Актеозид добијен из Цистанцхеа побољшава остеопорозу изазвану глукокортикоидима активирањем ПИ3К/АКТ/мТОР пута

Апстрактан

објективан

Глукокортикоиди се широко користе у клиничкој пракси; међутим, могу изазвати нежељене ефекте, као нпростеопороза. Ацтеосиде(АЦТ) из Цистанцхеа се користио за борбу против разних болести. Студија је спроведена да би се проценила ефикасност АЦТ код глукокортикоидних индукованихостеопороза(ГИОП) и његов потенцијални механизам.

Методе
Дексаметазон (Дек) је убризган интрамускуларно да би се индуковаоостеопорозана моделу пацова, а АЦТ је даван орално. АЦТ је допуњен ин виво у Дек-стимулисаномостеобластичнаМЦ3Т3-Е1 ћелије. РТ-кПЦР је изведен да би се проценили нивои мРНАформирање костију(Рунк2, ЦоЛ1А1) и ресорпцију кости (ОПГ и РАНКЛ). Примењен је комерцијални ЕЛИСА комплет за процену нивоа ОЦ и ЦТКС у серуму. Вестерн блот је изведен да би се проценили нивои протеина у сигналном путу ПИ3К/АКТ/мТОР. ЦЦК-8 тест и проточна цитометрија су урађени да би се проценила одрживост остеобласта и апоптоза.

Кликните овде да бисте добили Цистанцхе Ацтеосиде за лечење остеобласта стимулисаног Дек-ом

Резултати
АЦТ је смањио Дек-индуковано погоршање микроструктуре костију, повећао нивое ОЦ у серуму и смањио нивое ЦТКС (П< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and промовисао апоптозу; међутим, овај ефекат је у великој мери ослабљен АЦТ-ом (П< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Закључак
АЦТ фромЦистанцхеможе имати остеопротективне ефекте активирањем сигналног пута ПИ3К/АКТ/мТОР за ублажавање остеопорозе изазване Деком.

Кључне речи:Ацтеосиде Цистанцхеиндуковане глукокортикоидимаостеопороза

Увод
Остеопороза (ОП) је генерализована болест скелета коју карактерише ниска коштана маса, деструкција микроструктуре коштаног ткива и неравнотежа у хомеостази костију [1]. ОП изазива више од 8,9 милиона прелома годишње, а остеопоротични преломи се јављају скоро сваке 3 секунде и доводе до доживотног инвалидитета или смрти [2]. Глукокортикоиди (ГЦ) се обично примењују за лечење неинфективних инфламаторних болести (као што су астма и инфламаторна болест црева), као и аутоимуних стања [3]. Међутим, дуготрајна употреба ГЦ предиспонира за више од 30 процената случајева ОП и више од 10 процената случајева остеонекрозе [4]. ГЦ директно инхибирају пролиферацију и диференцијацију остеобласта [5], смањују сазревање и активност и индукују апоптозу остеобласта, што заузврат доводи до развоја глукокортикоидно индуковане остеопорозе (ГИОП) [6]. Штавише, све већи докази сугеришу да је дисфункција остеобласта главни узрок губитка коштане масе. Стога се чини да је повећање броја и функције остеобласта главна стратегија за превенцију ОП, посебно ГИОП.

Биљни лекови, посебно они на бази природних једињења, практикују се хиљадама година за лечење разних болести [7]. Цистанцхе је драгоцена биљка забележена у кинеској фармакопеји која расте у јужном делу аутономног региона Синђанг Ујгур и позната је као пустињски гинсенг [8]. Доказано је да Цистанцхе има различите ефекте, као што су јачање имунитета, заштита бубрега, анти-агинг, антиоксидативни, антиинфламаторни и неуропротективни ефекти [9].Ацтеосиде(АЦТ) је фенил етанолни глукозид у Цистанцхеу, који има биолошке активности, као што је инхибиција апоптозе неурона [10], ублажавање оштећења јетре [11], против запаљења [12], антиоксидација [13] , превенција дијабетеса [14] и гојазности [15], као и дегенерације зглобне хрскавице [16]. Штавише, неколико студија је известило о фармакокинетици АЦТ-а и потврдило да терапеутски ефекат постоји чак и ако је орална употреба само 0,12 процената. АЦТ се сматра пролеком са активним метаболитима ин виво [17].

Зханг ет ал. су показали потенцијални заштитни ефекат АЦТ-а на губитак костију изазван овариектомијом код пацова [18]. АЦТ модулише сигнални пут ИГФ-1/ПИ3К/мТОР да би спречио губитак коштане масе код дијабетичких пацова [19]. Пријављено је да пут ПИ3К/АКТ/мТОР има критичну регулаторну улогу у различитим болестима, укључујући ГИОП [20]. Нарингин ублажава ГИОП регулацијом сигналног пута ПИ3К/АКТ/мТОР [21]. Поред тога, овај сигнални пут регулише диференцијацију остеобласта [22], формирање костију [23] и зарастање прелома [24]. Међутим, није позната потенцијална улога АЦТ-а на ГИОП-у и да ли је регулисана модулацијом сигналног пута ПИ3К/АКТ/мТОР.

Ова студија је имала за циљ да разуме заштитне ефекте АЦТ у ГИОП моделу пацова и остеобластима ин витро и да разјасни основне молекуларне механизме.

материјали и методе
Експерименталне животиње
Четрдесет 8-недељних мужјака Спрагуе-Давлеи (СД) пацова тежине 280–340 г добијено је из Схангхаи Лаборатори Анимал Центер (ЦАС, Шангај, Кина). Поступци неге експерименталних животиња спроведени су у складу са протоколом који је одобрио Комитет за етику животиња Треће придружене болнице Медицинског универзитета Кикихар. А студија је спроведена у складу са смерницама АРРИВЕ. Животиње су биле смештене у центрима за животиње без патогена, 24 ± 2 степена, 12 х светлосних и тамних циклуса, 50 ± 5 процената влажности и са слободним приступом храни и води.

Конструкција ГИОП модела
Након 7 дана адаптивног храњења, пацови су насумично подељени у контролне и моделне групе користећи метод табеле случајних бројева, убризгаван је дексаметазон (Дек, Сигма-Алдрицх Ст. Лоуис, МО, УСА) 5 мг/кг два пута недељно током 6 недеља. интрамускуларно да изазове ОП код пацова у групи модела [25]. Пацовима у контролној групи (н = 10) је убризгана једнака количина физиолошког раствора. Нису примећене значајне промене у телесној тежини код пацова у обе групе након 6 недеља. Након тога, пацови у групи модела су подељени у групу модела, групу са малим дозама АЦТ (Модел плус АЦТ-Л) и групу са високим дозама АЦТ (Модел плус АЦТ-Х). АЦТ (ХПЛЦ 98 процената) је добијен од Баоји Хербест Био-тецх., Лтд. (Баоји, Кина), и третиран са воденом суспензијом растварача. Доза од 50 мг/кг/д и 100 мг/кг/д АЦТ орално је давана пацовима у групама са ниским и високим дозама (8 пацова по групи), респективно, и настављено је 8 недеља. Међу њима, величина узорка је израчуната на основу претходне студије [26]. Узимајући у обзир двострани ниво значајности од 0,05 [95 процената интервала поверења ( = 0.05)], 80 процената снаге и величине ефекта од 0,5, анализа снаге је проценила потребну величину узорка од 6 животиња по групи под претпоставком да релевантан ниво ефекта од 30 процената остеопорозе. Даље, са стопом напуштања од 20 процената, 8 животиња по групи (укупно 32 пацова) сматрало се идеалним.

Узорци серума пацова
После 8 недеља, пацови су анестезирани са 10 процената хлорал хидрата (400 мг / кг, интраперитонеално, Соларбио, Пекинг Кина), крв је сакупљена из абдоминалне аорте, згрушана на собној температури и центрифугирана на 3500 о / мин током 10 мин. Серум је чуван у епруветама за центрифугирање од 1,5 мЛ до даље употребе.

Процена минералне густине костију
Минерална густина костију (БМД) је коришћена помоћу ДАКС дензитометра за кости малих животиња (Ранзхе Инструмент Екуипмент Цо., Шангај, Кина). Укратко, пацови су постављени у лежећи положај, а задњи удови су постављени ка споља. Десна бутна кост пацова је скенирана према упутствима произвођача и забележене су вредности БМД [27].

Анализа морфологије костију
На крају експеримента, пацови су еутаназирани интраперитонеалном ињекцијом вишка хлорал хидрата, а бутне кости су фиксиране у 70-постотном етанолу. Након тога, скенирања су обављена на ВиваЦТ 40μЦТ систему као што је описано у претходној студији и коштани волумен/укупни волумен (БВ/ТВ), трабекуларни број кости (Тб.Н), дебљина трабекуле кости (Тб.Тн) и трабекуларна сепарација кости (Тб.Сп) су процењени [28]. За еутаназију, СД пацови су анестезирани након анализе морфологије костију интраперитонеалном ињекцијом 10 процената хлорал хидрата (350 мг/кг).

Ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА)
Комерцијални ЕЛИСА комплети су коришћени за детекцију нивоа остеокалцина (ОЦ, Е-ЕЛ-Р0243ц, Елабсциенце) и Ц-терминалног телопептида (ЦТКС, Е-ЕЛ-Р1405ц, Елабсциенце) у серуму пацова. Укратко, реагенси су уклоњени на 18-25 степени да би се уравнотежио и припремио раствор за прање и стандардни рад. Ензимске плоче Плоче су постављене са стандардним, празним и узоркованим бунарчићима. Око 100 μЛ раствора разблаживача узорка је додато у бунарчиће, инкубирано 90 минута на 37 степени, и замењено биотинилованим антителом током 60 минута на 37 степени. После испирања, додат је радни раствор који везује ензим и инкубиран 30 мин. Додат је раствор супстрата (90 μЛ) и инкубиран 15 мин уз заштиту од светлости. Када се плави градијент појавио у стандардним бунарима, додато је 50 μЛ раствора за терминацију и анализирана је промена ОД450.

Реверзна транскрипција – квантитативни ПЦР у реалном времену (РТ-кПЦР)
ТРлзол ЛС реагенс је додат серуму пацова и АЦТ-третираним МЦ3Т3-Е1 ћелијама, а укупна РНК је екстрахована инкубацијом на собној температури након чега је уследило додавање хлороформа. Концентрација и чистоћа РНК потврђени су мерењем апсорбанције А260/280 у Нанодроп НД-1000 спектрофотометру. Комплет СуперСцрипт ИИ реверзне транскриптазе је коришћен за реверзну транскрипцију РНК у цДНК. Након тога, цДНК је примењена као шаблон, додат је прајмер, а СИБР-Греен ПЦР мастер мик кит је помешан и допуњен са ддХ2О до 20 μЛ, а реакција ПЦР амплификације је изведена коришћењем Апплиед биосистемс АМИ7500 Фаст Реал-тиме ПЦР систем (АБИ, ЦА, САД). ГАПДХ је коришћен као интерна референца за нормализацију, а релативни нивои експресије су израчунати коришћењем 2-ΔΔЦт методе и изведени у три примерка. Секвенца прајмера за транскрипциони фактор 2 (Рунк2), колаген типа И 1 (ЦоЛ1А1), активатор рецептора лиганда нуклеарног фактора-κБ (РАНКЛ), остерикс и остеопротегерин (ОПГ) представљени су у табели 1.

Вестерн-блот анализа
Ћелијама је додат РИПА лизат који садржи 1 проценат инхибитора протеазе, а укупни протеин из сваке групе је сакупљен након лизе ћелија мућкањем током 5 минута на 4 степена. БЦА тест кит је коришћен за квантификацију концентрације протеина у свакој групи. Након тога, узорци протеина су помешани са 10% пуфера натријум додецил сулфата (СДС) у једнакој запремини и кувани у воденом купатилу на 95 степени током 5 минута ради денатурације протеина. Припремљен је вертикални гел од 12% СДС-полиакриламида, а након што се гел очврснуо, узорковано је 30 уг протеина за одвајање 120 мА 90 мин гел електрофорезом. Протеин је затим пребачен на ПВДФ мембрану на 90 В током 120 мин. Након затварања са 5% говеђег серумског албумина, ПВДФ мембрана је исечена на основу молекуларне тежине маркера и траке циљног протеина и инкубирана са одговарајућим примарним антителом преко ноћи на 4 степена. Зечја поликлонска антитела против п-АКТ, п-мТОР и п-ПИ3К су разблажена у односу 1:1000 (Протеинтецх, Вухан, Кина). ТБСТ је испран 30 минута и инкубиран са одговарајућим секундарним антителом обележеним пероксидазом рена на собној температури 1 х. Мрља је визуелизована коришћењем реагенса побољшане хемилуминисценције. Густина протеинских трака је квантификована коришћењем слике Ј. ГАПДХ је коришћен као контрола за израчунавање релативних нивоа протеина.

Ћелијска култура и груписање
Мишји преостеобласти МЦ3Т3-Е1 су купљени од Кинеске колекције културе ткива (ЦТЦЦ, Кина) и култивисани у -МЕМ који садржи 10 процената феталног говеђег серума и 100 У/мЛ пеницилина и 100 мг/мЛ стрептомицина у влажни инкубатор на 37 степени и 5 процената ЦО2. За културу диференцијације костију, остеогени индукциони медијум је направљен мешањем 10 мМ- -глицерофосфата и 50 мг/мЛ аскорбинске киселине (Сигма-Алдрицх) са -МЕМ и додат је ћелијама МЦ3Т3-Е1 да се индукује њихову диференцијацију. Подлога је промењена након 3 дана. Културе током 14 дана су коришћене за одрживост алкалне фосфатазе (АЛП). Штавише, ћелије су претходно третиране ПИ3К инхибитором ЛИ294002 (10 μМ) током 30 минута, након чега је уследио третман са Дек и АЦТ.

Тест виталности ћелија
Урађен је тест комплета за бројање ћелија-8 (ЦЦК-8) да би се проценила одрживост остеобласта третираних АЦТ-ом. МЦ3Т3-Е1 ћелије су инокулисане у плоче са 96 јажица при 5 × 103 ћелија/бунарићу. Количина од 1 μМ Дек-а је разматрана на основу претходних студија [29] и ко-инкубирана са градијентом концентрација АЦТ (10−8, 10−7, 10−6 и 10−5 М). Медијум за културу у 96-плочама бунара је замењен након додавања медијума за мешање и ЦЦК-8 реагенса у односу 10:1. После настављене инкубације од 1 х на 37 степени, процењена је промена ОД450.

Детекција броја апоптозе остеобласта
Ћелије МЦ3Т3-Е1 које су биле подвргнуте различитим третманима су дигестиране коришћењем трипсина без ЕДТА и сакупљене центрифугирањем. После испирања са 1 × пуфером за везивање, додато је 5 μЛ Анексина В-ФИТЦ и инкубирано на собној температури 5 минута, допуњено са 5 μЛ ПИ и пропуштено кроз 200- мрежасту најлонску мрежу. Узорци су анализирани коришћењем ФАЦСцан система проточне цитометрије.

Тест активности АЛП
МЦ3Т3-Е1 ћелије су инокулисане у 24-плоче са бунарима, а АЦТ и Дек су додати након малтерисања. Медијум ћелијске културе је замењен медијумом за остеогену диференцијацију за културу. Након употребе лизе ћелија раствором за лизу ћелија (П0012Ј, Беиотиме Биотецхнологи), супернатант је сакупљен центрифугирањем, а стандардна крива је уцртана. АЛП комплет (П0132С, Беиотиме Биотецхнологи) је коришћен за процену активности АЛП и израчунат је ОД450.

Статистичка анализа
Након извођења три независна експеримента у три примерка, подаци су анализирани коришћењем софтвера ГрапхПад Присм 6.0 и изражени као средња вредност ± стандардна девијација. АНОВА је коришћена за упоређивање статистичких разлика између више група. П-вредност < 0.05 се сматрала статистички различитом.