Активност вођена изолација фенолних композиција из зида Аннеслеа Фрагранс. И њихов цитопротективни ефекат против оксидативног стреса изазваног водоник-пероксидом у ХепГ2 ћелијама, део 1

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Апстрактан: Anneslea fragrans Wall., commonly known as"Pangpo Tea", is traditionally used as folk medicine and healthy tea for the treatment of liver and intestine diseases. The aim of this study was to purify the antioxidative and cytoprotective polyphenols from A.fragrans leaves. After fractionation with polar and nonpolar organic solvents, the fractions of aqueous ethanol extract were evaluated for their total phenolic (TPC) and flavonoid contents(TFC) and antioxidant activities(DPPH, ABTS, and FRAPassays). The n-butanol fraction (BF)showed the highest TPC and TFC with the strongest antioxidant activity. The bio-guided chromatography of BF led to the purification of six flavonoids (1-6) and one benzoquinone lanthanoid (7). The structures of these compounds were determined by NMR and MS techniques. Compound 6 had the strongest antioxidant capacity, which was followed by 5 and 2. The protective effect of the isolated compounds on hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress in HepG2 cells revealed that the compounds 5 and 6exhibited better protective effects by inhibiting ROS productions, having no significant difference with vitamin C(p>0.05), док је 6 показало најбољу активност против апоптозе. Резултати сугеришу да би А.фрагранс могао да послужи као вредан антиоксидативни фитокемијски извор за развој функционалне хране и нутриционистичких производа за здравље.

Кључне речи:Аннеслеа фрагранс; антиоксиданс; вођена изолација; оксидативни стрес; флавоноидни гликозиди

Кликните овде да бисте сазнали више

1. Представљање

Реактивне врсте кисеоника (РОС) се производе као нуспроизводи оксидативним дисањем у нормалним физиолошким и биохемијским процесима [1]. Као ендогени слободни радикали, РОС игра важну улогу у ћелијској сигнализацији и одржавању постојаности тела у нормалном опсегу [2]. Ако се РОС не може ефикасно очистити, прекомерни РОС може довести до појаве оксидативног стреса, који може утицати на пролиферацију ћелија и апоптозу [3]. Оксидативни стрес је уско повезан са разним болестима укључујући дијабетес, хиперлипемију, гојазност, рак и кардиоваскуларне и неуродегенеративне болести [4]. Недавно су многа истраживања показала да исхрана обогаћена антиоксидансима има низ корисних ефеката захваљујући њиховој способности уклањања прекомерног РОС-а [5,6].

Природни антиоксиданси садрже различите молекуле као што су полифеноли[], каротеноиди [8], витамини [9], једињења која садрже азот [10] и кумарини [9]. Полифеноли су широко распрострањени у биљном царству и промовишу здравствене предности захваљујући својим антиоксидативним својствима [11]. Многи од њих, као што су ресвератрол и неки деривати [12], антоцијанидини [13], изофлавони [14л, катехин [15л, и кверцетин [16], добро су познати по свом заштитном дејству уклањањем РОС [1]. Последњих неколико година, полифеноли привлаче пажњу у превенцији рака[17], кардиоваскуларне дисфункције[18], неуродегенеративних болести [19] и старења [20]. Стога је потрага за ефикасним антиоксидансима хитна потреба за унапређење здравља људи.

Цистанцхе може побољшати имунитет

Аннеслеа фрагранс Валл. је зимзелена биљка, која је углавном распрострањена на југу Кине [21]. Поред своје украсне сврхе, листови А.фрагранс се користе и као народни лек за лечење грознице, заштиту јетре, окрепљујући желудац и црева у Кини и Камбоџи [22], што је забележено у „Иуннан Симао Цхинесе Хербал Медицине“ .Поред тога, листови су такође прерађени као напитак од чаја, који је познат као "Пангпо Теа". У претходним извештајима [23], екстракт А.фрагранс је показао антиоксидативно и антималаријско деловање. Међутим, до данас, његова антиоксидативна фенолна једињења из А. мириса нису пријављена.

Стога је сврха овог истраживања била да се изолују и идентификују антиоксидативна једињења из листова А. фрагранс која су одговорна за њихову традиционалну употребу у лечењу обољења јетре. Четири фракције, фракција дихлорометана (ДФ), фракција етил ацетата (ЕАФ), фракција н-бутанола (БФ) и фракција заостале воде (РВФ) воденог етанолног екстракта процењене су на њихов укупан садржај фенола (ТПЦ) и укупних флавоноида (ТФЦ) и због њиховог антиоксидативног капацитета. Фракција н-бутанола (БФ) имала је највећи ТПЦ и ТФЦ са најјачом антиоксидативном активношћу. Био-вођено фракционисање БФ омогућило је пречишћавање једињења. Даље, цитопротективни ефекат изолованих једињења је изведен на оксидативни стрес изазван водоник-пероксидом (Х, О,) у ћелијама ХепГ2 рака јетре код људи. Интрацелуларна производња РОС-а и ћелијска апоптоза су одређене проточном цитометријом. Тако је ово истраживање дало вредан антиоксидативни фитокемијски састојак за развој и коришћење листова А.фрагранс као функционалног додатка (здравог чаја) у прехрамбеној и здравственој индустрији.

2. Резултати и дискусија

2.1. Ефикасност приноса разломака и подфракција

Подела течност-течност помоћу органских растварача и фракционисање на колони су важне технике за обогаћивање биоактивних једињења из сировог екстракта [24]. Коришћењем раздвајања течност-течност, етанолни екстракт (ЦЕ) из листова А. фрагранс је сукцесивно фракционисан са дихлорометаном, етил ацетатом и н-бутанолом да би се добиле четири фракције (ДФ, ЕАФ, БФ, и РВФ), респективно. Утврђено је да проценти приноса фракција варирају од 11 до 27 процената. Фракција преостале воде (РВФ, 27 процената) је имала највећи принос, а приноси осталих фракција су били следећи: фракција н-бутанола (БФ, 24 процената), фракција етил ацетата (ЕАФ, 21 проценат), дихлорометан фракција (ДФ, 11 процената).

Утврђено је да проценат приноса субфракција (БФ-А до Е) варира од 3,82 до 48,4 процената. БФ-Е је показао највећи принос од 48,4 процената, а следи БФ-Д (24,96 процената), који има значајно веће приносе од осталих фракција.

2.2.ХПЛЦ анализа

Показало се да је детекција течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ) моћна техника за квантитативно одређивање. ХПЛЦ анализа је открила да БФ има највише једињења са најјачом антиоксидативном активношћу. Под вођством антиоксидативних тестова и ХПЛЦ анализе, антиоксидативна фракција је даље хроматографисана за изоловање субфракција. БФ је подвргнут колони хидратисане смоле Д101 да би се добило пет субфракција (БФ-А до Е). ХПЛЦ анализа је открила да БФ-Цто Е има највише антиоксидативних једињења. Био-вођено фракционисање ових фракција (БФ-Ц до Е) омогућило је пречишћавање седам чистих једињења.

Као што је приказано на слици 1, БФ и седам чистих једињења су профилисани ХПЛЦ анализом. На основу поређења са временима задржавања и кривама УВ апсорпције, ових седам једињења је потврђено кроз време задржавања на 7,51 мин (корозивно, 7), 7,92 мин((епи)-катехин, 6), 9,38 мин (конфузозид, 1), 9,57 мин((С)-нарингенин-7-О- -Д-глукопиранозид, 4), 10,32 мин (ваццинии фолин, 2), 12,64 мин (2',3,4,4'-тетрахидроксиди дихидрохалкон, 5) и 13,95 мин (1-[4-(-Д-глукопиранозилокси)-2-хидроксифенил]-3-(4-хидрокси-3-метоксифенил) -1-пропанон,3) (Слика 1А). Међу њима, једињења 1-6 спадају у флавоноиде, а једињење 7 је бензохинолетаноид.

2.3. Укупан садржај фенола (ТПЦ) и укупан садржај флавоноида (ТФЦ)

Листови А.фрагранс се традиционално користе као прерађени чај за здравље и доказано су као добар извор фенола и флавоноида [25]. Према спектрофотометријским тестовима, ТПЦ и ТФЦ су тестирани у различитим фракцијама и подфракцијама листова А. фрагранс. Као што је приказано у табели 1, БФ је имао највећу ТПЦ вредност са 238,12±12.05 мг ГАЕ/г екстракта, а затим ЕАФ. ДФ је показао најнижу ТПЦ вредност као 66,52±0,57 мг ГАЕ/г екстракта. Слично, највеће концентрације ТФЦ су такође пронађене у БФ са ТФЦ вредношћу од 165,19 ± 5,21 мг РЕ/екстракт. Што се тиче РВФ и ЕАФ (66,92±1,38 и 116,12±2,89 мг ГАЕ/екстракта, респективно), они су такође имали ниже концентрације ТФЦ од БФ (165,19±5,21 мг РЕ/г екстракта), док је ДФ имао најнижу концентрацију ТФЦ као 47,94±2,84 мг РЕ/г екстракта. Садржај ТПЦ и ТФЦин БФ био је приближно четири пута већи од садржаја у ДФ.

Подаци су приказали присуство највећег ТПЦ и ТФЦ у БФ-Е са вредностима као 262,03±1,72мг ГАЕ/г екстракта; 180,52±6,30 мг РЕ/г екстракта, респективно, затим БФ-Д (219,84±4,01 и 157,01±2,50 мг РЕ/г екстракта, респективно), БФ-Ц (210,69±6,31 и 151,01±4,33 мг РЕ/г екстракта, респективно). респективно), док су БФ-Б и БФ-А имали најниже вредности ТПЦ и ТФЦ (табела 1).

2.4. Антиоксидативна активност

Већина полифенола, посебно флавоноида и фенолних киселина, експлоатише се у популарној антиоксидантној храни (нутрацеутицима) и представљају низ добробити за људе [17]. У нашој претходној студији, листови А.фрагранс су се показали као добар извор полифенола[26]. Међутим, антиоксидативна активност екстракта из листова А. фрагранс и његове фитокемикалије још нису истражене. Због различитих механизама антиоксидативних реакција, комбинована су три теста АБТС, ДППХ и ФРАП да би се проценила антиоксидативна активност фракција и субфракција из листова А. фрагранс.

Among the fractions, BF showed the most potent antioxidant activity in ABTS, DPPH, and FRAP radical-scavenging activities with 1808.46±96.52,951.42±87.75, and 1822.96± 29.24 μmol TE/g extract （Table 1）.PDF showed the lowest antioxidative activity in ABTS and FRAP assays（139.23±8.62 μmol TE/g extract and 180.05± 9.46 μmol TE/g extract, respectively)(Table 1). Whereas the radical scavenging activities of four fractions (DF, EAE, BF, and RWF) in the DPPH radical-scavenging assay were found to vary from 613.38± 45.35 to 951.42±87.75 μmol TE/g extract, respectively, having no significant difference (p>0.05). These results suggested that the phytochemicals from A. fragrans leaves might be insensitive to DPPH. To further obtain the active metabolites, BF was selected for further fractionation. The BF was subjected to D101 macroporous adsorbing resin column chromatography eluting by a gradient of the methanol-aqueous system to yield five subfractions(BF-A to E). Hence, the ABTS radical-scavenging activity of these subfractions can be ranked as BF-E> BF-C>БФ-Д. Редукциона активност у ФРАП тесту је показала да је БФ-Д имао најјачу антиоксидативну активност, коју су пратили БФ-Ц и БФ-Е. Важно је напоменути да су три подфракције (БФ-Ц до Е) показале већу антиоксидативну активност од матичне фракције. (БФ). Узети заједно, БФ-Ц до Е је подвргнут хроматографији на колони ради изоловања и идентификације антиоксидативних фитокемикалија.

2.5. Антиоксидативно деловање изолованих једињења

Сва изолована једињења (једињења 1-7) су процењена на антиоксидативни капацитет помоћу АБТС, активности уклањања радикала ДППХ и антиоксидативне активности ФРАП. Сви подаци су описани у табели 2. Једињења 6 и 2 су показала највећу антиоксидативну активност, а затим 5. Једињење 4 је показало умерену антиоксидативну активност, а једињења 1, 3 и 7 су сматрана неактивнима са активностима уклањања радикала АБТС и ДППХ мањим од 200 μмол ТЕ/г екстракта. Користећи Вц (активности уклањања радикала са 2932,91 ±93,63 и 1873,56±121,68 умол ТЕ/г екстракта, респективно) као позитивну контролу, једињење6 је имало најјачу антиоксидативну активност у АБТС и ДППХ тестовима уклањања радикала са 1873,56±121,68 умол ТЕ/г екстракта, респективно. ТЕ/г екстракта (стр<0.05）, respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract,="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover,="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">

Поред тога, однос антиоксидативне структуре и активности флавоноида (1-6) се разматра различитим степеном инхибиторних ефеката. Једињење 2 је показало већу антиоксидативну активност од једињења 1, 3 и 5, што сугерише да 3,4-дихидрокси групе у дихидрохалконима у 2 могу играти критичну улогу против АБТС-а, активности уклањања ДППХ радикала и ФРАП антиоксиданса активност, а део глукозе замењен у Ц-4'у 2 може да игра важну улогу у његовом антиоксидативном капацитету [4]. Штавише, једињење 6 је показало највећу антиоксидативну активност у поређењу са другим једињењима, што сугерише да флаван-3-оли (катехин) вероватно показују бољу активност уклањања радикала од дихидрохалкона и флаванона [27]. Укратко, једињења 2, 5 и 6 са добром антиоксидативном активношћу су даље одабрана за цитопротективне ефекте против оксидативног стреса Х2О2 у следећој студији.

2.6. Однос између антиоксидативне активности и садржаја ТПЦ/ТФЦ

Концентрације ТПЦ и ТФЦ су у високој корелацији са антиоксидативном активношћу из вредности ФРАП (р{{0}}.982 и 0.977) и АБТС (р=0.959 и 0,965), респективно. Корелациона матрица је такође показала јаку корелацију између вредности АБТС и ФРАП (р =0.992). Надаље, спроведена је мултиваријантна анализа (ПЦА), која је издвојена из података табеле 1. Као што је приказано на слици 2, ПЦА је објаснио 94,44 процената укупне варијације, при чему је ПЦ1 чинио 84,73 процената варијансе, а ПЦ2 9,71 проценат. ФРАП, АБТС и ДППХ тестови са ЕАФ и РВФ смештени су у горњим десним квадрантима, а концентрације ТПЦ и ТФЦ са БФ и БФ-Цто Е се налазе у доњим десним квадрантима у ПЦ1 позитивним резултатима, респективно. У међувремену, ДФ и БФ-А до Б са ниским концентрацијама ТПЦ и ТФЦ налазе се дуж осе ПЦ1 негативних резултата. Ови налази су показали да су концентрације ТПЦ и/или ТФЦ уско повезане са антиоксидативним капацитетом, и што су веће концентрације ТПЦор ТФЦ у фракцијама и подфракцијама, то су веће њихове вредности антиоксидативног капацитета. Ови резултати су открили да високи садржаји фенола и флавоноида у различитим фракцијама и подфракцијама листова А. фрагранс могу допринети антиоксидативном деловању.

Слика 2. ПЦА анализа укупних фенола, флавоноида и антиоксидативне активности. Средства са различитим словима указују на значајне разлике (стр<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">

Овај чланак је извучен из Молецулес 2021, 26, 3690. хттпс://дои.орг/10.3390/молецулес26123690 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/молецулес