Ефекти против старења и инхибиције тирозиназе екстракта цвета фистуле касије, део 1

Апстрактан

Позадина: Природни производи направљени од биљних извора користе се у разним козметичким апликацијама као извор исхране и као средство за избељивање. Цветови Цассиа фистула Л, фамилије Фабацеае, коришћени су као традиционални лек за кожне болести и зарастање рана и за које се наводи да поседују антиоксидативна својства. Испитиван је ефекат против старења екстракта цвета Ц. фистула на фибробласт људске коже.

Цистанцхе гликозид такође може повећати активност СОД у ткивима срца и јетре и значајно смањити садржај липофусцина и МДА у сваком ткиву, ефикасно хватајући различите реактивне радикале кисеоника (ОХ-, Х₂О₂, итд.) и штитећи од оштећења ДНК изазваног од стране ОХ-радикала. Цистанцхе фенилетаноидни гликозиди имају јаку способност уклањања слободних радикала, већу редукциону способност од витамина Ц, побољшавају активност СОД у суспензији сперме, смањују садржај МДА и имају одређени заштитни ефекат на функцију мембране сперме. Цистанцхе полисахариди могу да појачају активност СОД и ГСХ-Пк у еритроцитима и плућним ткивима експериментално остарелих мишева изазваних Д-галактозом, као и да смање садржај МДА и колагена у плућима и плазми и повећају садржај еластина. добар ефекат чишћења на ДППХ, продужава време хипоксије код старијих мишева, побољшава активност СОД у серуму и одлаже физиолошку дегенерацију плућа код експериментално сенесцентних мишева Са ћелијском морфолошком дегенерацијом, експерименти су показали да Цистанцхе има добру антиоксидативну способност и има потенцијал да буде лек за превенцију и лечење болести старења коже. Истовремено, ехинакозид у Цистанцхе-у има значајну способност да уклони слободне радикале ДППХ и може да уклони реактивне врсте кисеоника, спречи деградацију колагена изазвану слободним радикалима, а такође има добар ефекат поправљања оштећења ањона слободних радикала тимина.

Кликните на Предности пустињске цистанче

【За више информација:george.deng@wecistanche.com / ВхатАпп:86 13632399501】

Методе: Екстракција бутанолом цветова Ц. фистуле је завршена и активна једињења су класификована. Цитотоксичност фибробласта је процењена СРБ тестом да би се одабрале нетоксичне дозе за даље експерименте. Синтеза колагена и хијалуронске киселине (ХА) је затим мерена коришћењем колагенског комплета и ЕЛИСА теста. Штавише, активност ензима, укључујући колагеназу, матриксмелопротеиназу-2 (ММП-2) и тирозиназу, такође је процењена.

Резултати: Утврђено је да екстракт цвета не утиче на раст ћелија фибробласта коже (ИЦ50 > 200 уг/мЛ). Резултати су показали да екстракт цвета значајно повећава синтезу колагена и ХА на начин који зависи од дозе. Екстракт цвета (50–200 уг/мЛ) је такође значајно инхибирао активност колагеназе и ММП-2. Штавише, овај екстракт цвета може инхибирати активност тирозиназе која изазива хиперпигментацију, што изазива старење коже.

Закључци: Екстракт цвета Ц. фистуле показао је превентивни ефекат када се користи у сврхе против старења у фибробластима људске коже и може бити одговарајући избор за козметичке производе који имају за циљ да обезбеде ефекте избељивања, а који су означени као производи за негу коже лица против старења .

Кључне речи: колагеназа, синтеза колагена, гликозаминогликан, хијалуронска киселина, матрикс металопротеиназа

Позадина

Старење коже је компликована биохемијска прогресија која је резултат многих индивидуалних унутрашњих и екстринзичних фактора као што су старост, хормони и излагање УВ светлу [1]. Прогресија се јавља у епидермалним и дермалним слојевима и углавном је повезана са деградацијом екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) [2]. Ензими укључени у деградацију ЕЦМ су матрикс металопротеиназе (ММП) као што су желатиназе (ММП-2) и колагеназа [3]. Кожа губи своју затезну чврстоћу због ефекта деградације ЕЦМ-а од стране ММП. У овом процесу долази до борања коже, а такође значајно настају храпавост и сувоћа уз одређене пигментне абнормалности као што су хипо- или хиперпигментација [2, 4]. За лечење хиперпигментације, испитивани су инхибитори тирозиназе. Тирозиназа је ензим који ограничава брзину и претвара тирозин у меланин [5]. Инхибитори тирозина стога играју важну улогу као средства за осветљавање коже [6] док синтеза хијалуронске киселине (ХА) регулише хидратацију коже и настанак бора. ХА, несулфатни гликозаминогликан (ГАГ), састоји се од понављајућих јединица дисахарида укључујући Д-глукуронску киселину и Н-ацетил-Дглукозамин [7]. ХА такође регулише поправку ткива, укључујући побољшање одговора имуног система активацијом инфламаторних ћелија и као одговор на повреду фибробласта [8–10].

Природни производи направљени од биљних извора као што су Глициррхиза глабра [11] или зелени чај [12] коришћени су у козметичкој примени као извор исхране и као средство за избељивање. Значајна количина доказа указује на корисне ефекте орално или локално примењених фитокемикалија из биљних екстраката, посебно на побољшање стања коже. Неки примери корисних ефеката су да се старење коже и упала коже могу смањити. Ц. фистула (златни туш), породица Фабацеае, налази се у бројним азијским земљама као што су Тајланд, Кина, Мјанмар и Индија. У претходним студијама је утврђено да екстракт цвета Ц. фистула поседује антиоксидативна, антиканцерогена, антибактеријска, антифунгална и антидијабетичка својства [13, 14]. Познато је да је ефекат Ц. фистуле у ајурведској медицини укључен у лечење различитих поремећаја укључујући кожне болести, лепру, хематемезу, пруритус и дијабетес [15, 16]. Различити делови Ц. фистуле су показали фармаколошка својства [17]. Цвеће, семе, воће и пулпа коришћени су за лечење кожних болести укључујући лепру [18]. Пулпа је позната по својим антидијабетичким својствима [15] и коришћена је као тоник који се примењује у лечењу гихта и реуматизма [19]. Листови и зреле махуне традиционално се користе као лаксатив [20, 21]. Феноли и флавоноидне фитокемикалије Ц. фистуле су такође биле корисне у лечењу кожних болести [14]. Стога нас у овој студији занима улога екстракта цвета Ц. фистула у козметичкој примени. Испитани су превентивни ефекти деградације ЕЦМ-а заједно са ензимима старења коже који укључују активности колагеназе и ММП{13}}, као и тирозиназе. Штавише, утврђена је синтеза колагена и ХА.

Методе

Хемикалије и реагенси

Дулбеццо-ов модификовани орлов медијум (ДМЕМ), ДК желатин и пеницилин-стрептомицин испоручени су из Гибцо-а (Гранд Исланд, НИ, САД). Фетални говеђи серум (ФБС) је испоручен из Тхермо Сциентифиц-а (САД). Сириус Ред/Фаст Греен комплет за бојење колагена је купљен од компаније Цхондрек, Инц. (Редмонд, ВА, САД). Сулфорходамин Б реагенс, хијалуронска киселина и тирозиназа печурака добијени су од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД).

Биљни материјали

Ц. фистула цветови су добијени од Лампанг Херб Цонсерватион, провинција Лампанг, Тајланд. Број узорка ваучера (023197) је оверио Ваннарее Цхароенсуп, ботаничар у хербаријуму флоре Тајланда, Фармацеутски факултет Универзитета Чијанг Мај, Тајланд.

Припрема екстракта цвета фистуле Цассиа

Ц. фистула цветови су осушени у прозрачној просторији, а затим је 500 г сувог цвећа фино самлевено у прах. Након тога, прашак је натопљен у 50% етанола, а затим мућкан на 70 о/мин током 24 х. После 24 х, узорци су затим филтрирани кроз филтер папир да би се одвојио остатак. Остатак је натопљен у 50% етанола и мућкан на 70 рпм током 24 х и овај корак је поновљен 2 пута. Филтрирани узорци су спојени и упарени на ротационом вакуумском испаривачу (БУЦХИ, Швајцарска) да би се добиле водене фракције. У водену фракцију је додат хексан у односу хексана 2:1. Узорци су протресени и остављени да се одвоје током 30 мин. Узорци су раздвојени на две фракције, а то су фракције хексана и воде. Затим је водена фракција сакупљена и додато је 10 процената дрвеног угља током периода од 30 минута уз благо мешање на собној температури. Узорци су филтрирани кроз филтер папир и целит да би се одвојио угаљ. Узорци су помешани са засићеним бутанолом у односу засићеног бутанола 2:1 и узорци су остављени да се раздвоје током периода од 12 х и овај корак је поновљен 3 пута. Узорци су раздвојени на две фракције, које су укључивале воду и фракције бутанола. Вода је даље додата бутанолним фракцијама до једнаке запремине и ове фракције су остављене да испаре коришћењем ротационог вакуумског испаривача. Испарени узорци су осушени замрзавањем да би се добио прах екстракта цвета Ц. фистула.

Квантификација укупног садржаја фенола у екстракту цвета Ц. фистула коришћењем УВ-видљивог спектрофотометра

Укупан садржај фенола у екстракту цвета Ц. фистула одређен је помоћу Фолин-Циоцалтеу теста. Укратко, 0.4 мЛ екстракта цвета Ц. фистула је помешано са 0.3 мЛ 10 процентног Фолин-Циоцалтеау реагенса и инкубирано у мраку на собној температури 3 минута . Затим је додато 0.3 мЛ раствора натријум карбоната и раствор је даље инкубиран у мраку на собној температури 30 мин. Апсорбанца је процењена на 765 нм коришћењем УВ-видљивог спектрофотометра. Концентрација укупног садржаја фенола је израчуната и упоређена са стандардном кривом за галну киселину (ГА) при 0–20 уг/мЛ. Укупан садржај фенола је пријављен као милиграми еквивалента ГА по граму Ц. фистуле. екстракт цвета (мг ГАЕ/г екстракта).

Квантификација фенолних једињења у екстракту цвета Ц. фистула коришћењем ХПЛЦ анализе

Различити типови фенолних једињења у екстрактима цветова Ц. фистула анализирани су ХПЛЦ анализом, а затим су упоређени са стандардном галном киселином, катехинима, протокатехинском киселином, ванилном киселином, хлорогенском киселином, ферулном киселином и кумаринском киселином. Екстракти цветова су растворени у 50 процената етанола и даље су процењени помоћу ХПЛЦ (Агилент Тецхнологиес, ​​Калифорнија, САД) коришћењем колоне Ц18 обрнуте фазе (ВАТЕР, МА, САД). Мобилна фаза се састојала од метанола (А) и 0.1 проценат трифлуоросирћетне киселине (ТФА) у води (Б) са условима градијента. Брзина протока је подешена на 1,0 мЛ/мин, а таласна дужина детекције је забележена на 280 са УВ детектором. Нивои концентрације фенолних једињења су израчунати и упоређени са стандардном кривом узимајући у обзир стандардне концентрације и површине пикова (мг/г екстракта).

Квантификација укупног садржаја флавоноида у екстракту цвета Ц. фистула коришћењем колориметријског теста

Укупни садржај флавоноида је одређен колориметријским тестом модификованог алуминијум хлорида (АлЦл3), као што је претходно описано [22]. Укратко, 0.25 мЛ екстракта цвета је помешано са 0.125 мЛ 5 процената натријум нитрита (НаНО2) и раствор је инкубиран 5 минута на собној температури. Затим је 0.125 мЛ 10% АлЦл3 умешано у смешу и остављено у мраку 5 мин. Након тога је додат 1 мЛ натријум хидроксида (НаОХ) и раствор је инкубиран 15 минута на собној температури у мраку. Апсорбанца је мерена на 510 нм коришћењем УВ-видљивог спектрофотометра. Укупан садржај флавоноида је израчунат и упоређен са стандардним вредностима катехина и изражен као мг катехин еквивалента по граму екстракта (мг ЦЕ/г екстракта).

Ћелијске културе

Примарни фибробласти људске коже асептички су изоловани из абдоминалног ожиљка након хируршке процедуре која је укључивала порођај царским резом на хируршком одељењу болнице ЦМ Махарај, Универзитета у Чијанг Мају (Чијанг Мај, Тајланд) (шифра студије: БИО-2558-03549 коју је одобрила медицинска Одбор за етику истраживања, Универзитет Чијанг Мај). Маст је уклоњена из полазног материјала и натопљена је ДМЕМ-ом који садржи антипеницилин и стрептомицин. Након тога, кожа је уроњена у ДМЕМ који садржи 1 проценат протеазе (Диспасе, Гибцо, Гранд Исланд, НИ, УСА) током 48 сати на 4 степена. Епидермални слојеви су уклоњени и нормални фибробласти су изоловани из дермиса. Фибробласти су култивисани у ДМЕМ са додатком 10 процената ФБС, 2 мМ Л-глутамина, 50 У/мЛ пеницилина и 50 уг/мЛ стрептомицина. Ћелије су држане у инкубатору са 5% ЦО2 влажним на 37 степени.

Тест виталности ћелија

Тест виталности ћелија екстракта цвета Ц. фистула против ћелија фибробласта коже је мерен коришћењем сулфорходаминског Б (СРБ) теста као што је претходно описано [23]. Укратко, ћелије (8к103 ћелије/бунарић) су засејане у 96-плочу са бунарима и инкубиране на 37 степени, 5 процената ЦО2 током 24 х. Након тога, ћелије су третиране са или без различитих концентрација (0-200 уг/мЛ) екстракта цвета Ц. фистула током 48 сати. После 48 х, 10 процената (в/в) трихлоросирћетне киселине (ТЦА) је додато ћелијама, а ћелије су затим инкубиране на 4 степена током 1 х. Медијум је уклоњен и ћелије су испране споро текућом водом из славине. 0,057 процената (в/в) СРБ раствора (100 μЛ) је додат у сваки бунар и ћелије су инкубиране 30 минута на собној температури. СРБ раствор је уклоњен, а затим су ћелије испране 4 пута са 1 процентом (в/в) сирћетне киселине и остављене су да се осуше на собној температури. Боја је растворена са 10 мМ Трис базног раствора (пХ 10,5) и апсорбанца је измерена на 510 нм помоћу читача микроплоче.

Анализа синтезе колагена

Укупни интрацелуларни колаген у ћелијама фибробласта одређен је коришћењем Сириус Ред/Фаст Греен Цоллаген Стаининг Кит (Цхондрек, Инц, Редмонд, ВА, УСА) према упутствима произвођача. Укратко, ћелије фибробласта коже су засејане у плоче са 24 бунара током 24 сата на 37 степени, 5 процената ЦО2. Након тога, ћелије су претходно третиране ДМЕМ медијумом без серума током 24 х. Медијум је уклоњен и ћелије су затим инкубиране са или без екстракта цвета Ц. фистула (0-150 уг/мЛ) током 48 х. После 48 х, култивисани медијум је уклоњен. Затим су ћелије испране ПБС-ом и фиксиране са Кахле фиксативом 10 мин. Фиксатив је уклоњен и ћелије су испране са ПБС. Раствор Сириус Ред/Фаст Греен боје је додат у сваки бунар и узорци су инкубирани 30 минута на собној температури. Боја је уклоњена и ћелије су испране четири пута са ДИ водом или док течност није постала безбојна. На крају, додат је пуфер за екстракцију и мерена је апсорпција на 540 нм и 605 нм коришћењем УВ-видљивог спектрофотометра.

Тест активности колагеназе

Активност колагеназе је мерена коришћењем модификованог флуорогеног ДК™-желатинског теста као што је претходно описано [24]. Укратко, различите концентрације екстракта цвета Ц. фистула (0–200 уг/мЛ) додате су на плоче са 96 бунарчића. Једна У/мл колагеназе је додата у сваки бунар (100 μЛ/бунарић). Након тога, додато је 15 уг/мЛ желатина (ДК желатина) и смеше су инкубиране 10 мин. Брзина протеолизе је одређена мерењем апсорбанције у интервалима од 2 мин током 20 мин коришћењем читача микроплоче на таласној дужини ексцитације од 485 нм и таласној дужини емисије од 528 нм. Активност ензима је процењена испитивањем нагиба линеарне регресије између времена и апсорпције током периода од 2-6 мин.

ММП{0}} тест активности

Активност ММП{{0}} је одређена зимографијом желатина као што је претходно описано [25]. Ћелије фибробласта су култивисане у медијуму без серума ДМЕМ током 24 х. Након тога, супернатант културе је сакупљен. Супернатант културе је подвргнут 10 проценту полиакриламидних гелова који садрже 0.1 процента в/в желатина у нередукционим условима. Гелови су два пута испрани са 2,5% в/в Тритон Кс-100 током 30 минута на собној температури да би се уклонио СДС. Плоча гела је исечена на кришке које су одговарале тракама, а затим су кришке стављене у различите резервоаре и инкубиране са пуфером за активирање (50 мМ Трис-ХЦл, 200 мМ НаЦл, 10 мМ ЦаЦл2, пХ 7,4) који садржи различите концентрације Ц Екстракт цвета фистуле (0–200 уг/мЛ) на 37 степени током 18 х. Након тога, трака гелова је испрана и обојена са Цоомассие Бриллант Блуе Р (0,1% в/в), а затим је обојена у 30% метанола и 10% сирћетне киселине. ММП-2 активност се појавила као јасна трака на плавој позадини. Дигестивни појасеви су квантификовани програмом Имаге Ј.

Анализа синтезе хијалуронске киселине (ХА) помоћу ЕЛИСА

Ефекат екстракта цвета Ц. фистула на синтезу ХА је одређен коришћењем ЕЛИСА комплета као што је претходно описано [26]. Ћелије фибробласта (5.0 × 104 ћелије/бунарићу) су посејане у 24-плоче са бунарима током 24 х на 37 степени, 5 процената ЦО2. Ћелије су претходно третиране у медијуму без серума током 6 х, а затим су третиране са или без различитих концентрација екстракта цвета Ц. фистула (0–200 уг/мЛ) током 48 х. Узгајана подлога је сакупљена и синтеза ХА је мерена помоћу ЕЛИСА. Апсорбанца је мерена на 450 и 570 нм коришћењем читача микроплоче. Концентрација ХА у култивисаном супернатанту добијеном из третираних ћелија фибробласта је израчуната и упоређена са стандардном кривом ХА.

Тест инхибиције тирозиназе

Тест инхибиције тирозиназе је одређен као што је претходно описано [27]. Различите концентрације екстракта цвета Ц. фистула додате су у плочу са 96-бунарићима. Реакција је изведена у натријум пуферу (пХ 6,4) који садржи 100 У/мЛ тирозиназе печурака. Л-ДОПА супстрат (1 мМ) је додат у реакциону смешу и затим је инкубирана 10 минута на собној температури. Промена апсорпције на 490 нм је мерена сваких 1,5 мин током 15 мин коришћењем читача микроплоче. Проценат инхибиције тирозиназе је израчунат по следећој формули:

Тест антиоксидативне активности

Антиоксидативна активност екстракта цвета Ц. фистула одређена је коришћењем 1, 1-дифенил-2-пикрилхидразил (ДППХ)-активности слободних радикала, као што је претходно описано [28]. Различите концентрације екстракта цвета (0–100 уг/мЛ) су припремљене у метанолу. 1 мЛ 0,002 процента ДППХ је додат у 1 мЛ раствора цветног екстракта и смеша је држана у мраку 30 минута. Апсорбанца је мерена на 517 нм коришћењем спектрофотометра. Проценат инхибиције је израчунат и упоређен са стандардним витамином Е (1–100 уг/мЛ) користећи следећу формулу:

Антиоксидативна активност екстракта цветова Ц. фистула је потврђена коришћењем АБТС теста, као што је претходно описано [29]. Катион радикала АБТС [2,2′-азино-бис (етилбензтиазолин-6-сулфонска киселина)] је припремљен мешањем 7 мМ матичног раствора АБТС са 2,45 мМ калијум персулфата (К2С2О8) (1/1, в/в). Смеша је инкубирана у мраку 12-16 х док се реакција не заврши. Тест је спроведен на 990 μЛ АБТС раствора и 10 μЛ екстракта цвета (0–4 уг/мЛ). После 6 минута, апсорбанца је одмах забележена на 734 нм помоћу спектрофотометра. Проценат инхибиције АБТС активности екстракта цвета израчунат је коришћењем следеће једначине:

Статистичка анализа

Сви подаци су представљени као средње вредности ± стандардна девијација (СД). Статистичка анализа је анализирана софтвером Присм верзије 6.0 коришћењем једносмерне АНОВА са Данетовим тестом. Статистички значај је утврђен на * п < 0.05, ** п < 0.01, ***п < 0,001 или **** п < 0,0001.

Резултати

Фитокемијска карактеризација екстракта цвета Ц. фистула

Након корака који је укључивао сушење узорака замрзавањем, екстракт цвета Ц. фистула је измерен и даље подвргнут фитокемијским и биолошким студијама. 18.08 г екстракта цвета Ц. фистула добијено је из 500 г сировог материјала, а проценат приноса екстракта цвета био је 3,62. ХПЛЦ отисак екстракта цвета Ц. фистула је одређен ХПЛЦ анализом (слика 1). ХПЛЦ профил који је показао врхунац фенолних једињења је обележен у смислу појединачних компоненти у сваком времену задржавања. Карактеризација фенолних једињења екстракта цвета Ц. фистула приказана је у табели 1. Укупан садржај фенола у екстракту цвета износио је 275,32 ± 14,21 мг ГАЕ/г екстракта. Утврђено је да су деривати хидроксибензојеве киселине, укључујући ванилну киселину и протокатехуинску киселину, {{20}},95 ± 0.09 и 2,56 ± 0. 42 мг/г екстракта, респективно, док је гална киселина забележена на {{30}}.60 ± 0.02 мг/г екстракта. Деривати хидроксициметне киселине, укључујући кумаринску киселину, ферулинску киселину и хлорогенску киселину, детектовани су на 0,39 ± 0,08, 0,80 ± 0,09 и 0,83 ± 0,03 мг/г екстракта, респективно. Садржај флавоноида био је 27,62 ± 3,56 мг ЦЕ/г екстракта. Катехин, као дериват флавонола, измерен је на 1,10 ± 0.00 мг/г екстракта.

【За више информација:george.deng@wecistanche.com / ВхатАпп:86 13632399501】