Екстракт ћелијске културе Оенотхера Биеннис са активношћу против старења коже побољшава механичка својства ћелија

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Апстрактан:Старење коже је веома добро познат процес који доводи до постепеног погоршања механичких карактеристика коже услед опадања производње машинерије екстраћелијског матрикса и истовремене промене у процесу контракције. Да би се успорило ово напредовање, кључно је индуковати експресију неколико протеина способних да промовишу формирање еластичних влакана и поправку ткива. Овде је водени екстракт ћелијске културе Оенотхера би-Еннис истражен са хемијске тачке гледишта, а затим је тестиран ин витро, у ћелији и ин ек виво експериментима као помоћно средство у сузбијању старења коже. показало је да је екстракт Оенотхера биеннис био у стању, повећањем експресије МИЛК гена, да промовише контракцију матриксног колагена, полимеризацију актина и производњу есенцијалних ЕЦМ протеина.

Кључне речи:метаболомика; молекуларне мреже; хидрофилни екстракт ћелијских култура Оенотхера биеннис; контракција матриксног колагена; старење коже

1. Представљање

Старење коже је веома познат процес изазван ендогеним и егзогеним факторима. Током старења, све физиолошке функције коже неумољиво дегенеришу, а ово прогресивно погоршање оштећује кожу [1]. Заиста, кожа постепено губи своје механичке карактеристике, како због опадања производње протеина екстраћелијског матрикса, тако и због истовремене промене у процесу контракције [2]. Најважније компоненте екстраћелијског матрикса дермиса су протеини као што су колаген И и ИИл, ламинин, периостин, тенасцин, еластин, фибронектин и протеогликани, јер њихова релативна количина и стање савијања играју кључну улогу у интеракцији између ћелија и ћелије. матрикса, који гарантује одговарајућу текстуру дермиса [3]. На пример, у ванћелијском простору, фибронектин игра кључну улогу у склапању матрикса јер формира мост између рецептора ћелијске површине (нпр. интегрина) и колагена, протеогликана и других молекула фокалне адхезије. Ламинини доприносе структури екстрацелуларног матрикса и модулирају адхезију, диференцијацију, миграцију, стабилност фенотипа и отпорност на апоптозу. Еластин је такође важан за ћелијску адхезију и миграцију ћелија, а има способност да учествује у ћелијској сигнализацији. Фибрилини су на сличан начин у блиској интеракцији са тропоеластином и интегринима, а важни су за склапање еластина у еластична влакна. Фабулоус је чврсто повезан са базалним мембранама, еластичним влакнима и другим компонентама екстрацелуларног матрикса и учествује у формирању еластичних влакана. Тенасцини су полиморфни гликопротеини екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) који посредују у фиброзним процесима како би омогућили ефикасну поправку ткива [4]Поред тога, процес контрактилности коже је такође заснован на деловању фибробласта, најзаступљенијих ћелија у дермалном матриксу; они успостављају одговарајућу напетост коже, промовишући контакте између компоненти матрикса, које су заузврат одговорне за компактност, густину и отпорност дермиса. У основи њихове организације ћелијског цитоскелета налази се актин-миозин машинерија, која одређује потенцијалне промене у њиховом облику и структури. Заиста, везивање актина и миозина индукује компактнију ћелијску конформацију, зближавајући влакна, гарантујући развој здравог и компактног ткива и спречавајући дезинтеграцију влакана која резултира борама. Међутим, способност фибробласта да се скупља и растеже се делимично губи током година јер старе ћелије више нису у стању да делују исправно и потпуно. Због мање механичке силе, фибробласти иду у заобљенију и искривљенију морфологију од издужене [5]. Неки докази су показали да се током старења синтеза протеина званог МИЛК (киназа лаког ланца миозина) значајно смањила. МИЛК поседује активност киназе коју врши фосфорилација специфичног домена миозина, названог регулаторни лаки ланац миозина, који је у стању да индукује везивање актина и стога промовише контрактилност ћелије [6].биофлавоноидиКада је откривена ниска активност овог протеина, због, на пример, мање експресије протеина, мерено је одговарајуће смањење контракције матриксног колагена [7] и полимеризације актина [8]. Склоп актинског цитоскелета је повезан не само са кретањем ћелије и способношћу контракције, већ и са производњом ЕЦМ матриксног протеина кроз активацију ТГФ-ИИ рецептора (ТГФБРИИ)[9]. ТГФБРИИ припада ТГФ-ћелијском површинском рецепторском комплексу који, кроз активацију Смад транскрипционих фактора, регулише експресију многих гена који кодирају компоненте ЕЦМ, укључујући колаген, ламинине, фибронектин и протеогликан [10]. Демонтажа актинског цитоскелета смањује регулацију ТГФ-Ил рецептора. Ова регулација наниже, заузврат, смањује производњу колагена и других ЕЦМ протеина, што доводи до губитка дермалне масе и крхкости коже.

Заправо, многи козметички састојци имају за циљ да стимулишу синтезу неколико кључних фактора одговорних за одржавање правилне компактности дермалног матрикса и добре контракције коже. У овом сценарију, екстракти изведени из врсте Оенотхера биеннис (Енотхера биеннис), која припада породици Онаграцеае, су од великог интереса због свог садржаја биоактивних једињења као што су масне киселине, феноли, тритерпени и флавоноиди, који су већ познати. тестиран у лечењу различитих кожних патолошких обољења [11]. За неке од ових метаболита, заузврат, наводи се да потискују медијаторе упале као што су интерлеукин 1 (ИЛ-1), интерлеукин 6 (ИЛ-6), цитокини и фактор некрозе тумора (ТНФ-)[12 ]. Штавише, екстракти ваздушних делова Оенотхера биеннис заштитили су ХаЦаТ ћелије од оштећења ДНК изазваних Х, О, и ћелијске смрти блокирањем ћелијског оштећења услед оксидативног стреса кроз механизам који је укључивао елиминацију РОС и Нрф2/ХО-1 сигнални пут [ 13]. Штавише, уље Оенотхера биеннис, које је богато липидима, предложено је као добар хидратант за пацијенте са екцемом захваљујући својој способности да лако продре у кожу [14]. Нажалост, препарати екстракта култивисаних биљака, који се баве козметиком, могу имати неке недостатке: прво, могу бити контаминирани токсичним или алергеним супстанцама као што су пестициди, ђубрива или загађивачи; затим, биљке су подложне непредвидивом стресу и сезонским условима или варијацијама у доступности хранљивих материја, што може да изазове синтезу неочекиваних метаболита. Додатно, екстракти могу садржати патогене микроорганизме, који смањују квалитет финалних производа. Сви ови недостаци, заузврат, конвергирају у ризик од променљивог садржаја секундарних метаболита и ниске репродуктивности. Да би се превазишле ове слабости, употреба култура биљних ћелија у козметици постаје све популарнија и веома цењена, јер превазилази многе од горе наведених недостатака [15].

Кликните овде да бисте сазнали више

У овој студији, хидрофилни екстракт ћелијских култура Оенотхера биеннис (ОбХЕк) је у потпуности окарактерисан напредним приступима заснованим на спектрометрији масе, уз помоћ биоинформатике и тестиран у више биохемијских и биолошких тестова. Мешавина садржи биоактивна једињења углавном лигнана и тритерпена, као што су арјунолна и азијска киселина, која је раније била повезана са производњом проколагена И у хуманим фибробластима [16,17]. Екстракт је испитан због његовог капацитета да повећа експресију МИЛК-а, промовише контракцију матриксног колагена, полимеризацију актина и производњу ТГФ-регулисаних ЕЦМ протеина, који фаворизују контракцију дермиса, чиме успоравају старење коже.

2. Резултати

2.1. Квалитативна и квантитативна анализа у води растворљивог екстракта ћелијске културе Оенотхера Биеннис

Извршена је УПЛЦ-МС/МС анализа ОбХЕк-а и спектрометријски подаци високе резолуције су искоришћени за хемијску карактеризацију коришћењем Глобал Натурал Продуцтс Социал Молецулар Нетворкинг (ГНПС), система масене спектрометрије заснованог на вебу који помаже у идентификацији и означавању природних производа (НПС)[18]. Има за циљ да буде база знања отвореног приступа за организације широм заједнице и за дељење сирових, обрађених или анотираних података фрагментационе масене спектрометрије (МС/МС). Конкретно, обављене су претраге ГНПС спектралне библиотеке и задатак молекуларног умрежавања заснованог на карактеристикама (ФБМН): прва анализа нам је омогућила да идентификујемо природна једињења, упоређујући њихове МС/МС спектре са спектрима структурно карактерисаних метаболита, а друга са спектром који се односи на групу. НП унутар мреже пошто су слични МС/МС обрасци фрагментације показали структурно слични молекули [19]. Као што је приказано на слици 1 и табели 1, многи НПС су несумњиво идентификовани као припадници неколико класа секундарних метаболита, углавном лигнана (осим Салвадора и лириодендрона) и тритерпена (муријатна киселина, ариунолна киселина, азијска киселина и хедерагенин). Хемијске врсте које ГНПС није идентификовао су додељене у складу са литературом.

Као пример употребе ГНПС-а, мрежа изведена из ФБМН анализе приказана је на слици 2а, која показује да ОбХЕк садржи многе друге некарактеристичне тритерпене повезане са муријатном киселином (18, м/з 503.3389, РТ 21.89 мин: идентификација муријатне киселине је потврђено поређењем са својим аналитичким стандардом). На пример, различите претходно некарактерисане врсте на м/з 701 и 665 идентификоване су као гликозиловани облици повезани са муријатном киселином или њеним изомерима, респективно хидратисани или не са два молекула Х2О.

Штавише, пријављени јони на м/з 729, 703, 699,687,685, 683 изведени респективно из гликозилације плус два молекула Х, О врста на м/з531, 505,501, 489,487, а њихова идентификација није постигнута у 485: сви би требало да су тритерпени, јер су повезани са муријатном киселином или њеним сродницима, због њиховог пута фрагментације МСМС. Недавно су многи тритерпени са м/ 501 и 485 изоловани из друге врсте Оенотхера, Оенотхера Маритима, и њихова структура је је разјашњено на основу спектроскопских података, што добро корелира са нашим резултатима [20].

Цистанцхе може против старења

ФБМН анализа је такође пружила информације о метаболитима на м/з 617,3862 (МС2 јони на м/з 453,145 и 119) присутним у молекуларним мрежама приказаним на Слици 2б и нису пријављени у литератури за врсте Оенотхера. Ова м/з вредност и њена фрагментација се поклапају са 2-ОЕп-кумароил апостолском киселином или њеним изомерима, доказујући, барем, присуство тритерпен кумароила и такође кафеоил естара у екстракту. Заиста, МС-спектри врста на м/з 649 (РТ 25,72 и 27,19) показали су присуство јона на м/з 179, 161 и 135 због цепања дела кофеинске киселине, док МС2 спектри других врста приказано на слици 2б на м/з 633 (РТ 26.88, 27.20, 28.12 и 28.43), 649 (РТ24.18, 24.65, 24.83) и 661 (РТ 30.28) показују јоне на м/з 145 и 1. за кумароилну групу.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911)у оквиру тестираних опсега. Штавише, граница детекције (ЛОД) и граница квантификације (ЛОО) указују да се коришћене методе одликују високом осетљивошћу. Добијени резултати квантитативне анализе (Табела 3) су показали да су лириодендрон и хедерагенин главни заступљени лигнан и тритерпен, респективно.

2.3.Анализа експресије МИЛК гена у ХДФ

Активност ОбХЕк-а је тестирана у ХДФ-у на експресију гена МИЛК, који кодира киназу одговорну за фосфорилацију лаког ланца миозина (Слика 3а). Резултати су показали да је третман са екстрактом у обе концентрације повећао експресију МИЛК гена за око 50 процената, слично као код позитивне контроле ТГФ-.

2.4. Анализа контракционог капацитета колагенске матрице

Да бисмо проценили активност ОбХЕк-а на контрактилни капацитет колагених влакана, користили смо ХДФ диспергован у дисковима колагеног гела [21]. Као што је приказано на слици 3б, екстракт, у нижој концентрацији, изазвао је значајно повећање контракције колагенског диска, што сугерише потенцијални ефекат на чврстоћу колагена. Третман са МЛ7(1-(5-јодонафтален-1-сулфонил)-1Х-хексахидро-1,4-диазепином), инхибитором МИЛК, укинуо ово повећање, што указује да и екстракт и ТГФ- делују преко МИЛК-а на контракцију колагенског диска.

2.5. Мера нивоа полимеризације актина

Капацитет ОбХЕк-а да стимулише полимеризацију актина је испитиван мерењем нивоа полимеризованог актина у ћелијама, третираним екстрактом и позитивном контролом ТГФ- , сам и у присуству МЛ7. Као што је приказано на слици 3ц, третман са обе концентрације екстракта је дао повећање количине полимерног актина за око 50 процената, у поређењу са 33 процената ТГФ-.купити цистанцхеОпет, пре-инкубација са МЛ7цом-потпуно је укинула овај ефекат, што указује на учешће МИЛК-а у полимеризацији актинских филамената.

2.6. Анализа путање ТГФ РИИ/СМАД у ХДФ

Да бисмо проверили да ли је повећање полимеризације актина и контракција колагена ћелија третираних ОбХЕк-ом такође повезано са активацијом пута за трансдукцију сигнала посредованог ТГФ РИИ, прво смо приметили експресију ТГФ РИИ гена, а затим трансфектовали ХДФ са СМАД{{ 0}}репортер плазмида луциферазе и проценио повећање активности луциферазе као одговор на третман ОбХЕк-ом. Резултати, приказани на слици 3д,е, показују да третман са ОбХЕк-ом на 0.002 процената и 0,006 процената повећава експресију ТГФ РИИ на начин сличан ТГФ-у који се користи као позитивна контрола и, паралелно, активност луциферазе повезана са СМАД је повећана за 80 и 40 процената, респективно. Значајно смањење сигнала је добијено када су ћелије третиране са МЛ7, показујући такође да је ова активност повезана са МИЛК.

2.7. Анализа про-колагена И, тропоеластина и периостина

Као последицу активације трансдукције сигнала ТГФ РИИ, анализирали смо синтезу главних протеина екстрацелуларног матрикса као што су проколаген тип И, тропоеластин и периостин у ХДФ третираном ОбХЕк-ом на 0.002 процента. Као што је приказано на слици 3ф, ОбХЕк је повећао производњу наведених протеина за око 98 процената, 75 процената, односно 51 проценат, слично као код позитивне контроле ТГФ-. Мере су спроведене ЕЛИСА тестом, коришћењем специфичних антитела против про-колагена И, тропоеластина и периостина.

2.8.Анализа МИЛК, фосфо-миозина, колагена И и тропоеластина на Ек-Виво експлантатима коже

Као што је приказано на слици 4а-ц, ОбХЕк је произвео значајно повећање у производњи МИЛК и фосфорилисаног миозина у експлантату људске коже.

Индукција колагена И и тропоеластина такође је анализирана у експлантату коже претходно третираним ОбХЕк-ом, а затим третираним хидрокортизоном током 8 дана да би се симулирало хронолошко старење [22]. Третман хидрокортизоном смањио је количину колагена И и тропоеластина за више од 100 процената, а присуство 0,002 процената ОбХЕк-а је вратило количину тропоеластина за скоро 91 проценат и колагена за 120 процената, у поређењу са аскорбат који се користи као позитивна контрола (Слика 4д-ф). Ово указује на потенцијални ефекат ОбХЕк-а против старења, посебно ефикасан у повећању чврстоће коже деловањем на компоненте дермалног матрикса.

2.9. Микроскопија атомске силе (АФМ) у кожним експлантатима

Да бисмо прикупили више информација о биомеханичким особинама коже које су промовисане третманом са ОбХЕк-ом, проценили смо еластичност, интринзичну механичку особину узорака коже у смислу њихових Јангових модула [23]. Као што је описано у одељку 4, да бисмо израчунали модул еластичности, и на третираним и на нетретираним узорцима коже, сакупили смо криве силе помоћу микроскопа атомске силе (АФМ) и прилагодили их Хертз моделом [24,25]. Као што је приказано на слици 5, третман узорака коже екстрактом имао је ниже вредности Иоунговог модула у поређењу са нетретираним узорцима, што указује на побољшање еластичних својстава коже. Конкретно, нетретирани узорци коже су открили средњу вредност Јанговог модула од 0,37±0,15 ГПа, док су узорци коже третирани ОбХЕк показали нижу средњу вредност од 0.{{11 }}7±0,02 ГПА. Вредности Иоунговог модула узорака коже биле су у складу са литературом [26-28].

3. Дискусија

Културе биљних ћелија представљају приступ који највише обећава за одрживу производњу биљних секундарних метаболита од комерцијалног интереса, нудећи континуирано снабдевање материјалом путем културе великих размера и чинећи одржив и еколошки прихватљив систем [29,30]. Екстракти из култура биљних ћелија нашли су обећавајућу примену у здравственом и козметичком сектору, јер представљају неке релевантне предности; (и) садрже метаболите биосинтетизоване у условима контролисаног раста; (и) потичу из стандардизованих производних процеса, гарантујући исте квалитативне и квантитативне карактеристике добијених врста; (ии) екстракти не садрже загађиваче као што су микроорганизми, хербициди, пестициди и фунгициди; (ив) независни су од географских или еколошких флуктуација и биљне врсте могу бити сачуване за будућност генерације. У овом такмичењу, водени екстракт ћелијске културе Оенотхера биеннис (ОбХЕк) је испитиван као обећавајући извор биоактивних молекула који имају активност против старења коже. Заиста, ОбХЕк је истражен УПЛЦ-МСМС анализама високе резолуције у комбинацији са биоинформатичким приступима да би се постигла широка структурна карактеризација. Карактеризација једињења је реализована углавном коришћењем ГНПС-а за убрзавање процеса идентификације, упоређивање МС/МС спектра са спектрима структурно окарактерисаних метаболита и, штавише, откривање нових неочекиваних врста, груписајући сличне НП унутар мреже. Штавише, време задржавања, тачна мерења масе и МС2 анализе су такође упоређени са онима из стандарда, а сви подаци су упоређени са литературом. Идентификовани су биоактивни лигнани и тритерпени, као што су Салвадор, лириодендрон, ми-антхемиц киселина, арјунолна киселина, азијска киселина и хедерагенин. Лириодендрон [31] и муријатна киселина [32] су испољили јаку антиоксидативну активност, док је хедерагенин показао својства против старења коже услед смањења ћелијске оксидације и активације функције протеазома [33]. Међутим, сматрало се да су арјунолна и азијска киселина углавном одговорне за неке од следећих тестираних активности, јер стимулишу синтезу колагена И. Заиста, показано је да је ОбХЕк побољшао биомеханичка својства коже, која углавном зависе од релативне количине различитих компоненти ЕЦМ-а и од тога како су фибробласти способни да се контрахују и обезбеде праву напетост дермалних влакана.цистанцхУ ствари, ОбХЕк промовише контракцију матрикса колагена и полимеризацију актина повећавајући експресију МИЛК гена, повећавајући снагу контракције дермалних фибробласта. Састављање актинског цитоскелета појачава регулацију ТГФ- тип ИИ рецептора и, у складу са стимулацијом ТГФ-/Смад сигнализације, повећава нивое ТГФ-регулисаних ЕЦМ протеина. Заиста, ОбХЕк индукује производњу колагена типа И, периостина и тропоеластина. Због тога, сва ова својства чине га добрим обећавајућим састојком кандидата за употребу у козметичким формулацијама за борбу против губитка чврстоће и еластичности коже узрокованог годинама. Ову претпоставку поткрепљују резултати добијени у АФМ анализи, који су показали да је третман резова коже са ОбХЕк-ом довео до побољшања механичких својстава коже, детектованог као смањење Јанговог модула, што указује на значајно смањење укочености и ригидности коже.

4. Материјали и методе

4.1. Културе биљног ткива и припрема екстракта

Биљке Оенотхера биеннис обезбеђене су од стране ГЕЕЛ Флорицултура сс и биле су италијанског порекла (избегавајући примену протокола из Нагоје). Ћелијске културе су добијене из листова биљака Оенотхера биеннис индукцијом пролиферације меристематских ћелија на чврстим агар плочама до добијања калуса. Ћелије су пребачене у течни медијум за раст (Гамборг Б5, допуњен са 24 дихлорофеноксисирћетном киселином (1 мг/Л), аденином (1 мг/Л) и кинетином (0.01 мг/Л)). , ћелије су узгајане као културе суспензије уз орбитално мућкање. Када се добију културе од око 150 г/Л, ћелије су сакупљене и лизиране у фосфатном пуферу (ПБС) на пХ 7,4 да би се добио екстракт растворљив у води, који је лиофилизован. Прашак је растворен у води или медијуму ћелијске културе у одговарајућим концентрацијама за тестирање.

4.2. УПЛЦ-МСМС анализа за хемијску карактеризацију

ОбХЕк (5{{10}} мг/мЛ) је припремљен и подвргнут двофазној екстракцији бутанола/воде. Фракција бутанола је осушена и растворена у метанолу (10мг/мЛ) пре УПЛЦ-МС/МС анализе. Изведен је на К-Екацтиве Цлассиц Масс Спецтрометру компаније Тхермо-Сциентифиц (Валтхам, МА, УСА) опремљеном Тхермо СциентифицТМ УлтиМатеТМ 3000 УПЛЦ системом. Сва хроматографска испитивања су изведена коришћењем колоне Пхеноменек Луна③Ц18 100 А (150×2,0 мм, величине честица 3 μм) на 40 степени Ц и брзином протока од 0,200 мЛ/мин. Запремина ињекције била је 5 μЛ. Мобилна фаза се састојала од А (вода из РОМИЛ Лтд, Цонвент Дриве, Ватербеацх, Цамбридге, УК са 0,1 посто сирћетне киселине) и Б (100 посто ацетонитрила од РОМИЛ Лтд, Цонвент Дриве, Ватербеацх, Цамбридге, УК) користећи градијент елуације од 5 процената Б на0-5мин,5-14 проценат Б на5-8 мин,14-32 проценат Б на 8-11 мин, 32-95 проценат Бат {{ 26}}мин,95-98 проценат Бат32-33 мин, 98 процената Б на 33-38мин,98-5 проценат Бат38-39 мин и 5 процената Б на { {34}} мин. Све МС и МСМС анализе су спроведене у ЕСИ негативном режиму са протоком гаса у омотачу од 30 (произвољне јединице), протоком помоћног гаса на 5 (произвољне јединице), напоном распршивања на 3,2 кВ и капиларном температуром и температура помоћног гасног грејача на 300 степени. Подаци су добијени у режиму Фулл МС/дд-МС2 (Топ5). Пуна МС подешавања су била: резолуција од 70.000, АГЦ циљ од 1×106, максимални ИТ од 200 мс, а могу се кретати од 100 до 800 м/з.дд-МС2 подешавања су била: резолуција 17.500, АГЦ циљ од 2×105, максимум ИТ од 65 мс, изолациони прозор од 1,5 м/з и НЦЕ од 35.

добијени су ручно верификовани. мзКСМЛ подаци су обрађени коришћењем Мзмине 2.53 пре посла за молекуларно умрежавање засновано на карактеристикама (ФБМН) на ГНПС. Корак детекције масе је изведен коришћењем детектора масе центроида уз задржавање нивоа буке на 5 × 1{{10}}3. Изградња хроматограма за аутоматизовану анализу података (АДАП) је реализована са следећим подешавањима: минимална величина групе у броју скенирања од 5, праг интензитета групе од 5 × 1{{20}}³, мин највећи интензитет од 5× 10 плус толеранција м/з од 0.01 м/з или 10 ппм. Деконволуција хроматограма је постигнута коришћењем таласа (АДАП) као алгоритма, С/Н праг од 3, минимална висина обележја 1 × 105, праг коефицијента/површине 5, опсег трајања пика 0.{{ 18}}.00 мин, и РТ таласни опсег од 0.00-0.05. Хроматограми су деизотопирани коришћењем алгоритма групе изотопских пикова са толеранцијом м/з од 0,001 м/з или 5,0 ппм и РТ толеранцијом од 0,10 мин. ФБМН посао је изведен коришћењем толеранције родитељске масе од 0,02 Да и толеранције јона МС4 фрагмента од 0,02 Да. Ивице су филтриране да би имале праг од 0,7 и најмање 2 усклађена врха. Штавише, максимални број суседних чворова за сваки чвор је постављен на 10.

4.4. Квантитативна анализа лигнана и тритерпена

Исти УПЛЦ услови пријављени за квалитативну анализу коришћени су за квантитативну анализу лигнана, док су за ону тритерпена оптимизовани да би се одвојила два пара изомера, арјунолна и азијска киселина. Анализа је изведена на К-Екацтиве Цлассиц Масс Спецтрометру као што је претходно описано. Раздвајање је извршено помоћу Пхеноменек Кинетек⑧ЕВО Ц18 300 А (150×2,1 мм, величине честица 5 μм). Мобилна фаза се састојала од А (5 мМ воденог раствора амонијум ацетата, пХ 9.00 подешен амонијум хидроксидом) и Б (100 процената ацетонитрила) коришћењем градијентног елуирања од 17-28 проценат Б на 0-18 мин, 28-65 проценат Б на 18-22 мин, 65-75 проценат Б на 22-26мин,75-95 проценат на {{17 }}, 5 мин, 95 процената на 26,5-30 мин, 95-17 проценат на 30-30,1 мин,17 процената на 30,1-42 мин. Брзина протока је била 0,450 мЛ/мин, а запремина ињекције је била 5 уЛ. И за лигнане и за тритерпене, подаци су добијени са Фулл МС-СИМ и ПРМ режимом. Пуна подешавања МС-СИМ-а су била: резолуција од 70.000, АГЦ циљ од 3×106, максимални ИТ од 200мс, и може да се креће од 200 до 800 м/з за лигнане и од 400 до 850 м/з за тритерпене. ПРМ подешавања су била: резолуција од 70.000, АГЦ циљ од 2×10 степени, максимални ИТ од 100 мс, изолациони прозор од 1,0 м/з, и НЦЕ од 35 у случају лигнана и 50 у том од тритерпена.цистанцхе АустралиаКупили смо Салвадор (#{{0}}КСС172930) од Биосинтх Царбосинтх (Стаад, Ст. Галлен, Швајцарска), лириодендрон (#СМБ00181) и арјунолну киселину (#СМБ00119) од Сигма -Алдрицх (Сент Луис, МО, САД), азијска киселина (#0027) из Ектрасинтхесе (Генаи, Лион, Француска) и хедерагенин (#89706) из ПхитоЛаб ГмбХ & Цо.КГ (Вестенбергсгреутх, Баиерн-Миттелфранкен, Немачка). Мирантична киселина је поклон проф. Марије Валерије Д'Аурије са Универзитета у Напуљу. Калибрационе криве су добијене убризгавањем стандардних раствора у опсегу концентрација од 0.25-25 μМ за лигнане и 0.1-25 уМ за тритерпене. И чисти Салвадор на страну и лириодендрон су показали два ЛЦ-МСМС пика, вероватно због хемијске равнотеже успостављене у раствору. Граница детекције (ЛОД) и граница квантификације (ЛОО) за стандарде су одређене на основу односа сигнал-шум (С/Н).

4.5.Културе ћелија коже и експланти

Људски дермални фибробласти (ХДФ) су одржавани у Дулбеццо-овом модификованом медијуму орла (ДМЕМ; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) допуњеном са 10 процената феталног говеђег серума (ФБС; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) )у 95% ваздуха, 5% ЦО, и влажној атмосфери на 37 степени. Експланти коже, добијени са коже здравих донора (старости 44-47) у хируршком центру Вилла Цинзиа (Напуљ, Италија), култивисани су у 24-трансвелл плочама у ДМЕМ/ФБС плус антибиотици у ваздуху. течни услови на 37 степени у влажном ваздуху од 5 процената ЦО2. Сви донатори су дали писмени информисани пристанак за употребу кожних ткива, према Хелсиншкој декларацији.

4.6. Тест цитотоксичности

Тестови цитотоксичности су засновани на употреби МТТ једињења [{{0}}(45-диметил тиазолил)-2,5-дифенилтетразолијум-бромида][34]. Ћелије су узгајане у 96-плочама са бунарима у медијуму за културу ДМЕМ (Дулбеццо'с Модифиед Еагле Медиум), допуњен са 10 процентом феталног говеђег серума, током приближно 8 х. После третмана са ОбХЕк између 0.05 процената и 0,0004 процената (500 уг/мЛ и 4 уг/мЛ) током 48 х, ћелије су испране у ПБС и инкубиране са 100 μЛ/бунарићу "реакциони пуфер" који садржи ∶ 10 мМоф Хепес, 1,3 мМ ЦаЦл2, 1 мМ МгСО, 5 мМ глукозе и 0,5 мг/мЛ МТТ колориметријског супстрата у пуферу ПБС на пХ 7,4. После 3 сата инкубације на 37 степени Ц у 5 процената ЦО, 100 μЛ раствора за солубилизацију који садрже 10 процената Тритон-Кс100,0,1 Н ХЦл у апсолутном изопропанолу додато је у сваки бунар. После 16 х инкубације, колориметријска реакција је измерена на 595 нм помоћу Вицтор3 читача плоча (ПеркинЕлмер, Валтхам, МА, УСА).

4.7. Анализа експресије гена МИЛК и ТГФ6РИИ у ХДФ

По бунарчићу, 1×10 степен ХДФ је узгајан у 6-плочама у ДМЕМ на 2 процента ФБС, након 24 х ФБС је даље разблажен до 0.5 процената, а ћелије су третиране са 0.002 процената и 0.006 процената концентрација ОбХЕк и ТГФ- 2.5нг/мЛ, након чега је уследила инкубација од 2х за МИЛКанд 48 за ТГФРИИ. За екстракцију РНК коришћен је комплет "ГенЕлутеМ Тотал РНА Пурифицатион" који је купила компанија Мерцк (Дармстадт, Немачка). После назначених третмана, ћелије су испране са ПБС, сакупљене у пуферу за лизу и подвргнуте процедури екстракције како је наведено. Узорци су третирани са ДНазом И (Амбион, Аустин, ТКС, УСА) на 37 степени током 30 минута да би се уклонио загађивач геномске ДНК. Из сваког узорка, 2 μЛ је стављено на гел 1% агарозе у присуству денатурирајуће боје за пуњење у сврху квантизације количине РНК у односу на специфични маркер за РНК (ТхермоСциентифиц, Валтхам, МА, УСА). ГенеТоолс (ПеркинЕлмер, Валтхам, МА, САД) је коришћен као софтвер за квантизацију. Затим, 300 нг укупне РНК је ретро-транскрибовано коришћењем ензима реверзне транскриптазе (ТхермоСциентифиц, Валтхам, МА, САД). Семи-квантитативни РТ-ПЦР је спроведен користећи као интерне стандарде пар универзалних прајмера 18С прајмер/конкурент (Амбион, Аустин, ТКС, УСА). ПЦР производи су раздвојени на 1,5 процентном агарозном гелу, прегледани помоћу алата Релианце (ПеркинЕлмер, Валтхам, МА, УСА) и анализирани дензитометријом коришћењем софтвера Генетоолс. Секвенце прајмера коришћених за амплификацију биле су следеће: МИЛК ФВ: АТЦАААЦТГТЦААГТТЦАГ, МИЛК Рв: АГГЦАЦТГЦГТГЦАГТЦЦА, ТГФБР2 ФВ: ГТЦАЦТГАЦААЦААЦГГТ, ТГФБР2 РВ: АТГТЦАГАГЦГГТЦАТЦТ.

4.8. Анализа контракционог капацитета колагенске матрице

Што се тиче ХДФ ћелија, 2.0× 10 степен је ресуспендовано у 5к ДМЕМ медијуму за раст (Гибцо, Валтхам, МА, УСА) у 24-плочи са бунарима и 2 мг/ мЛ раствора колагена из говеђе коже (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, УСА) је додат у сваки бунар. пХ раствора је подешен на 7,2. Плоча је инкубирана на 37 степени Ц током 45 минута да би се омогућило очвршћавање колагенског гела. ДМЕМ допуњен са 10 процентом ФБС и/или МЛ7 25 уМ, као инхибитор МИЛКпротеина, додат је касније. После 16 х, МЛ7 је очишћен и додат је ОбХЕкат у концентрацији од 0,002 процента у ДМЕМ са 2 процента ФБС. ТГФ- 2.5 нг/мЛ је коришћен као позитивна контрола. Формирани диск колагена је одмах одвојен од бунара употребом стерилне микро лопатице како би се подстакла његова контракција. Области диска сваког третмана мерене су у време 0 и 5 х и анализиране помоћу софтвера Имаге.

4.9. Анализа степена полимеризације актина

Затим, 1,5×10 степен ХДФ ћелија по бунарчићу је узгајан у 24-плочи за бунар и следећег дана је медијум додат са 2 процента ФБС и цитохаласином Б, који је инхибитор актина. полимеризација, на 2 μМ током 3{{1{{20}}}} мин. Након 30 минута, на ћелије је додат ОбХЕк (0,002 процената и 0,006 процената) заједно са ТГФ- 2.5 нг/мЛ, који се користи као позитивна контрола, и МЛ7 25μМ, као негативна контрола МИЛКензима. После 30 минута третмана, ћелије су фиксиране са 4 процента параформалдехида (ПФА) у пуфер фосфату током 30 минута на леду. Ћелије су испране ПБС-ом и пермеабилизоване раствором фосфатног пуфера и Тритон-Кс100 на 0,2 процента током 30 минута. Након тога, ћелије су инкубиране са раствором од 0, 4 μМ фалоидина коњугованог са родамином (Санта-Цруз Биотецхнологи, Даллас, ТКС, УСА) током 1 х у мраку.цистанцхе бенефитсУ време 0 и после 18 х, флуоресценција је измерена на 540/570 нм помоћу Вицтор3 читача плоча (ПеркинЕлмер, Валтхам, МА, УСА). 4.10.Анализа СМАД2 путање

ХДФ ћелије су засејане при густини од 3 × 103 у 96- плочама са бунарима и након 16 х су трансфектоване коришћењем Кс-тремеГенеТМ ХП ДНК реагенса за трансфекцију (Роцхе Диагностицс, Базел, Швајцарска) са Смад2 репортер вектором према упутствима произвођача. После 24 х, ћелије су третиране са ОбХЕк или ТГФ- 2.5 нг/мЛ, саме или у комбинацији са МЛ7 25 μМ током 24 х. На крају инкубације, ћелије су испране са ПБС и активност луциферазе је одређена коришћењем система за испитивање СтеадиГло Луциферасе (Промега Цорпоратион, Мадисон, ВИ, САД) у Мултивелл Плате Реадер Вицтор Ниво (ПеркинЕлмер, Валтхам, МА , САД).

4.11.Анализа синтезе проколагена И, тропоеластина и периостина

По бунарчићу, 8× 103 ХДФ је узгајано у 96-плочама за бунарчиће и третирано са 0.002 процента ОбХЕк или ТГФ 2,5 нг/мЛ. После 24 х, ћелије су обрађене за ЕЛИСА коришћењем моноклоналног примарног антитела против проколагена типа И(сц-166572, Санта-Цруз Биотецхнологи, Даллас, ТКС, УСА), након чега је уследила инкубација са секундарним анти-мишјим антителом обележеним са пероксидазом (170-6516, Биорад, Херцулес, Калифорнија, САД). Супернатанти ћелија су обложени на другој плочи за детекцију тропоеластина и периостина коришћењем анти-тропоеластинског зечјег антитела (аб21600, Абцам, Цамбридге, У или анти-периостин мишје антитело (сц-398631, Санта-Цруз Биотецхнологи , Даллас, ТКС, САД), након чега је уследила инкубација са секундарним антителом против зеца обележеним пероксидазом (170-6515, Биорад, Херцулес, Калифорнија, САД). Колориметријска реакција је развијена додавањем 100 μЛ воденог раствора ОПД (О-фенилендиамин), 0,35 мг/мЛ у 50 мМ цитратном пуферу и 0,012 процената водоник пероксида (Х2О2). После 30 минута, апсорбанца је мерена на 490 нм помоћу вишеструког читача Вицтор Ниво (ПеркинЕлмер, Валтхам, МА, САД).

4.12. Ек Виво тестови

ИмуноХистофлуоресценција (ИХФ) МИЛК-а и фосфорилисаног миозина је процењена у експлантату коже {{0}} година старих донора. Експланти људске коже су исечени киретама за биопсију пунцхом од 8 мм и култивисани у 24-плочама у ДМЕМ са 10 процентом ФБС и антибиотицима. Добијени ударци су третирани са 0.002 процента и 0,006 процената ОбХЕк-а током 24 часа. Инкубирани су у 15 посто сахарозе, затим у 30 посто сахарозе и на крају замрзнути. Затим су добијени пресеци од 10 μм помоћу ЦМ1520 криостата (Леица Мицросистемс, Ветзлар, Немачка). Слајдови са криосекцијама су хидратисани 30 минута у ПБС-у и стављени у "блокирајући" раствор (6 процената БСА, 5 процената серума, 20 мМ МгЦл, 0,2 процената Твеен) током 1 х. Криосекције су инкубиране са примарним анти-МИЛК зечјим антителом (1:100, ГенеТек, Ирвине, Калифорнија, САД) и примарним антителом анти-фосфо-миозином (1:100, ЛифеТецхнологиес, ​​Царлсбад, ЦА, УСА) током 16 х на 4 степен. Плоче су испиране ПБС-ом 30 минута, а затим инкубиране са секундарним анти-зечјим Алека-Флуор 546 антителом (1:1000; А11035 ТхермоФисхер, Валтхам, МА, УСА) током 1 сата. Језгра су обојена са ДАПИ(4',6-5 диамидино-2-фенилиндол)1 уг/мЛ у ПБС-у током 10 минута. Слике су добијене флуоресцентним микроскопом и анализиране помоћу софтвера ИмагеЈ. За ИХФ тропоеластина и колагена И коришћени су кожни експланти 36-годишњих донора. Биопсије коже су добијене као што је горе описано и претходно третиране са 0,002% и 0,006% ОбХЕк-а током 24 х. Додан је стрес са хидрокортизоном од 10 уг/мЛ током 8 дана у присуству ОбХЕк. Након тога, биопсије су замрзнуте као што је горе описано и секције су инкубиране са примарним антителом анти-тропоеластин зеца (1:1000 аб21600, Абцам, Цамбридге, УК) и анти-колагеном И (1:100 Ц2456 Мерцк, Дармстадт, Немачка) за 16х на 4 степена. Слајдови су анализирани као што је горе описано, а слике су добијене и анализиране помоћу софтвера ИмагеЈ.

4.13. Микроскопија атомске силе (АФМ) у кожним експлантатима

Еластичност узорака коже која није третирана и третирана ОбХЕк-ом је процењена обезбеђујући њихове Јангове модуле методом у нанометријској скали заснованом на микроскопи атомске силе (АФМ), развијеном не само за биолошке узорке већ и за неорганске узорке. Ови приступи су засновани на претпоставкама Херцових модела и разматрају узорак и конзолу као две опруге у низу у окружењу АФМ експеримента. Укратко, екс-биљка коже третирана са 0.006 процената ОбХЕк-а и узорака нетретиране коже исечени су криостатом на кришке од 10 ум дебљине. Узорци су чувани на 12 степени, затим испрани ПБС-ом и испитани на фиксној температури и релативној влажности од 22 степена и 55 процената, респективно. Сваки узорак је испитан помоћу НаноСцопе ИИА АФМ у Сингле Спецтросцопи Сингле Моде користећи пирамидални врх (РЕСП-20) са константом опруге од 0,9 Н/м. Да би се израчунао Јангов модул, добијено је десет кривуља силе у десет различитих тачака исте површине узорка. Свака крива силе је крива скретања (Волт) наспрам померања (нм) и може се конвертовати у криве силе (Н) у односу на раздвајање (нм). У ствари, свака крива силе извештава криве утовара и истовара. Они представљају тренд врха у односу на узорак: када је врх далеко од узорка када дођу у контакт и врх почне да се склања, и када се поново удаљи. Може се истражити само први део ових кривих. Сваки од ових делова кривих одговара стандардним Херцовим моделом, посебно типичном Херце-једначином за врх пирамиде, да би се издвојио модул еластичности познат као Јангов модул у ГПа.

4.14. Статистичка анализа

Све наведене вредности биле су просек три независна експеримента, од којих је сваки изведен у три примерка. Звездице означавају статистичку значајност израчунату у складу са т-тестом: *средња вредност је мања или једнака 0.05;** п вредност мања или једнака 0. 01;***п вредност Мања или једнака 0,001.

Овај чланак је преузет из Метаболитес 2021, 11, 527. хттпс://дои.орг/10.3390/метабо11080527 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/метаболитес