Адхерентне и суспендоване ћелије бубрега бебе хрчка имају другачији репертоар цитоскелета и површинских рецептора

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Вероника Дилл¹, Флориан Пфафф¹, Алине ЗиммерИД², Мартин Беер¹, Мицхаел ЕсцхбаумерИД^1*

Апстрактан

Култура животињских ћелија, са појединачним ћелијама које растусуспензија, идеално у хемијски дефинисаном окружењу, представља ослонац биофармацеутске производње. Синтетичком окружењу недостају егзогени фактори раста и обично захтева дуготрајан процес прилагођавања да би се одабрали ћелијски клонови који се размножавају усуспензијадо великог броја ћелија. Молекуларни механизми који олакшавају адаптацију и који се одвијају унутар ћелије су углавном непознати. Посебно за ћелијске линије које се користе за производњу антигена вируса, као што су ћелије бубрега беба хрчака (БХК), ограничавање раста вируса кроз еволуцију нежељених карактеристика ћелија је веома нежељено. Поређење између адхерентно растућих БХК ћелија и ћелија суспензије са различитимподложностдо вируса слинавке и шапа откривене су разлике у експресији ћелијских рецептора као што су интегрини и хепаран сулфати и у организацији актинског цитоскелета. Транскриптомске анализе и расткинетикадемонстрирали су разноликост БХК ћелијских линија и потврдили важност добро окарактеризираних клонова родитељских ћелија и пажљивог скрининга како би се осигурало да се битне ћелијске карактеристике не изгубе током адаптације.

Цистанцхе тубулоса спречава болест бубрега, кликните овде да бисте добили узорак

1. Представљање

Технологија културе животињских ћелија је прво коришћена за производњу антигена вируса у производњи вакцине, али су у новије време платформе за производњу бактерија или квасца за рекомбинантне протеине промењене и на ћелијске системе сисара [1, 2]. У оба контекста важне су ћелије бубрега беба хрчака (БХК), које потичу од сиријског златног хрчка (Месоцрицетус ауратус). Првобитно, БХК ћелије су биле адхезивно растуће, сидрено зависне ћелијске линије сисара са обрасцем раста фибробласта у стандардним условима ћелијске културе укључујући фетални говеђи серум (ФБС) [3, 4]. Прилагођавање адхерентних БХК ћелија насуспензијараст у медијуму без серума у ​​комбинацији са условима културе великих размера је прича о успеху за производњу рекомбинантних протеина (нпр. фактор ВИИИ) са високим приносима [1, 2]. Штавише, БХК ћелије су осетљиве на широк спектар вируса, укључујући вирус слинавке и шапа (ФМД) [5]. Да би се задовољила све већа потражња за вакцинама против ФМД-а у многим деловима света, велике количине антигена се морају производити што је јефтиније могуће, што је могуће постићи повећањем густине одрживих ћелија на ћелијској страни и смањењем трошкова кроз поједностављење претходног и низводног процеса. антигена на страни производње [6]. Медији без животињских компоненти (АЦФМ) смањују ризик од контаминације случајним агенсима и додатно поједностављују процес када се серум не мора додавати [6, 7]. Међутим, адаптација ћелија да расту у суспензији без серума иу АЦФМ је дуготрајан и постепен процес [6, 8]. БХК ћелије лако достижу густину ћелија од 3,5×106 ћелија/мЛ у суспензији, али адаптација увек носи ризик од развоја нежељених ћелијских својстава у поређењу са почетном популацијом што може резултирати лошим перформансама раста, недовољним приносом специфичним за ћелије или туморогеним својствима. [5, 7]. Заузврат, промене у ћелијама могу довести до неочекиваних варијанти вируса током процеса културне адаптације. Посебно за производњу антигена вакцине, промена карактеристика вируса и антигености је веома непожељна. БХК ћелије се већ разликују по својој осетљивости и могућности да пропагирају одређене сојеве вируса ФМДВ [9]. Очигледно је да ће промена од раста фибробласта који зависи од сидрења путем агрегације и формирања сфероида до ћелија које расту независно у суспензији бити праћене значајним променама у самој ћелији [4, 6]. Губитак интегринске сигнализације услед прекида контакта екстрацелуларног матрикса и ћелије доводи до промена у експресији мембранских протеина и у организацији актинског цитоскелета који је важан прималац сигнализације посредоване интегрином [6, 10]. У исто време, ови интегрини играју важну улогу у инфекцији ФМДВ јер су рецептор за ФМДВ у природном домаћину и примарни рецептор у ћелијској култури [11].

Дубље разумевање ћелијских разлика између адхерентно растућих ХК ћелија и ћелија усуспензијаотвориће нове могућности за ћелијски инжењеринг и поједноставити избор одговарајућих ћелијских клонова за производњу антигена вакцине.

У овој студији, адхерентно растуће БХК ћелије и прилагођене АЦФМсуспензијаБХК ћелије су испитиване с обзиром на експресију ћелијских рецептора као што су интегрини и хепаран сулфати (ХС), њихову способност да представе протеине на површини ћелије и организацију ћелијског актинског скелета. Анализе транскриптома и кинетика раста пружају информације о разноликости тестираних БХК ћелијских линија.

цистанцхе може хранити бубреге и побољшати функцију бубрега

2. Материјал и методе

2.1 Ћелијске линије и ћелијска култура

Главне коришћене ћелијске линије су биле две адхерентне БХК-21 клонове 13 деривата (из Америцан Типе Цултуре Цоллецтион [АТЦЦ] ЦЦЛ-10, који се чувају као ЦЦЛВ-РИЕ 164 и 179 у Збирци ћелијских линија у ветеринарској медицини , Фриедрицх-Лоеффлер-Институт, Грајфсвалд, Немачка; укратко: БХК164 или БХК179) исуспензијаћелијске линије БХК21Ц13-2П (БХК-2П) које обезбеђује Европска колекција провјерених ћелијских култура (ЕЦАЦЦ; 84111301) и БХК-ИнВитрус (БХК-ИнВ, такође се назива и „линија #8“ као у нашој ранијој публикацији [12]; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, САД).

За кинетику раста додатно су коришћене следеће ћелијске линије: БХК-2П одржаван или у минималном основном медијуму у Глазгову (ГМЕМ) са 10 процената ФБС („линија #2“) или прилагођен АЦФМ Целлвенто™ БХК200 ( Мерцк КГаА, Дармстадт, Немачка) у два различита процеса (линије #4 и #5), плус четири другасуспензијаћелијске линије: БХК21Ц13 прилагођена расту усуспензијапостепеним повлачењем серума (линија #3), БХК21-Ц (ред #6), БХК21-Хектор (ред #7) и производног БХК (линија #9) [12]. Све ове ћелије обезбедио је Мерцк КГаА.

Све БХК-21 ћелије коришћене у студији су на крају изведене из ћелијске линије 13 клона БХК-21 Мацпхерсона и Стокера [13]. Термин "ћелијска линија" се користи слободно; нису све од једанаест БХК-21 линија описаних у овој студији заиста различите ћелијске линије, а не деривати култивисани у различитим условима. Ради лакшег сналажења, нумерација редова је у складу са нумерацијом у нашој претходној публикацији [12].

Ћелијска линија #1 из претходне публикације није укључена у ову студију и стога се овај број не користи. Уместо тога, свака референца на БХК-2П ћелије у којој се не помињу бројеви редова #2, #4 или #5 односи се на главногсуспензијаћелијска линија БХК21Ц13-2П (ЕЦАЦЦ84111301) представљена на почетку овог одељка.

Ћелијске линије јајника кинеског хрчка (Црицетулус грисеус) (ЦХО) ЦХО-К1 (АТЦЦЦЦЛ-61, држане као ЦЦЛВ-РИЕ 134) и ЦХО677 (ЦРЛ 2244, држе се као ЦЦЛВ-РИЕ 1524) као и ИБ-РС Коришћене су ћелије -2 (Институто Биоло´гицо-Рим Суı´но-2, држан као ЦЦЛВ-РИЕ 103) и ћелије говеђег бубрега Мадин-Дарби (укратко: МДБК, одржан као ЦЦЛВ-РИЕ261) као контроле у ​​експериментима проточне цитометрије.

Услови узгоја били су 37 ˚Ц, 5 процената ЦО2 и форсуспензијаћелије 320 о/мин у ТубеСпин биореакторима (ТПП Тецхно Пластиц Продуцтс АГ, Трасадинген, Швајцарска) при 80 процената релативне влажности. Све адхерентне ћелијске линије су култивисане у Минимум Ессентиал Медиум Еагле (МЕМ) са додатком Ханксове и Еарлеове соли (Сигма-Алдрицх) са 10 процената ФБС. Све ћелијске линије суспензије су прилагођене да расту у медијуму Целлвенто™ БХК200 (Мерцк КГаА) осим ћелијске линије #2, која је култивисана као што је горе описано.

Мерења густине и виталности ћелија вршена су коришћењем трипан плавог (Био-Рад, Херцулес, Калифорнија, САД) и аутоматског бројача ћелија (модел ТЦ20, Био-Рад).

2.2 Анализа криве раста ћелија суспензије

Анализе криве раста су спроведене као групни експерименти, изведени у дупликатима, два пута појединачно, са густином засејавања од 0.6×106 ћелија/мЛ. Густина одрживих ћелија (ВЦД) и виталност у процентима мерени су дневно до шест дана након инокулације ћелија.

Прорачуни специфични за ћелију су изведени према једначинама датим од стране [14]:

Кс: ВЦД (по мл); т: временске тачке узорковања (сат); н и н-1: две узастопне тачке узорковања.

Број ћелијске дивизије (цд):

2.3 Проточна цитометрија

Проточне цитометријске анализе су обављене помоћу инструмента за проточну цитометрију ФАЦСЦанто ИИ (БД Биосциенцес, Окфорд, УК). Остаци ћелија су изоловани на основу шаблона распршења напред и бочно. За бојење актином, средњи интензитет флуоресценције у Алека 488 каналу је директно мерен. За све мрље антитела, проценат Алека 488 или ПЕ-позитивних ћелија је одређен помоћу интервалне капије чија је доња граница постављена на основу контроле изотипа. Сви експерименти су изведени три пута независно.

2.3.1 Бојење антителом рецептора на површини ћелије.

површине. МДБК ћелије су служиле као позитивна контрола за експресију в 3, ИБ-РС-2 ћелије су служиле као позитивна контрола за експресију в 8, а ЦХО-К1 ћелије су служиле као позитивна контрола за експресију ХС . ЦХО677 ћелије не експримирају ниједан од тестираних интегрина нити ХС и стога су служиле као негативна контрола у свим експериментима. Коришћена су следећа антитела: за в 3, ПЕ-коњуговани клон ЛМ609 (разблажење 1:20) (мАб1976Х, Мерцк КГаА); за в 8, примарно антитело 11Е8, клон 68, мишји ИгГ2а (разблаживање 1:100) (љубазно обезбедио др. Степхен Нисхимура) са секундарним антителом козјег анти-мишјег ИгГ2а (разблаживање 1:1000) коњугованим са Алека Флуор Тхермо 488 (разблаживање 1:1000) ); за ХС, клон 10Е4, мишји ИгМ (разблаживање 1:200) (Амсбио, Абингдон, УК) са секундарним антителом козјег анти-мишјег му ланца ИгМ (разблаживање 1:2000) коњугованим са Алека Флуор 488 (аб150121, Абцам, УК), Кембриџ . У сваком експерименту коришћено је само једно примарно антитело.

Суспензиране ћелије су испране физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС). Адхерентне ћелије су одвојене коришћењем 10 мМ ЕДТА у ПБС и затим испране са ПБС. Након испирања, ћелије су филтриране кроз цедиљку за ћелије (најлонска мрежа, пречник пора 70 μм, ВВР, Раднор, САД) да би се уклониле накупине ћелија и подешене су на 1×106 ћелија/мЛ пре 1 μЛ ЛИВЕ/ ДЕАД ФикаблеВиолет мрља мртвих ћелија (Тхермо Фисхер Сциентифиц) додата је у 1 мЛ ћелијске суспензије током 30 минута. Овај корак и сви следећи кораци су изведени заштићени од светлости и на 4 ˚Ц. Примарно антитело је инкубирано 30 минута, а секундарно антитело је инкубирано 20-30 минута. Корак испирања са 2 мЛ ФАЦС пуфера (ПБС, 0,1 проценат натријум азида, 0,1 проценат БСА) и центрифугирање на 300 × г, 5 мин, 4 ˚Ц изведен је након свих корака. Коначно, обојене ћелије су ресуспендоване у 300 μЛ ФАЦС пуфера.

2.3.2 Бојење актином.

Филаментни актин је обојен коришћењем Пхаллоидин-иФлуор 488 реагенса (аб176753, Абцам), припремљеног према подацима. БХК179, БХК-2П и БХК-ИнВ ћелије су одвојене као што је горе описано и фиксиране са 4 процента формалдехида током 20 минута на собној температури (РТ). Ћелије су испране два пута са ПБС и 1×106 фиксних ћелија су пермеабилизоване са 0,1 процентом Тритон Кс-100 (Сигма-Алдрицх) у ПБС, након чега је уследила инкубација на собној температури током 3 минута. Ћелије су испране два пута са ПБС (центрифугирање на 300 × г, 5 мин) пре додавања припремљеног основног раствора фалоидина, разблаженог 1:1000 у ФАЦС пуферу и инкубиране 20 минута на СТ. На крају, ћелије су два пута испране ФАЦС пуфером и ресуспендоване у 300 μЛ ФАЦС пуфера. Обојене ћелије су директно анализиране флуоресцентним микроскопом и коришћене за ФАЦС анализу.

2.3.3 Експерименти трансфекције.

БХК164 и БХК-2П ћелије су трансфектоване или са ЕГФП-Н1, плазмидом који експримира појачани зелени флуоресцентни протеин (ЕГФП) (Цлонтецх), или у другој серији експеримената са пВСВ-Г, плазмидом који експримира Г протеин везикуларног стоматитис Индиана вирус (ВСВ), користећи Липофецтамине 3000 (Тхермо Фисхер Сциентифиц) према упутствима произвођача. Укратко, 2 уг плазмидне ДНК и 1,875 μЛ или 3,75 μЛ липофектамина разблаженог у медијуму Целлвенто™ БХК200 су помешани и инкубирани на собној температури 20 минута да би се омогућило формирање комплекса. Након тога, ове смеше су пренете у ћелије у12-плочама са бунарима (приближно 4×105 ћелија/мЛ) и медијум је додан до 200 μЛ. Ћелије су инкубиране на 37 ˚Ц током 24 х.

За ФАЦС анализу, цео садржај бунара је сакупљен након 24 х. Ћелије трансфициране пЕГФП-ом су испране три пута са ПБС-ом и ресуспендоване у 300 μЛ ФАЦС пуферу. Један дупликат пВСВ-Г-трансфектованих ћелија је пермеабилизован са ПБС са 0,1 процента (в/в) ТритонКс-100 током 5 минута на собној температури пре бојења антителом, док је други остао не-пермеабилизован. Бојење антитела је изведено као што је горе описано са поликлоналним зечјим серумом ВСВ 274/Е (разблаживање 1:500, љубазно обезбедио др Стефан Финке) и секундарним антителом козјим анти-зечјим (Х плус Л) коњугованим са Алека Флуор 488 (разблаживање 1: 1000; Тхермо Фисхер Сциентифиц).

2.4 Статистичка анализа

Подаци су анализирани коришћењем ГрапхПад Присм верзије 07.04 за Виндовс (ГрапхПад Софтваре, Ла Јолла, САД). Уобичајена једносмерна анализа варијансе је урађена са Тукеи-јевим пост-хоттестом да би се процениле разлике између третираних група. Праг статистичке значајности је постављен на п-вредност од 0,001.

2.5 Анализа транскриптома

2.5.1 Екстракција РНК, припрема библиотеке и секвенцирање.

Три независне серије сваке од адхерентних БХК179 ћелијских линија и БХК-2П и БХК-ИнВ суспензијских ћелијских линија су коришћене за анализу транскриптома. У просеку, 8,3×105 БХК179 ћелија, 1,6×107 БХК-2П ћелија и 1,4×107 БХК-ИнВ ћелија је лизирано у ТРИзол реагенсу (Тхермо Фисхер Сциентифиц). После додавања 0,2 запремине трихлорометана у ћелијски лизат, инкубације и центрифугирања, водена фаза је сакупљена и помешана са једном запремином 100% етанола. Из овога, укупна РНК је екстрахована коришћењем РНеаси Мини Кит (Киаген, Хилден, Немачка) са варењем ДНазе на колони са РНасе-Фрее ДНасе Сетом (Киаген) према упутствима произвођача. ЕРЦЦ РНА Спике-Ин Мик 1 (Тхермо Фисхер Сциентифиц) је додат и коришћен као интерна контрола за све следеће кораке. Затим је полиаденилована мРНА изолована из 1–3 уг висококвалитетне укупне РНК коришћењем Динабеадс мРНА ДИРЕЦТ Мицро комплета (ТхермоФисхер Сциентифиц). мРНА је затим фрагментирана и коришћена за синтезу цДНК и припрему библиотеке коришћењем комплета за припрему узорака ТруСек Страндед мРНА ЛТ (Иллумина, Сан Дијего, САД) према упутствима произвођача. Секвенцирање је обављено на Хеинрицх-Петте-Институт, Хамбург, користећи НектСек 500 (2к75 бп) и ХиСек 4000 (1к50 бп) опрему (Иллумина).

2.5.2 Статистичка анализа диференцијалне експресије гена.

Провера квалитета сирових читања из сваке библиотеке секвенцирања је извршена коришћењем ФастКЦ (верзија {{0}}.11.9; Бабрахам Институте, Цамбридге, УК) са нагласком на дистрибуцију дужине читања и контаминацију адаптера пре и после адаптера сечење помоћу Трим Галоре (верзија 0.6.4_дев, Бабрахам Институте) и Цутадапт (верзија 2.10) [15]. Користећи Салмон [16], обрезани необрађени очити су затим квази мапирани у геном сиријског златног хрчка.

Укратко, референце генома и транскрипта ГЦФ{{0}}.1_МесАур1.0 су добијене од Националног центра за биотехнолошке информације (НЦБИ) и комбиноване са референтним секвенцама ЕРЦЦ спике- у контролама. Конструисан је индекс транскриптома који је свестан мамаца [17] да би се омогућило селективно усклађивање са лососом. За квантификацију, коришћено је десет реплика за покретање и омогућена је компензација за пристрасности специфичне за секвенцу, ГЦ пристрасност и 5' или 3' позициону пристрасност.

Након тога, квантификациони подаци за ЕРЦЦ спике-ин контроле су у корелацији са њиховом теоретском концентрацијом, како би се открили проблеми током припреме узорка.

Штавише, подаци квантификације специфични за ген су првобитно филтрирани (само гени који се појављују у више од једне реплике са преко 15 бројања), нормализовани коришћењем регуларизоване лог трансформације (рлог) и коришћени за истраживачку анализу података, нпр. са ПЦА. Диференцијално експримирани гени су идентификовани и касније коришћени за анализу пута помоћу ДЕСек2 [18]. Подаци о експресији су анализирани за значајно различито експримиране гене између парова ћелијских линија БХК-2П и БХК179, БХК-ИнВ и БХК-2П и БХК-ИнВ и БХК179. Након тога, резултујућа бинарна логаритамска (лог2) промена нагиба је прилагођена коришћењем функција "лфцСхринк" и "апглм" у ДЕСек2 да би се компензовао низак или променљив број читања који може довести до прецењивања варијансе [19].

Критеријуми за значајно другачије експримирани ген су постављени на максималну прилагођену вредност {{0}}.05 и минималну апсолутну вредност смањене лог2 пута промене од 1. Путања и критеријуми за значајно другачије експримиран ген постављени су на максималну прилагођену вредност од 0,05 и минималну апсолутну вредност смањења лог2 пута промене од 1. Анализа путање и обогаћивања је спроведена коришћењем функције „обогати“ у профилу кластера (верзија 3.16.0).

цистанцхе може хранити бубреге и побољшати функцију бубрега

3. Резултати

3.1 Осетљивост ћелијске линије на ФМДВ је независна од њене индивидуалне стопе раста и броја деобе ћелије

Експерименти серије са девет различитих БХК суспензијских ћелијских линија су спроведени током периода од шест дана и свакодневно су мерени густина одрживих ћелија (ВЦД) и виталност. На основу претходних запажања да су се ћелијске линије разликовале по својој осетљивости на серотип ФМДВ Асиа{{0}} [12], испитано је да ли су повећани ћелијски метаболизам и стопа раста повезани са смањеном осетљивошћу на инфекцију овим вирус (табела 1). Две од три подложне БХК суспензијске ћелијске линије су ћелије које полако расту са малим бројем деобе ћелија (цд) од 0.60 (#3) и 0.70 (#9), док трећа осетљива ћелијска линија (#8) има највећа стопа раста и цд (μ=0.035, цд=1.62) међу свим тестираним ћелијским линијама.

Повлачење серума и адаптација на раст у АЦФМ нису утицали на осетљивост на ФМДВ у нашем скупу испитиваних ћелијских линија. Ћелијска линија #2 је споро растући, од серума зависан прекурсор БХК-2П ћелијских линија, одржаван у суспензији са ГМЕМ са феталним говеђим серумом. Током адаптације на раст у АЦФМ, ћелије су одабране за висок ВЦД, повезан са високом стопом раста и цд. Као и главна БХК-2П ћелијска линија коришћена за студију, ћелијске линије #4 и #5 су такође изведене из ћелијске линије #2, али се разликују по начину прилагођавања на АЦФМ. Све БХК-2П ћелијске линије одржаване у АЦФМ показале су веома сличан профил раста. Ниједна од ових ћелија током адаптације на АЦФМ није стекла осетљивост на ФМДВ серотип Асиа-1, вероватно зато што је оригинална линија #2 већ била отпорна. Слично, није примећена промена у осетљивости за ћелијску линију суспензије #3. Када су расле адхезивно (упореди ћелијску линију #1 у [12]), ћелије су биле осетљиве на ФМДВ Азија-1 и задржале су ову карактеристику током прилагођавања на раст у суспензији. Истовремено, они нису стекли профил брзог раста других ћелија суспензије.

3.2 Суспензиране ћелије имају мање примарних рецептора, али више секундарних рецептора за ФМДВ на својој површини него адхерентне БХК ћелије

Први корак да вирус успешно инфицира ћелију је везивање вирусне честице за молекуле рецептора на површини ћелије. Да би се анализирале разлике између адхерентно растућих БХК ћелија и БХК ћелија у суспензији, тестирана су антитела на ћелијске рецепторе укључене у интеракцију екстрацелуларног матрикса и за која је познато да играју важну улогу у инфекцији ФМДВ. Интегрини в 3 и в 8 су испитивани као репрезентативни ћелијски рецептори који препознају РГД (Арг-Гли-Асп) везујући мотив и ступају у интеракцију са компонентама серума и екстрацелуларним матриксом, али их ФМДВ такође користи као своје природне примарне рецепторе. Ниједна од тестираних ћелијских линија суспензије (БХК-ИнВ и БХК-2П) није експримирала интегрин в 3 или в 8 на површини ћелије. Док разлика између адхерентног БХК и суспензије БХК није била значајна за интегрин в 8 (слика 1б), значајно већи проценат адхерентног БХК179 је експримирао интегрин в 3 у поређењу са ћелијским линијама суспензије БХК-ИнВ и БХК-2П ( Слика 1а).

Високе количине ХС су биле представљене на површини обе суспензијске ћелијске линије. Експресија ХС је била веома дивергентна између реплицираних култура адхерентних БХК179 ћелија. У поређењу са ћелијским линијама суспензије, мање ћелија у културама БХК179 је било ХС-позитивно, иако разлика није била значајна на унапред одређеном нивоу значајности (слика 2).

Бојење и микроскопска анализа откриле су велике разлике у распореду актинског цитоскелета између адхерентних и суспензијских ћелија (слика 3). Актински филаменти у адхерентним ћелијама БХК179 су равномерно распоређени по целој ћелији у фином ретикуларном узорку (слика 3а), док су ћелије које расту у суспензији имале дифузно бојење актина (слика 3б). Занимљиво је да је количина филаментозног актина била различита између суспензијских ћелијских линија БХК-ИнВ и БХК-2П. Средњи флуоресцентни интензитет (МФИ) након бојења фалоидином био је значајно већи у БХК-ИнВ ћелијама у поређењу са БХК-2П, што указује на већи садржај филаментозног актина у овим ћелијама (слика 3ц).

3.3 Суспензиране ћелије се разликују по ефикасности трансфекције, али не и по способности приказивања површинских протеина

Због разлика у конформацији актина између адхерентних и суспензијских ћелија, ћелије су испитиване у погледу њихове преносивости и способности да презентују протеине на својој површини. Генерално, ефикасност трансфекције, мерена експресијом ЕГФП, смањена је у ћелијама суспензије (слика 4а). Када се користи мала доза реагенса за трансфекцију, значајно већи проценат адхерентних ћелија је експримирао ЕГФП у поређењу са ћелијама суспензије. Када је коришћена висока доза трансфекционог реагенса, већи проценат ћелија суспензије је успешно трансфектован, иако разлика између високих и ниских доза није била значајна. Да би се одговорило на питање да ли су ћелије суспензије и даље у стању да представе протеине као што су ћелијски рецептори на својој површини, ћелије су трансфектоване плазмидом који кодира ВСВ Г протеин (слика 4б). Једна серија ћелија је пермеабилизована пре бојења да би се узела у обзир могућност да је Г протеин експримиран, али није приказан на површини ћелије. Није било значајне разлике у способности експресије и презентовања ВСВ Г протеина између адхерентних и суспендованих ћелија, нити када се користи ниска или висока доза трансфекционог реагенса.

3.4 Анализа транскриптома открива разлике у експресији гена повезаних са екстрацелуларним матриксом између ћелија суспензије

Урађена је анализа транскриптома да би се даље истражиле разлике између адхерентно растућих БХК ћелија и БХК ћелија у суспензији и да би се разјаснило зашто се ћелије суспензије разликују по својој осетљивости на ФМДВ. Адхерентна БХК ћелијска линија (БХК179) култивисана у МЕМ са додатком ФБС, као и брзорастућа ћелијска линија осетљива на ФМДВ (БХК-ИнВ) и брзорастућа ћелијска линија отпорна (БХК-2П), обе прилагођени АЦФМ-у, изабрани су за анализу.

Анализа главних компоненти (ПЦА) истакла је блиску везу између биолошких реплика појединачних ћелијских линија (слика 5а). Све реплике исте ћелијске линије налазе се блиско једна уз другу на дијаграму са мало назнака ефеката серије до серије. Прва главна компонента (која чини 81 проценат варијансе у нормализованом скупу података) је тумачена као разлика у транскрипцији између ћелија које расту у суспензији и ћелија које расту у адхеренцији, док је друга главна компонента (15 процената варијансе) представљала разлику између суспензије ћелијске линије БХК-2П и БХК-ИнВ, вероватно повезане са осетљивошћу на инфекцију ФМДВ. Заједно, прве две главне компоненте биле су у стању да објасне 96 процената варијансе пронађене унутар скупа података, што указује да је анализа транскриптома идентификовала релевантне разлике између три ћелијске линије.

Најмањи број различито експримираних гена пронађен је када се упореди БХК-ИнВ са БХК-2П (590 навише; 304 на ниже). Слични бројеви су виђени у поређењу или БХК-2П или БХК-ИнВ појединачно са БХК179 (1527 и 1519 регулисано навише; 1308 и 943 регулисано наниже, респективно) (слика 5б). Када су две суспензијске ћелијске линије (БХК-ИнВ и БХК-2П) комбиноване и упоређене са адхерентном ћелијском линијом БХК179, 1814 гена је различито експримирано. Док је 411 гена искључиво различито изражено када се упореди БХК179 са БХК-ИнВ, скоро двоструко више (701 ген) је искључиво различито изражено између БХК179 и БХК-2П. Између две суспензијске ћелијске линије, само 104 гена су била искључиво различито изражена.

Када се упореди скуп различито експримираних гена ћелијских линија осетљивих на ФМДВ БХК179 и БХК-ИнВ са ћелијском линијом БХК-2П отпорном на ФМДВ, утврђено је да је подскуп од 553 гена различито изражен у оба поређења ( Слика 5ц). Пошто ови гени могу бити укључени у осетљивост на ФМДВ, спроведена је анализа обогаћивања термина ГО и открила је да су многи од ових гена повезани са ћелијским компонентама екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ), ћелијским мембранама и спојевима ћелија-ћелија (слика 5д) .

Пошто смо приметили разлике између ћелијских линија у вези са ЕЦМ интеракцијама, транскриптом је поново анализиран са фокусом на експресију интегрина в 1, в 3, в 6, в 8, као и актина, који су сви потенцијално релевантни за осетљивост на инфекцију ФМДВ (Слика 5е). Са изузетком АЦТА2, није било значајне разлике у експресији гена повезаних са актином између БХК-ИнВ и БХК-2П ћелија на нивоу мРНА. Нормализовани број гена за све испитиване гене повезане са актином био је значајно већи у адхерентној ћелијској линији БХК179 него у ћелијским линијама суспензије (С1 слика).

Све три ћелијске линије су испољиле сличне количине ИТГАВ транскрипата, кодирајући за подјединицу интегрина в, али су показале диференцијалну експресију за подјединице интегрина. Детаљније, ћелијске линије суспензије БХК-2П и БХК-ИнВ су експримирале значајно мање ИТГБ1, ИТГБ3 и ИТГБ6 у поређењу са адхерентном ћелијском линијом БХК179. ИТГБ3 и ИТГБ8 су значајно различито експримирани између суспензијских ћелијских линија БХК-2П и БХК-ИнВ. Занимљиво је да је ИТГБ8 био једини кодирајући ген интегринске подјединице који је био високо експримиран у обе ћелијске линије БХК179 и БХК-ИнВ осетљиве на ФМДВ у поређењу са ћелијском линијом БХК-2П отпорном на ФМДВ (слика 5е).

цистанцхе може хранити бубреге и побољшати функцију бубрега

4. Дискусија

Адаптација ћелија да расту у суспензији и у медијумима без серума је дуготрајан и постепен, али неопходан процес у биотехнологији за стварање ћелијских линија високог приноса које се користе за производњу антитела, антигена вакцине или других протеина [1, 8 ]. Заиста, овај процес је увек испуњен ризиком да ћелије стекну нежељена својства у поређењу са оригиналним ћелијским материјалом [7]. У случају производње антигена вакцине, осетљивост ћелијске линије на циљни вирус је од велике важности. За вирус слинавке и шапа (ФМДВ), добро је познат феномен да су одређене БХК ћелијске линије отпорне на инфекцију или губе своју осетљивост током поновљене субкултуре [20–22]. Поред тога, антигена својства вируса могу бити променљива у зависности од ћелије домаћина [9].

Суспензиране ћелије расту независно од површине и прекривене су хранљивим медијима богатим кисеоником, омогућавајући им да брзо расту. Брзо умножавање ћелија је неопходна карактеристика да се култура лако и за кратко време повећа на велике количине. Уклањање серума из медијума је неопходно да би се смањили трошкови, ризик од контаминације и да би се поједноставили процеси смањивања нивоа [23, 24].

Анализа серијског раста различитих ћелијских линија суспензије БХК имала је за циљ да утврди да ли је селекција према брзорастућој ћелијској популацији у условима без серума штетна за размножавање ФМДВ. У ствари, две од три осетљиве ћелијске линије су расле споро, али је утврђено да је њихова осетљивост на ФМДВ независна од њиховог метаболизма раста. Вероватније је да је осетљивост на ФМДВ већ изгубљена (или задржана) током почетне адаптације на раст у суспензији. Одвајање ћелија од површине и повлачење серума у ​​следећим корацима адаптације на раст суспензије доводи до промене нивоа експресије површинских протеина и протеина укључених у цитоскелет [7].

Интегрини су важна породица рецептора на ћелијској површини који су интегрисани у ћелијску мембрану и посредују у сигнализацији ћелије до ћелије, као и снажну везу између ћелије и површине кроз везивање компоненти екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) [10, 25 ]. Регулација ћелијског циклуса, организација цитоскелета и транслокација нових рецепторских молекула у ћелијску мембрану зависе од интегрина [25]. За многе интегрине, везивање ЕЦМ-а, као и везивање лиганада обезбеђених ћелијама додавањем серума у ​​медијум културе, посредовано је РГД мотивом [6, 25] и вероватно ће се променити када ћелија прелази са адхерентног на раст у суспензији. Препознавање РГД мотива од стране интегрина такође користи ФМДВ за иницирање рецептором посредоване ендоцитозе вирусне честице [26]. РГД мотив у ВП1 ФМДВ је високо очуван [27], а интегрини в 1, в 3, в 6 и в 8 су познати рецептори које користи ФМДВ ин виво и ин витро [28–31]. Будући да наводне разлике у протеому ћелијске површине између адхерентних и суспензијских ћелија такође могу бити пресудне за разлике у осетљивости на инфекцију ФМДВ, антитела која се везују за интегрин в 3 и в 8 коришћена су за бојење адхерентне БХК ћелијске линије, као и осетљива и резистентна суспензија БХК ћелијске линије. Бојење в 6 није обављено јер је раније показано да овај интегрин није експримиран на површини БХК ћелија [32], иако се ИТГБ6 мРНА може детектовати. Слично томе, упркос високом нивоу експресије мРНА ИТГБ8 откривеном у БХК179 и БХК-ИнВ ћелијама, чини се да в 8 интегрин уопште није присутан на површини БХК ћелија. Интегрин в 3 је пронађен у мањем степену на адхерентној ћелијској линији, али не и на ћелијским линијама суспензије.

Осим интегрина, везивање лиганда, догађаји интернализације и интрацелуларна сигнализација могу бити посредовани протеогликанима хепаран сулфата (ХС) [33], а стицање ХС као секундарног рецептора се често примећује након поновљеног пасирања ФМДВ у култури [34]. Специфично бојење антитела открило је обиље ХС на обе ћелијске линије суспензије иу мањој мери и на адхерентним БХК ћелијама. Познато је да мутације у геному ФМДВ, које доводе до промена у вирусним капсидним протеинима да би се омогућило коришћење ХС као рецептора, ослабе вирус у природном домаћину [35]. Доступност ХС би стога могла бити кључни фактор за промену антигености независности ФМДВ ћелијске линије на коју је вирус прилагођен.

Пошто је одвајање ћелија повезано са променама у контрактилном механизму актин-миозин [7] и култивисање ћелија у суспензији доноси различите захтеве за преживљавање, нпр. отпорност на велики смичући стрес услед агитације течности културе [6], актински скелет је био од великог интересовања за ову студију. Микроскопска анализа је открила конформационо преуређење цитоскелета од ретикуларне дистрибуције у прилепљеним растућим ћелијама до густе сферне структуре у условима суспензије. Ово би могао бити механизам прилагођавања горе поменутом великом напону на смицање и такође је познато да се јавља у ЦХО ћелијама у истим условима [6]. Али такође је вредно напоменути да иако није било значајне разлике у експресији већине актинских гена између БХК-ИнВ и БХК-2П ћелија на нивоу мРНА, значајно више филаментозног актинског протеина је откривено у БХК осетљивом на ФМДВ -ИнВ него у БХК-2П. Ово може бити повезано са различитим брзинама полимеризације глобуларног актина у филаментни актин.

Барем у адхерентним ћелијама, улазак ФМДВ зависи од динамике актина. Улазак вируса изазива наборе актина и поремећај мреже актинских филамената кроз конверзију филаментозног актина у глобуларни актин је описан у раној фази инфекције [36–38]. Судећи по цитопатском ефекту (ЦПЕ) који се види у адхерентним БХК ћелијама када је инфициран ФМДВ, цитоскелет пролази кроз интензивне реаранжмане у многим својим компонентама [38]. Такав ЦПЕ се не види у ћелијама суспензије због њиховог већ сферног облика, али повишен садржај актина може дати одређену предност вирусу. Због разлика у актинском цитоскелету, експерименти трансфекције су спроведени да би се упоредила ефикасност трансфекције између суспензије и адхерентног БХК-а и да би се утврдило да ли густи цитоскелет ћелија суспензије омета презентацију протеина на површини ћелије. Опште је познато да је ћелијске линије суспензије веома тешко трансфектовати, што је узроковано смањеним везивањем трансфекционог комплекса за ћелијску мембрану и последично смањеним уносом ДНК корисног оптерећења [39]. То су потврдили и наши експерименти. Али иако је ефикасност трансфекције смањена у БХК-2П ћелијама у поређењу са адхерентном БХК ћелијском линијом, није било разлике у способности приказивања трансфицираног ВСВ Г протеина на површини ћелије. Примећена је разлика у проценту обојених ћелија између експресионих плазмида пЕГФП-Н1 и пВСВ-Г у БХК-2П ћелијама. Ово није даље истраживано, али може бити узроковано различитим границама детекције између имунофлуоресцентног бојења коришћеног за визуелизацију ВСВ-Г и урођене флуоресценције ЕГФП-а.

На крају, извршена је анализа транскриптома да би се дало више информација о транскрипционим разликама између адхерентних и суспендованих БХК ћелија с једне стране и између БХК ћелијских линија осетљивих на ФМДВ и отпорних на ФМДВ, с друге стране. Наши резултати су у складу са другим студијама транскриптомских промена у ЦХО, МДЦК или ХЕК ћелијама током преласка са адхерентног на раст у суспензији. Уопштено говорећи, већина промена се односи на структуру цитоскелета, ћелијски метаболизам и интеракције компоненти ЕЦМ и појачане су за ћелије суспензије [7, 40, 41]. Изненађујуће, ћелије суспензије БХК-2П отпорне на ФМДВ показале су смањену регулацију ових генских скупова, што би такође могло да објасни смањене нивое актина у БХК-2П у поређењу са БХК-ИнВ ћелијама. Специфична анализа експресије интегринске подјединице открила је сличне нивое транскрипата интегринске подјединице В у све три ћелијске линије. Највећа експресија у свим ћелијским линијама пронађена је за подјединицу интегрина 1. Важно је напоменути да интегрин 1 може да формира хетеродимере са десет различитих ланаца и да је конститутивно експримиран у већини ћелија сисара [6, 42]. Слично, В подјединица је у стању да формира хетеродимер са пет различитих ланаца, али 6 и 8 су само представљени на површини ћелије у комбинацији са В [42]. Ово се тачно одражава у уоченом обиљу транскрипата појединачних подјединица интегрина. Повишена транскрипција 3 у адхерентним ћелијама такође добро корелира са вишим сигналом за интегрин в 3 у експериментима бојења антитела. С друге стране, уочене разлике у нивоима мРНА ИТГБ3 и ИТГБ8 између БХК-2П и БХК-ИнВ нису се одразиле на површинско бојење. Нисмо били у могућности да решимо да ли је то само због различите осетљивости између метода квантификације мРНК и протеина или указује на пост-транскрипциони блок експресије протеина или површинске презентације [43]. Све у свему, ћелијске линије суспензије БХК-2П и БХК-ИнВ су експримирале значајно мање ИТГБ1, ИТГБ3 и ИТГБ6 мРНА у поређењу са адхерентном ћелијском линијом.

5. ЗакључциИн

У закључку, од критичне је важности у припреми ћелија суспензије да се користи клон родитељске ћелије са добро познатим карактеристикама и да се резултујућа ћелијска популација пажљиво прегледа током процеса адаптације како би се осигурало да ћелијска линија задржи основне карактеристике, у овом случају , осетљивост на ФМДВ. Поред тога, савремене методе као што су ФАЦС анализа и транскриптомика треба да се користе за даљу карактеризацију производних ћелијских линија.

цистанцхе може хранити бубреге и побољшати функцију бубрега

Признања

Захваљујемо се Патрицку Зитзов-у на одличној техничкој подршци.

Прилози аутора

Концептуализација:Вероника Дилл, Мицхаел Есцхбаумер.

Формална анализа:Вероника Дилл, Флориан Пфафф.

Финансијска аквизиција:Алине Зиммер, Мартин Беер.

истрага:Вероника Дилл.

Методологија:Вероника Дилл, Флориан Пфафф, Мицхаел Есцхбаумер.

Администрација пројекта:Мартин Беер.Ресоурцес: Алине Зиммер.

Надзор:Мицхаел Есцхбаумер.

Визуелизација:Вероника Дилл, Флориан Пфафф, Мицхаел Есцхбаумер.

Писање – оригинална верзија:Вероника Дилл.

Писање – преглед и уређивање:Вероника Дилл, Флориан Пфафф, Алине Зиммер, Мартин Беер, Мицхаел Есцхбаумер.

Референце

1. Мертен ОВ. Напредак у култури ћелија: зависност од сидрења. Пхилос Транс Р Соц Лонд Б Биол Сци.2015; 370(1661):20140040.

2. Дингерманн Т. Рекомбинантни терапеутски протеини: производне платформе и изазови. Биотецхнол Ј.2008; 3(1):90–7.

3. Хернандез Р, Бровн ДТ. Раст и одржавање ћелија бубрега хрчка (БХК). Цурр ПротоцМицробиол. 2010; Поглавље 4: Додатак 4Х. мца04хс17 ПМИД: 20440683

4. Цруз ХЈ, Мореира ЈЛ, Стацеи Г, Диас ЕМ, Хаиес К, Лооби Д, ет ал. Адаптација БХК ћелија које производе рекомбинантни протеин на медијум без серума и медијум без протеина. Цитотецхнологи. 1998; 26(1):59–64.

5. Гускеи ЛЕ, Јенкин ХМ. Адаптација БХК-21 ћелија на раст у шејкер култури и накнадни изазов вирусом јапанског енцефалитиса. Аппл Мицробиол. 1975; 30(3):433–8. хттпс://дои.орг/10.1128/ам. 30.3.433-438.1975 ПМИД: 1237269

6. Валтхер ЦГ, Вхитфиелд Р, Јамес ДЦ. Важност интеракције између цитоскелета интегрина и актина у адаптацији суспензије ЦХО ћелија. Аппл Биоцхем Биотецхнол. 2016; 178(7):1286–302.

7. Клуге С, Бенндорф Д, Гензел И, Сцхарфенберг К, Рапп Е, Реицхл У. Праћење промена у протеому током постепене адаптације МДЦК ћелијске линије од адхеренције до раста у суспензији. Вакцина. 2015; 33(35):4269–80.

8. Цоста АР, Витхерс Ј, Родригуес МЕ, МцЛоугхлин Н, Хенрикуес М, Оливеира Р, ет ал. Утицај адаптације ћелија на услове без серума на профил гликозилације моноклонског антитела произведеног од ћелија јајника кинеског хрчка. Н Биотецхнол. 2013; 30(5):563–72. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.нбт.2012.12. 002 ПМИД:23247406

9. Болвелл Ц, Бровн АЛ, Барнетт ПВ, Цампбелл РО, Цларке БЕ, Парри НР, ет ал. Селекција ћелије домаћина антигенских варијанти вируса слинавке и шапа. Ј Ген Вирол. 1989; 70 (Пт 1): 45–57.

10. Виеснер С, Легате КР, Фасслер Р. Интеракције интегрин-актин. Целл Мол Лифе Сци. 2005; 62(10):1081–99.

11. О'Доннелл В, Пацхецо ЈМ, Грегг Д, Бакт Б. Анализа експресије интегринског рецептора вируса слинавке и шапа у ткивима наивних и инфицираних говеда. Ј Цомп Патхол. 2009; 141(2–3):98–112. ПМИД: 19515380

12. Дилл В, Хоффманн Б, Зиммер А, Беер М, Есцхбаумер М. Адаптација ФМДВ Азије-1 на културу суспензије: ћелијска резистенција је превазиђена променама капсида вируса. Вируси. 2017; 9(8). хттпс://дои.орг/10. 3390/в9080231 ПМИД:28820470

13. Мацпхерсон И, Стокер М. Трансформација полиома клонова ћелија хрчка — истраживање генетских фактора који утичу на ћелијску компетенцију. Вирологи. 1962; 16:147–51.

14. Роуроу С, ван дер Арк А, ван дер Велден Т, Каллел Х. Процес ћелијске културе микроносача за размножавање вируса беснила у Веро ћелијама узгајаним у биореактору са мешањем у условима потпуно без животињских компоненти. Вакцина. 2007; 25(19):3879–89.

15. Мартин М. Цутадапт уклања секвенце адаптера из секвенцирања високе пропусности. ЕМБнетјоурнал. 2011; 17:10–2.

16. Патро Р, Дуггал Г, Лове МИ, Иризарри РА, Кингсфорд Ц. Салмон пружа брзу квантификацију експресије транскрипта са свесном пристрасношћу. Нат Метходс. 2017; 14(4):417–9.

17. Сривастава А, Малик Л, Саркар Х, Закери М, Алмодареси Ф, Сонесон Ц, ет ал. Методологија поравнања и мапирања утиче на процену обиља транскрипта. Геноме Биол. 2020; 21(1):239.

18. Лове МИ, Хубер В, Андерс С. Умерена процена промене набора и дисперзије за РНА-сек податке са ДЕСек2. Геноме Биол. 2014; 15(12):550.

19. Зху А, Ибрахим ЈГ, Лове МИ. Претходне дистрибуције са тешким репом за податке о бројању секвенци: уклањање шума и очување великих разлика. Биоинформатика. 2019; 35(12):2084–92.

20. Цларке ЈБ, Спиер РЕ. Варијације у осетљивости БХК популација и клонираних ћелијских линија на три соја вируса слинавке и шапа. Арцх Вирол. 1980; 63(1):1–9.