произвођача. Корелација између тежине тумора и нивоа клото крви код људи испитивана је преко Пирсоновог коефицијента корелације.

2.7. КЗК модели мишева

Генерисање КПЦ мишева је обављено укрштањем ЛСЛ-Трп53Р172Х/ плус мишева [5] који носе Лок-Стоп-Лок секвенцу, праћену тачкастим мутантним п53 алелом који функционише као нулта мутација, са ЛСЛ-КрасГ12Д/ плус т мишевима. Они су даље укрштани са Пдк1-Цре мишевима, што је резултирало Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус ; Трп53Р172Х/ плус мишеви. Мишеви су упарени према полу, старости и тежини, и насумично су распоређени да примају третман интраперитонеалним (ип) ињекцијама растворљиве људске коже (15 мг/кг, два пута недељно) или контролним носачем (н =6 за група третирана небом; н =7 за контролну групу). Лечење је настављено до 30 недеља. Мишеви су свакодневно прегледани на знаке патње, укључујући тешко дисање, велике промене тежине и велике туморе (више од 1 цм), а они који су испуњавали критеријуме које је поставила етичка комисија жртвовани су. Мишеви су праћени за преживљавање, при чему је смрт дефинисана или спонтано или знаковима који захтевају жртвовање.

2.8. Генотипизација

Мишји репови су узети у доби од 3 недеље за генотипизацију. ДНК је екстрахована инкубацијом репа у раствору за алкалну лизу, који се састоји од 250 μМ НаОХ и 2 μМ динатријум ЕДТА (пХ 12.0), током 30-60 мин на 95 степени , након чега следи неутрализација са 0.4 мМ Трис ХЦЛ (пХ 5,0). ДНК је накнадно подвргнут ПЦР амплификацији за различите генотипове, користећи РЕДТак РеадиМик ПЦР Реацтион Мик (Сигма-Алдрицх, Реховот, Израел). Прајмери ​​су били у коначној концентрацији од 1000 нМ. ПЦР циклуси и прајмери ​​су детаљно описани у табели С1. Производи су подвргнути електрофорези на 1,5% агарозних гелова и обојени етидијум бромидом.

2.9. Имунохистохемијска (ИХЦ) анализа

Ткива су фиксирана у 4 процента параформалдехида, а уграђена ткива су серијски сечена. Секције су или обојене хематоксилином и еозином (Х&Е) и микроскопски прегледане од стране искусног патолога, или обојене ИХЦ, као што је описано. За клотхо ИХЦ, пресеци фиксирани формалином и парафином, дебљине 4 ум, девоскани су у ксилену и рехидрирани. Узимање антигена је изведено коришћењем врућег купатила (95 степени) током 20 мин у цитратном пуферу пХ6.0. После хлађења током 30 минута, стакалца су испрана у ТБС-тритон (ТБС-Т) пуферу.цистанцхе бенефитсНакон тога је изведена блокада ендогене пероксидазе током 10 минута у 3 процента Х, О/метанола. Након испирања у ТБС-Т, секције су блокиране током 30 минута коришћењем 5 процената БСА у ТБС-Т и касније су инкубиране преко ноћи са клото примарним антителом на 4 степена. Детекција је изведена са ЗитоЦхем Плус (ХРП) у једном кораку полимера против миша/зеца/пацова (ЗУЦ053; Зитомед Системс, Берлин, Немачка). ИгГ2а пацова служио је као контрола изотипа.

2.10. Ланчана реакција полимеразе реверзне транскрипције (РТ-ПЦР)

Панкреаса из жртвованог Пдкл-Цре; КЛ-/- и КЛфлок/флок контролни мишеви су изрезани, замрзнути у течном азоту и чувани на -80 степену. Након хомогенизације панкреате, укупна РНК је припремљена коришћењем комплета за изолацију РНК (Сигма) и реверзно транскрибована коришћењем ЈСцрипт цДНА СуперМик (Куанта БиоСциенцес, Гаитхерсбург, МД, САД). цДНК је амплификована за клото и -актин (као контролу пуњења) коришћењем РЕДТак РеадиМик ПЦР Реацтион Мик (Сигма). ПЦР је оптимизован на 94 степена током 5 минута, праћен циклусима од 30 с на 94 степена, 90-их на 52,5 степена и 20 с на 72 степена (45 циклуса за клото, 25 циклуса за -актин) и 10 минута на 72 степена за проширење, користећи 12,5 пмол клото прајмера (Ф,5-АЦГТТЦААГТГГАЦАЦТАЦТЦТ-3'и Р,5'-ТТЦТТИГГЦТАЦААЦЦЦЦГТЦ-3') и 5 ​​пмол-актинских прајмера (Ф,5' -ТГТТАЦЦААЦТГГГАЦГАЦА-3'и Р,5'-ГГГГТГТТГА АГГТЦТЦААА-3). Производи су подвргнути електрофорези на 1,5% агарозних гелова обојених етидијум бромидом. Квантификација је урађена коришћењем софтвера ИмагеЈ, Национални институт за здравље, Бетхесда, МД, САД.

2.11.Статистичка анализа

Резултати су представљени као средња вредност ± СД или СЕМ, као што је поменуто. Континуиране варијабле су упоређене коришћењем т-теста осим ако није другачије наведено. Сви тестови значајности су били двострани, а п-вредност мања или једнака 0.05 сматрана је статистички значајном. Корелација је процењена коришћењем Пирсоновог коефицијента корелације (р). Анализа преживљавања је урађена коришћењем лог-ранк теста.

3. Резултати

3.1. Нивои Клотхо експресије и метилације ДНК у туморима панкреаса у корелацији са преживљавањем пацијената са раком

Кохорта рака панкреаса (ПААД) претраживача генома рака (ТЦГА) је испитана коришћењем Ксена претраживача Универзитета Калифорније у Санта Крузу (УЦСЦ)[35]. Анализе експресије гена су откриле смањено укупно преживљавање (ОС) и интервал без прогресије (ПФИ) за пацијенте са карциномом панкреаса са малом експресијом клото тумора, у поређењу са високим (н=89 за сваку групу; Слика 1А, Б). Испитивање података о метилацији показало је компатибилан тренд отежаног ОС и ПФИ код пацијената који су имали туморе са високим нивоом метилације КЛОТХО ДНК, у поређењу са ниским (н=45 и н=46; слика 2А, Б) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3) код рака панкреаса код људи (Слика 2Ц-Е).

3.2. Генерација панкреаса КЛОТХО Кноцкдовн мишева

Безусловни КЛОТХО нокаут мишеви умиру у доби од око 8-9 недеља [7], стога не могу да служе као модели за развој рака. Стога смо имали за циљ да КЛОТХО срушимо панкреату мишева. За овај циљ, Пдк1-Цре мишеви су укрштени са мишевима који носе флоксиране КЛОТХО алеле, КЛлок/лок [38], чиме се добија Пдк1-Цре; КЛ-/- мишеви (Слика 3А, Б). РНК и нивои протеина су потврдили срушење клото панкреаса (Слика 3Ц-Е). Пдк1-Цре; КЛ-77мишеви су показали благи пораст тежине током времена, у поређењу са контролом (Слика 3Ф), али није било разлика у серумској глукози или инсулину и толеранцији на глукозу (Слика С1).

Слика 3. Генерација КЛОТХО кноцкдовн мишева панкреаса. (А) Шематски дијаграм КЛфлок алела: ЛокП места бочне ексон 2 КЛОТХО, што доводи до његовог циљаног нокдауна Пдк1-Цре у панкреати; КЛ-/-мишеви. Горњи панел приказује флоксирани алел, доњи панел приказује очекиване резултате Цре рекомбинације. (Б) Репрезентативни гел који показује ПЦР производе КЛОТХО генотипизације миша: КЛ плус / плус (ВТ; 370 бп), КЛл / плус (470 и 370 бп) и КЛфлок / флок (470 бп). (Ц,Д) РНК панкреаса је екстрахована из Пдк1-Цре; КЛ-/-(н=7) и контролни миш (н=4). Нивои Клотхо мРНА су одређени семи-квантитативним РТ-ПЦР и квантификовани. Приказан је репрезентативни гел (оригиналне неисецане мрље су доступне на слици С2). (Е) Репрезентативно имунохистохемијско клото бојење панкреате изрезане из Пдк1-Цре; КЛ-/- и контролни мишеви. Увећање: Кс20. В/О, без. (Ф) Тежина мишева у обе групе (н=5по групи). Анализирано коришћењем АНОВА.п=0.01. Подаци су представљени као средња вредност ± СЕМ. Контрола, КЛфлок/флок мишеви. Мишеви који носе КЛОТХО кноцкдовн панкреаса и мутантну Крас експресију су генерисани укрштањем Пдк1-Цре са ЛСЛ-КрасГ12Д/ плус [3] мишева (Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус мишеви), и њиховим даљим укрштањем са КЛфлок/лок мишеви (Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус мишеви). Анализе су спроведене коришћењем мужјака мишева. Женке мишева су искључене због високе стопе аналних лезија у оба Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус и Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус мишева, што је у складу са претходним извештајима о мукокутаним папиломима код таквих мишева [3].

3.3. Губитак клото панкреаса доприноси смањеном преживљавању код мишева

Није било разлике у преживљавању Пдк1-Цре; КЛ-/- мишеви, у поређењу са контролом). Наставили смо да проучавамо ефекат комбинованог КЛОТХО-а панкреаса и Крас мутације на преживљавање праћењем мишева током 65 недеља. Смрт је наступила било спонтано или еутаназијом када су се појавили знаци тешке патње или туморског оптерећења које је захтевало жртвовање. Опстанак Пдк1-Цреа; КЛ-/-;КрасГ12Д/ плус мишеви (н =21) ​​је смањен, у поређењу са контролним Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус мишеви (н=18;п= 0.02; Слика 4А). Дакле, до старости од 22 недеље, 100 процената (18/18) Пдк1-Цре; КрасГи2Д/ плус мишеви су били живи, у поређењу са 71 процентом (15/21) Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус мишеви. Нису забележене значајне промене у тежини између група (Слика 4Б).

Слика 4. Кноцкдовн панкреаса КЛОТХО доприноси смањеном преживљавању и индукује ПДАЦ ин виво. (А) Каплан-Меиерове криве Пдк1-Цре; КЛ-/-;КрасГи2Д/ плус (н=21) у поређењу са контролним Пдк1-Цре;КрасГи2Д/ плус (н=18)мице.п=0.02.( Б) Тежина мишева у обе групе (н=19 по групи). (ЦЕ) Панкреаса је изрезана из Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус (н=7, просечна старост 36 недеља) и контролни Пдк1-Цре; КрасГи2Д/ плус (н=8, просечна старост 49 недеља)мишеви након жртвовања. (Ц) Поређење између патолошке процене Х&Е обојене панкреате обе групе. (Д) Репрезентативно Х&Е бојење панкреата сакупљеног од 24-недељних мишева.Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус (десно): потпуни губитак ћелијског поларитета, значајна нуклеарна атипија и пупање кластера ћелија у дуктални лумен, заједно са обилном фиброзом и кератином. Цонтрол Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус (лево): нема лезија. Увећање: ×10.(Е) Репрезентативне ПанИН лезије обе групе.Увећање: ×10.

3.4. Клотхо сарађује у развоју ПДАЦ-а у Виоо-у

На основу претходних студија које су показале развој ПДАЦ код мишева који имају и Крас мутацију и губитак активности супресора тумора [4], испитали смо Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус мишја панкреата за лезије. Због брзог варења ткива панкреаса панкреасним течностима, могли смо да користимо само панкреату мишева који су жртвовани. Узорци Пдк1-Цре; КЛ-7-; КрасГи2Д/ плус (н =7) ​​и контрола Пдк1-Цре; КрасГи2Д/ плус (н =8) мишеви су подвргнути патолошкој процени (просечна старост смрти: 36 и 49 недеља, респективно). ПДАЦ је идентификован у два Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус мишеви, али ни у једном од Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус мишеви, док је ПанН2 забележен у два Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус мишеви и у четири Пдк1-Цре; КрасГ12Д/ плус мишеви (слика 4Ц). Приказане су репрезентативне слике (слика 4Д-Е).

3.5. Третман са сКЛ инхибира туморе панкреаса и продужава преживљавање ин виво

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; Слика 5Ф-Г).

Други модел који је коришћен за овај циљ био је модел КЗК-а. Мишеви су упарени према полу, старости и тежини, и третирани су ињекцијама растворљивог хуманог сКЛ или контроле носача до 30 недеља. Смрт је наступила било спонтано или еутаназијом када су се појавили знаци тешке патње или туморског оптерећења које је захтевало жртвовање. Преживљавање мишева третираних сКЛ је повећано у поређењу са контролом (п=0.005; Слика 5Х).

Слика 5. Третман сКЛ смањује локални раст тумора и продужава преживљавање ин виво. (АГ)Атхимиц голи БАЛБ/ц мишеви су инокулирани са МИА ПаЦа-2 ћелијама које стабилно експримирају м-Цхерри/луциферазу (1×10 степени ћелија по миш).Десет дана касније, мишевима је убризгана висока доза ААВ-сКЛ (5×1011 ГЦ/мЛ,н=7), мала доза ААВ-сКЛ (5×1010 ГЦ/мЛ, н{{13} }), или контролни ААВ-нулл (5×1010 ГЦ/мЛ,н= 8). (А) Запремина тумора је мерена ин виво дигиталном калипером. (Б) Репрезентативне слике биосликовања активности луциферазе локалних тумора. (Ц) Активност луциферазе тумора мерена је бројем у минути. (Д) Репрезентативне слике тумора сакупљених на дан жртвовања. (Е) Тежина сакупљених тумора. (Ф) Нивои клото крви код људи. *стр<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Дискусија

Ова студија утврђује улогу клотоа као супресора тумора у ПДАЦ-у. Биоинформатичке анализе су откриле корелацију између преживљавања пацијената са ПДАЦ-ом и нивоа клото експресије и метилације ДНК и показале јединствени образац хиперметилације КЛОТХО-а у туморима панкреаса. Користећи нови модел миша, показали смо да нокдаун клото панкреаса сарађује са Крас мутацијом како би се смањио преживљавање и створио ПДАЦин Виво. Штавише, Л је инхибирао раст тумора који потичу из ћелија панкреаса у моделу ксенографта и продужио преживљавање КПЦ мишева.

Клотхо се епигенетски утишава хиперметилацијом промотера у широком спектру малигнитета [16,23,25,26,28-31,33,39,40]. Ово је такође пријављено у малим кохортама у ПДАЦ, као иу корелацији између преживљавања ПДАЦ пацијената и нивоа клото експресије и метилације ДНК [17,34]. У складу са тим, наша процена ОС, као и ПФИ користећи податке од 178 ПДАЦ узорака, показала је позитивну повезаност са клото експресијом и одговарајућу негативну повезаност са метилацијом КЛОТХО ДНК. Ови подаци даље указују на то да експресија клото може бити регулисана метилацијом ДНК и појачавају идеју да ови параметри могу послужити за процену прогнозе пацијената са ПДАЦ.

Претходне студије метилације КЛОТХО ДНК у ПДАЦ-у [17,34] биле су засноване на ограниченој подскупини пацијената и ин витро експериментима и нису анализирале образац метилације специфичних места унутар целог КЛОТХО гена. Тренутна анализа, заснована на горе поменутом опсежном скупу података, открила је да три специфична места, од којих се два налазе унутар ЦпГисланда у последњем егзону КЛОТХО-а, делују као негативни регулатори клото експресије хиперметилацијом. Раније смо открили да је једно од ових места, цг23282559, такође хиперметилирано код колоректалног карцинома [25]. Тек треба да се утврди да ли ова места играју улогу у регулацији клото и код других малигнитета.

Познато је да се Клотхо изражава у панкреасу; међутим, његова улога у нормалном развоју и функцији панкреаса је још увек непозната. Док мишеви са недостатком клото показују смањену производњу инсулина, заједно са драматичним повећањем инсулинске осетљивости [22], прекомерна експресија клотхо код мишева доводи до повећања инсулина у крви наташте, праћеног инсулинском резистенцијом [8]. Изненађујуће, модел миша представљен у овој студији, који је носио клото панкреаса, није показао очигледан фенотип дијабетеса или измењену осетљивост на инсулин. Штавише, није било ефекта на морфологију панкреаса, формирање тумора или преживљавање. Ови резултати сугеришу да губитак клотоа панкреаса може бити надокнађен периферним ефектима системског клотоа или другим механизмима. Штавише, развој дијабетеса је сложен процес, који зависи не само од панкреаса, већ и од јетре, мишића и масног ткива. Како је у нашем моделу, клото је био срушен углавном у панкреасу, то може објаснити недостатак дијабетеса у овом моделу миша.

У складу са представљеним клиничким резултатима, Пдк1-Цре; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плус мишеви су имали скраћени животни век у поређењу са контролним Пдк1-Цре; КрасГи2Д/ плус мишеви (48 према 60 недеља, респективно). Иако нисмо били у могућности да патолошки испитамо сву панкреату миша, виша стопа отвореног ПДАЦ-а је примећена код Пдк1-Цре; КЛ-7-; КрасГ12Д/ плус мишеви, у поређењу са контролним Пдк1-Цре; КрасГ2Д/ плус мишеви. Ови резултати показују значај клотоа у развоју малигнитета панкреаса и преживљавању ин виво. Фенотип Пдк1-Цре; КЛ-/-:КрасГл2Д/ плус мишеви су мање изражени, у поређењу са моделима који комбинују губитак других туморских супресора са Крас мутацијама. На пример, КПЦ мишеви имају медијан преживљавања од само 5 месеци[5]. Могуће је да је то због делимичне компензације губитка локалног клотоа циркулишућим клотоом. Алтернативно, резидуална експресија клотоа у панкреасу може утицати на фенотип. Постизање потпуног циљаног утишавања клотоа у будућим студијама омогућило би боље потцењивање његове улоге у различитим ткивима, као и противтежу између локалних и системских ефеката клотоа.

Представили смо два модела који демонстрирају терапеутски потенцијал клотоа. У моделу ксенотрансплантата миша, ињекције вирусног вектора коже од рака панкреаса биле су веома ефикасне, не само у инхибицији раста тумора, већ и у смањењу величине тумора. Лечење је почело када су тумори већ били видљиви и успостављени, што је код већине пацијената подсећало на време почетка лечења. Резултати сугеришу да се она може користити за генску терапију, чиме се заобилазе главне препреке стабилности и ефикасној испоруци лекова на бази протеина и пептида. Штавише, примећена је негативна корелација између тежине тумора и нивоа клото крви код људи. Даља истраживања нивоа клотхо у крви у погледу његовог ефекта могу помоћи у предвиђању ко ће имати користи од третмана клотхом или СКЛ-ом, као и у одржавању нивоа унутар терапеутског оквира.

Развој терапија заснованих на клото је циљ који траже многе истраживачке групе, али и фармацеутске компаније. Што се тиче лечења рака, постоји неколико путева који се истражују. Може се повећати ендогени ниво клото-а коришћењем предности епигенетских механизама за које се показало да утичу на експресију клото-а. Пријављено је да је клото промотер јако метилован код многих карцинома, а такође је у функцији старости. Дакле, једињења која инхибирају ДНК метил трансферазе могу постати терапеутска мета за повећање клото експресије. С друге стране, нивои се могу повећати додавањем клото егзогеним, на пример, применом генске терапије или испоруком рекомбинантног клото протеина. Овде смо известили о увођењу активног региона клотхо-а (Л) користећи ААВекпрессион систем, што је резултирало терапеутским ефектом у моделу рака панкреаса.

Затим смо показали да је третман растворљивим небом продужио преживљавање КПЦ мишева, модела за које је познато да рекапитулира људски ПДАЦ. Ово је показало ефекат неба у имунокомпетентном домаћину и природном окружењу тумора, додатно подржавајући могућу употребу ССЛ-а у клиничким окружењима.

5. Закључци

У закључку, ова студија је идентификовала клото као моћан супресор тумора у ПДАЦ-у. Тренутни режими лечења ПДАЦ-а нису довољни, а примена егзогеног сКЛ-а може послужити као нова стратегија за лечење ПДАЦ-а.

Овај чланак је извучен из Цанцерс 2021, 13, 6297. хттпс://дои.орг/10.3390/цанцерс13246297 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/цанцерс