Контакт:jerry.he@wecistanche.com

Ми Иоунг Ахн1*, Бан Ји Ким1, Ха Јеонг Ким1, Јае Сам Хванг1, Ии-Соок Јунг2 и Кун-Коо Парк3

Цистанцхе има ефекат против старења

Апстрактан

Позадина: Ова студија је имала за циљ да проценипротив старењаефекат новоприпремљеног једињења добијеног од инсеката, гликозаминогликана балеге (ГАГ), датог интраперитонеално старим СД пацовима као део њихове исхране током 1 месеца. Утврђено је да је примена ГАГ инсеката повезана са смањењем оксидативног оштећења, нивоа хепато-ћелијских биомаркера, садржаја карбонила протеина и концентрације малондиалдехида. Тхепротив старења-повезани молекуларно генетски механизми ГАГ балеге бубе још увек нису у потпуности разјашњени.

Резултати: Цатхарсиус молоссус (врста балеге) ГАГ (ЦаГ) је поседоваопротив старењаактивности; смањио је ниво креатинин киназе у серуму, имао вазорелаксансу у аорти и кардиопротективно дејство, и одржава нормалан ниво глукозе код третираних пацова. Анализа микромрежа је обављена са низом клонова 30 К цДНК пацова да би се идентификовали профили експресије гена 14-месечних СД пацова третираних гликозаминогликаном балеге бубе 5 мг/кг (ЦаГ5) током 1- месецном периоду, што је урађено да би се испитала његовапротив старењаефекат у поређењу са Бомбус игнитусом (врста бумбара), матицом ГАГ 5 мг/кг (ИКГ5) или хондроитин сулфатом 10 мг/кг. ЦаГ5 и ИКГ5 су имали изражене антиинфламаторне ефекте, што је довело до инхибиције вредности слободне масне киселине, мокраћне киселине, сГПТ, ИЛ-1 бета и ЦК. Поред тога, примећени су антикоагулантни и антитромботички ефекти: концентрација фактора 1 (фибриноген) је повећана у плазми пацова третираној са ЦаГ. Група пацова третирана ЦаГ5-, у поређењу са контролном, показала је појачану регулацију 131 гена, укључујући липокалин 2 (Лбп) и инхибитор серин пептидазе, Касзал тип 3 (Спинк3), и 64 гена са смањеном регулацијом, укључујући лизил оксидазу (Лок ), серин дехидратаза (сдс) и ретинол сатураза (Ретсат).

Закључак: Наши подаци сугеришу да гликозаминогликан балеге може бити користан третман за старе пацове, што указује на његов потенцијал као терапеутског биоматеријала за старење.

Кључне речи: ефекат против старења, балега буба (Цатхарсиус молоссус), краљица Б. игнитус, гликозаминогликан

Позадина

коришћени, путем пречишћавања, екстракције и идентификације моћних активних састојака, као функционална храна или лекови. Екстракти балеге бубе Цатхарсиус молоссус, који се налазе у Кини, показали су изражену фибринолитичку активност и антиоксидативне и антихипергликемијске ефекте на пацовима који су храњени храном са високим садржајем масти [9, 10]. Садржај протеина карбонила у крви и концентрација малондиалдехида у ткиву јетре третираног етанолом балеге или екстрактом ацетона током 1-месечног периода, значајно су смањени у поређењу са контролом [10]. Недавно је откривено да пептид корејске балеге, ЛЛЦИАЛРКК-НХ2, који је 9-мер пептид изведен из Цоприс трипартитус Цоприсин, испољава бактерицидну активност против Е. цоли и антимикробну активност изазивајући озбиљно оштећење ДНК , који индукује смрт налик апоптози [11]. Пчеларски производ, алкохолни екстракт Б. игнитус куеен (БИК) има највећу потенцијалну ефикасност међу свим екстрактима бумбара који су тестирани за лечење упале код СД пацова, пошто је значајно смањио едем шапа [12]. Дакле, припремили смо ГАГ добијене од највећег могућег броја матица Ц. молоссус или Б. игнитус да бисмо тестирали њиховепротив старењасвојства. Старење подразумева прогресивно опадање физиолошких капацитета организма, а манифестује се нагомиланим променама и дестабилизацијом на нивоу целог система [13]. Старење је такође повезано са диференцијалним обрасцем експресије гена који указује на смањен одговор на стрес међу метаболичким и биосинтетичким генима [14]. Конкретно, повећање висцералног масног ткива повезано са годинама или гојазношћу обично је праћено хроничном инфламацијом ниског степена, за коју се претпоставља да је узрок различитих метаболичких болести, укључујући рак, кардиоваскуларне болести и, што је најистакнутије, тип два дијабетеса [15]. Ови ГАГ-ови инсеката могу се користити у области која се брзо развија са перспективом коришћења ткивног инжењеринга и биоматеријала као нових терапија [16].

У овој студији извештавамо да се ГАГ од балеге и БИК приказујепротив старењасвојства и, према томе, ова једињења имају велика обећања за употребу каопротив старењаагенти. Такође, демонстрирамо потенцијалну вредност гликозаминогликана балеге Ц. молоссус у смањењу штетних аспеката старења, мерено иу серуму и у обрасцима експресије гена 14-месечних СД пацова након третмана током 1 месеца.

Методе

Материјали

Припрема гликозаминогликана од инсеката

Осушени Ц. молоссус је купљен на локалном тржишту у Кини; бумбара (краљица Бомбус игнитус) узгајана је и сушена замрзавањем на Одељењу за пољопривредну биологију Националне академије пољопривредних наука, Јужна Кореја. Хондроитин сулфат и сви реагенси су испоручени из Сигма Алдрицх (Ст. Лоуис, Мо., САД).

Сваки од једног килограма (1 кг) осушеног инсеката је натопљен и екстрахован три пута етанолом ултразвуком (Брансон, Колорадо, МИ, САД) у трајању од 30 мин. Остаци издвојени из алкохолних екстраката су два пута одмашћени са 2 запремине ацетона. Приближно 200 г осушеног, одмашћеног и уситњеног праха суспендовано је у 2 Л 0.05 М натријум карбонатног пуфера (пХ 9). Суспензија је инкубирана 48 х на 60 степени након додавања 28 мл (1,4 процента) алкалазе (Сигма Алдрицх, Ст. Лоуис, Мо., САД). Смеша за варење је охлађена на 4 степена и додата је трихлорсирћетна киселина до коначне концентрације од 5 процената. Узорак је помешан, остављен да стоји 1 х, а затим центрифугиран 30 мин на 8000 × г (Ханил Сциенце Индустриал, Инцхеон, Јужна Кореја). Три запремине 5 процената калијум ацетата у етанолу су додате у једну запремину супернатанта. После мешања, суспензија је чувана преко ноћи на 4 степена, а затим центрифугирана. Преципитат од 20 г растворен је у 40 мл 0,2 М НаЦл и центрифугиран. Цетилпиридинијум хлорид (5 процената) је додат у 0,2 пута запремину супернатанта, а преципитат је сакупљен центрифугирањем. Талог је растворен у 20 мл 2,5 М НаЦл. Додато је пет запремина етанола, а талог је одвојен центрифугирањем. Преципитат је растворен у води и дијализован у односу на 100 запремина воде [17], а дијализовани сирови гликозаминогликан је осушен замрзавањем да би се добило око 1,1 г ЦаГ, 4,89 г ИКГ као прах. Сирови ГАГ је стављен на колону ДЕАЕ Сепхадек А-25 за гел хроматографију (40 к 1,2 цм) уравнотежену са 50 мМ фосфатног пуфера (пХ 7,4). Фракције су елуиране коришћењем линеарног градијента натријум хлорида од 0 до 2,5 М НаЦл у фосфатном пуферу при брзини протока од 20 мл/х, а дијализовани гликан је осушен замрзавањем до чистог ГАГ.

Животиње

Спрагуе Давлеи (СД) пацови (мужјаци), у доби од 8-месеца, набављени су од Самтако Цо. Лтд. (Осан, Кореја). Све процедуре су биле у складу са НИХ смерницама за негу и употребу лабораторијских животиња. Сви експерименти су одобрени од стране Етичког комитета за лабораторијске животиње Националне академије пољопривредних наука, РДА, Јужна Кореја (НААС1503) и следили су националне смернице за негу и употребу животиња (индивидуални смештај). Пацови су аклиматизовани 6 месеци у нормалним условима узгоја (23 ± 2 степена Ц, 55 ± 10 процената влажности и 12 х циклуса светлост/мрак) и храњени су нормалном исхраном (Д10001, АИН-76Дијета за глодаре, истраживање Диет Инц., Нев Брунсвицк, Њ, САД) и вода ад либитум. 14-месечни пацови су подељени у 4 групе за третман од по 10 пацова и распоређени према сличности у тежини (680,2 ± 9,20 г). Третмани су давани у ПБС-у дневно и сваки је даван интраперитонеално.

Групе су биле контролне, дате су 5 мг/кг ЦаГ (ЦаГ5), 5 мг/кг ИКГ (ИКГ5) и 10 мг/кг ЦС (ЦС10) (Сигма Алдрицх Цо., САД). Свака група је одржавана на нормалној исхрани (АИН-76дијета за глодаре, дијета за истраживање) и на третману узорка током 1 месеца (шема 1).

Тежина масног ткива

Одређени су односи абдоминалне и епидидималне масти према телесној тежини. Мерења су обављена након жртвовања на крају периода лечења од 1- месеца.

Густина адипоцита

Изрезани органи и масно ткиво су фиксирани 10 посто неутралног формалина. Након уградње парафина, обојени су хематоксилином и еозином и толуидин плавим О, прегледани светлосном микроскопијом (Леица ЦТР6000, Хесен, Немачка) и фотографисани. Густина адипоцита (ћелије/мм2) одређена је у третираном и контролном ткиву толуидин плавом О бојењем (оригинално увећање, к400).

Узимање крви и крв, плазма, анализа серума

На четири групе под називом ЦОН, ЦаГ5, ИКГ5, ЦС10 (н =10), након 1 месеца лечења, крв (~5 мл) је сакупљена из задње шупље вене под лаганом инхалацијом ЦО2 и коришћена за мерења хемије серума. Испитани параметри су укључивали фосфолипиде, хијалуронску киселину, слободну масну киселину, албумин, алкалну фосфатазу (АЛП), глутаминско-оксалосирћетну трансаминазу (ГОТ), глутаминску пирувичну трансаминазу (ГПТ), лактичну дехидрогеназу (ЛДХ), ЦК (фосфазокреатинино-глуфосфатазу). , укупни триглицерид холестерола, ХДЛ холестерол, ЛДЛ холестерол, креатинин, азот урее у крви (БУН), укупни протеин, мокраћна киселина и ц-реактивни протеин (ЦРП). Сви параметри су процењени коришћењем аутоанализера (Хитацхи 7060 аутоматски клинички анализатор, Токио).

Узимање узорака крви и анализа плазме за откривање антикоагулантне активности

После 1-месечних третмана, приближно 4 мл плазме је сакупљено из задње шупље вене под лаганом инхалацијом ЦО2 и центрифугирано. Супернатант је коришћен за време згрушавања као тест антикоагулантне активности: активирано парцијално тромбопластинско време (АПТТ), тромбинско време, протромбинско време и фактор 1 (фибриноген) као тест фибринолитичке активности користећи претходно поменути аутоматски клинички анализатор према приручнику Греен Цросс Лаб-а.

Оксидативно оштећење липида

Да би се одредило оксидативно оштећење липида у хепатоцитима пацова, мерени су нивои малондиалдехида (МДА) помоћу теста пероксидације липида коришћењем методе боје која укључује реактивне супстанце тиобарбитурне киселине (ТБАРС) на 535 нм [18].

Оксидативно оштећење протеина

За одређивање садржаја карбонила коришћени су супернатанти хомогената јетре и крв добијени центрифугирањем. Протеински оксидативни стрес је процењен мерењем садржаја карбонила протеина у крви. Садржај карбонила је одређен ензим-везаним имунотестом у складу са протоколом произвођача за ОкиСелецт™ протеин карбонил ЕЛИСА комплет (Целл Биолабс, Инц., Сан Диего, ЦА, УСА). ЦАТ активност (У/мг протеин) мерена је на основу ЦАТ посредоване разградње Х2О2 [19].

Препарат хомогената јетре за детекцију оксидативних ензима

Отприлике четири групе под називом ЦОН, ЦаГ5, ИКГ5, ЦС10, ткива јетре су хомогенизована на леду у раствору за екстракцију протеина ПРО-ПРЕП™ пуфера за лизу 10-преструког волумена (иНтРОН, Бусан, Кореја). Супернатант хомогената јетре након центрифугирања (800 г, 10 мин) је испитан на каталазу, глутатион пероксидазу, глутатион с-трансферазу и супероксид.

активност дисмутазе према приручнику за анализу (ОкиСелецт™ ЕЛИСА комплет, Целл БиоЛабс, ИнЦ., Сан Дијего, Калифорнија, САД).

Анализа цитокина ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-10

На четири групе под називом ЦОН, ЦаГ5, ИКГ5, ЦС10, ниво ИЛ- 1 или ИЛ − 6 или ИЛ − 10 у серуму пацова третираним ГАГ инсеката мерен је коришћењем комерцијалних Елиса комплета (Куанти-кине, Р&Д Системс, Инц. , Миннеаполис, МН, САД) према упутствима произвођача.

Припрема РНК и квантитативна ПЦР анализа у реалном времену

Укупна РНК је изолована из јетре коришћењем ТРИзол реагенса (Инвитроген, Царлсбад, Калифорнија, САД), а концентрација и чистоћа РНК мерене су коришћењем УВ/Вис спектрофотометра (Бецкман Цоултер Цо., Миами, ФЛ, УСА). Комплементарна ДНК (цДНК) је синтетизована из 1 г укупне РНК коришћењем комплета за реверзну транскрипцију цДНК високог капацитета (Амерсхам Биосциенцес Цо., Писцатаваи, Њ, САД). Умножавање ланчане реакције полимеразе у реалном времену (ПЦР) је изведено са Повер СИБР Греен Мастер Мик-ом користећи 7500 Реал-Тиме ПЦР систем (оба од Апплиед Биосистемс), према упутствима произвођача. За детекцију транскрипата циљних гена, дизајнирали смо специјално унапред и реверзне олигонуклеотидне прајмере користећи Беацон Десигнер софтвер (ПРЕМИЕР Биософт, Пало Алто, Калифорнија, САД). Секвенце прајмера су наведене у Шеми 2. Циљни нивои мРНК су нормализовани коришћењем глицералдехид 3- фосфат дехидрогеназе (ГАПДХ) као интерне контроле да би се квалификовала релативна експресија циљне мРНК према методи прага циклуса. Сви узорци су анализирани у три примерка.

Прајмер секвенце за амплификацију гена укључених у механизам поправке ћелија и ГАПДХ интерни стандард (шема 2).

Поступак ДНК микромрежа

Након хистопатолошке анализе, извршена је хибридизација микромрежом на узорцима јетре [20]. Укупна РНК је изолована из ткива јетре коришћењем Киаген РНеаси Миди комплета (Киаген, Валенсија, Калифорнија, САД). ФаирПлаи™ комплет за обележавање микромрежом (Стратагене, Ла Јолла, ЦА, УСА) је коришћен у складу са упутствима произвођача. Обележена ДНК је набачена на микрочип. Хибридизациона комора је састављена са микромрежним чипом, Рат Геноме 230 2.0 Арраи (Аффиметрик Инц., Санта Цлара, САД), и потопљена у водено купатило преко ноћи на 60 степени. Чип микромрежа је испран у пуферу за прање И, пуферу за прање ИИ, а затим у пуферу за прање ИИИ током 5 или 15 минута. Слајд је сушен центрифугирањем на 500 г током 15 минута и скениран БМС Арраи Сцаннером, примењеним прецизним читачем Арраи Ворк еБиоцхип (БиоРад, Даллас, ТКС, САД), коришћењем Ци3 и Ци5 канала [21].

Изолована анализа срца пацова

Мужјаци Спрагуе-Давлеи пацова, тежине 350 ± 50 г, анестезирани су пентобарбиталом (100 мг/кг). У репну вену је убризган хепарин (1000 У/кг), а затим је интубиран трахеја. Док су пацови механички вентилирани помоћу вентилатора за глодаре (модел 7025; Уго Басиле, Цомерио-Варесе, Италија), њихова срца су перфузирана ин ситу са оксигенираним модификованим Кребс-Хенселеит бикарбонатним пуфером ретроградном аорталном канулацијом. Срца су затим изрезана и премештена у Лангендорфф апарат (Хуго Сацхс Елецтроник, Марцх-Хугстеттен, Немачка), где су перфузирана оксигенисаним модификованим Кребс-Хенселеит бикарбонатним пуфером при константном перфузионом притиску од 75 ммХг. Водом напуњена комора од латекса је уведена кроз плућну вену и повезана са Исотец трансдуктором притиска (Хуго Сацхс Елецтроник) за мерење притиска у левој комори (ЛВП). Срцима је остављено да се уравнотеже током 15 минута, када је крајњи дијастолни притисак леве коморе (ЕДП) подешен на 10 ммХг, а овај волумен балона је одржаван током експеримента. Затим, основна контрактилна функција, откуцаји срца и коронарни проток (екстракорпорална електромагнетна сонда; нарко Био-системи, Хјустон,

ТКС, САД). Срчана контрактилна функција је израчуната одузимањем ЛВЕДП од максималног систолног притиска ЛВ (ЛВСП), дајући развијени притисак (ЛВДП). После 1 х еквилибрације, аортни прстенови су третирани носачем (физиолошким раствором) или ЦаГ (10 уг/мл, 100 уг/мл) 10 минута пре него што је контракција индукована фенилефрин 1 μМ. Затим је ацетилхолин (0,1–100 μМ) индуковао релаксацију зависну од ендотела [22].

Статистичка анализа

Средње вредности и стандардна грешка свих проучаваних параметара одређене су за сваку групу коришћењем АНОВА теста. Студентов т-тест је спроведен да би се утврдиле значајне разлике између контролне и третиране групе. А п вредност<0.05 was="" considered="">

Резултати

Промене телесне тежине и масног ткива

Није било значајних разлика у средњој телесној тежини између третираних група (слика 1). Током 1-месечног периода примене, телесна тежина остарелих мужјака пацова била је упоредива у контролној и ЦаГ-, ИКГ- и ЦС групама које су третиране. Средње недељне телесне тежине су представљене на слици 2а: ЦОН, 685,16 ± 9,14 г; ЦаГ5, 659,54 ± 14,21 г; ИКГ5, 646,50 ± 11,56 г, и ЦС1{51}}, 662,93 ± 7,82 г. Средња количина трбушне масти је значајно смањена у групама ИКГ5 и ЦС10 у поређењу са контролом: 21,84 ± 7,46 г за контролу; 20,66 ± 8,47 г за ЦаГ5; 16,56 ± 5,97 г за ИКГ5 (ИКГ5 наспрам ЦОН, п < 0,05);="" и="" 16,93="" ±="" 5,17="" г="" за="" цс10="" (цс10="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05)="" (слика="" 2а).="" епидидимидна="" маст="" је="" такође="" значајно="" смањена="" у="" икг5="" и="" цс10="" групама="" у="" поређењу="" са="" контролом:="" 10,38="" ±="" 2,58="" г="" за="" контролу;="" 8,19="" ±="" 4.00="" г="" за="" цаг5;="" 7.00="" ±="" 1,35="" г="" за="">

(ИКГ5 вс ЦОН, п < 0.05);="" и="" 8,56="" ±="" 2,53="" г="" за="" цс10="" (цс10="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05)="" (слика="">

Густина адипоцита

Густина адипоцита [број ћелија/површина (мм2)] ткива јетре пацова третираних ГАГ-ом у ХФД, како је процењено бојењем толуидин плавим О, смањена је за ЦаГ5 (33.00 ± 1,73), ИКГ5 (45 .00 ± 4,36), или ЦС10 (26.00 ± 2,52) (ЦС10 наспрам ЦОН, п < 0,05) у поређењу са контролном (51.00 ± 5,29) (слика 2б).

Промене крвног притиска и откуцаја срца

Нису примећене значајне разлике у крвном притиску (систолни крвни притисак или број откуцаја срца) између група које су третиране са 5 мг/кг ЦаГ-, ИКГ- или ЦС и контролне групе (подаци нису приказани).

Хематологија и хемија крви

Уочене су неке промене зависне од дозе између третиране и контролне групе у погледу хематолошких параметара испитиваних на крају експеримента. Дошло је до повећања АПТТ-а (сек.) од 27,5 процената у групи која је третирана ЦаГ5-: ЦОН, 35,68 ± 5,68; ЦаГ5, 45,49 ± 10.91; ИКГ5, 29,93 ± 3,57; ЦС10, 36,83 ± 23,95 (слика 3). Тромбинско време (сек.) је било следеће: ЦОН, 40,18 ± 2,04; ЦаГ5, 42,13 ± 3,23; ИКГ5, 36,15 ± 6,67; ЦС10, 45,02 ± 21,89. Дошло је до значајног (62,6 процената) повећања фактора И (фибриноген, мг/дЛ) у групи која је третирана ЦаГ5-: ЦОН, 429,33 ± 142,22; ЦаГ5, 698,29 ± 120,28 (ЦаГ5 наспрам ЦОН, п < 0,05);="" икг5,="" 627,14="" ±="" 160,67;="" цс10,="" 790.00="" ±="" 274,22="" (цс10="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05).="" протромбинско="" време="" (сек.)="" је="" било="" следеће:="" цон,="" 62.86="" ±="" 47,30;="" цаг5,="" 52,71="" ±="" 4,96;="" икг5,="" 52,14="" ±="" 5,58;="" цс10,="" 55.00="" ±="">

Биохемија серума

У серумима из група третираних ИКГ и ЦС (Табела 1), нивои фосфолипида (мг/дЛ) су били значајно нижи него у контролним серумима након 1 месеца код старијих пацова: ЦОН, 271,78 ± 91,74; ЦаГ5, 233,67 ± 71.0; ИКГ5, 173,2 ± 32.{{20}}2 (ИКГ5 наспрам ЦОН, п < 0.05);="" цс10,="" 259,7="" ±="" 57,27="" (цс10="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05).="" нивои="" слободних="" масних="" киселина="" (μек/л)="" су="" смањени:="" цон,="" 686,78="" ±="" 104,67;="" цаг5,="" 431,33="" ±="" 66,22="" (цаг5="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05);="" икг5,="" 405,6="" ±="" 63,39="" (икг5="" наспрам="" цон,=""><0.05); cs10,="" 566.9="" ±="" 115.38="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). also,="" serum="" gpt="" (alt)="" levels="" (iu/l)="" in="" the="" cag-="" and="" iqg-="" treated="" groups="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" control="" group="" in="" aged="" rats:="" con,="" 76.33="" ±="" 40.21;="" cag5,="" 36.78="" ±="" 8.0="" iu/l;="" iqg5,="" 43.22="" ±="" 13.86="" (iqg5="" vs.="" con,p="" <="" 0.05);="" cs10,="" 53.44="" ±="" 11.36="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). fur-="" thermore,="" the="" mean="" creatinine="" phosphokinase="" (ck="" u/l)="" level="" in="" the="" cag-treated="" group="" was="" lower="" than="" that="" in="">

контролна група код старих пацова: ЦОН, 125,78 ± 91,66; ЦаГ5, 1{{10}}2,89 ± 65,73 (ЦаГ5 наспрам ЦОН, п < 0.05);="" икг5,="" 91,22="" ±="" 24,74;="" цс10,="" 131,2="" ±="" 62,56.="" средња="" серумска="" глукоза="" (мг/дл)="" је="" значајно="" смањена="" код="" старијих="" пацова="" (свака="" група="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05):="" цон,="" 435,11="" ±="" 105,42;="" цаг5,="" 304,0="" ±="" 44,44;="" икг5,="" 275,9="" ±="" 43,18;="" цс10,="" 317,8="" ±="">

Средњи ниво укупног холестерола (мг/дл) у групи третираној ИКГ био је нижи него у контролној групи код старијих пацова, а та разлика је такође била значајна: ЦОН, 212,67 ± 92,82; ЦаГ5, 181,44 ± 68,4; ИКГ5, 124,1 ± 23,6 (ИКГ5 наспрам ЦОН, п < 0.05);="" цс10,="" 198,9="" ±="">

Поред тога, нивои триглицерида (мг/дЛ) су били следећи: ЦОН, 207,89 ± 101,95; ЦаГ5, 136,22 ± 61,6; ИКГ5, 103,3 ± 35,59 (ИКГ5 наспрам ЦОН, п < 0.05);="" цс10,="" 183,4="" ±="" 104,74.="" нивои="" лдл="" холестерола="" (мг/дл)="" су="" смањени:="" цон,="" 74,67="" ±="" 44,91;="" цаг5,="" 69,0="" ±="" 31,3;="" икг5,="" 41,44="" ±="" 10,14="" (икг5="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05);="" цс10,="" 65,22="" ±="" 18,52.="" значајно="" смањење="" нивоа="" мокраћне="" киселине="" (мг/дл)="" примећено="" је="" у="" свим="" групама="" третираним="" гаг="" у="" поређењу="" са="" контролном="" (свака="" група="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05):="" цон,="" 10,9="" ±="" 2,26;="" цаг5,="" 8,12="" ±="" 1,48;="" икг5,="" 6,49="" ±="" 0,89;="" цс10,="" 8,14="" ±="" 2,17,="" табела="">

Смањење оксидативног оштећења

Малондиалдехид (МДА, нмол/мл) је анализиран након 1 месеца сваког ГАГ третмана [ЦОН, 252,9 ± 13,1; ЦаГ5, 175,1 ± 5,8 (смањење за 30,32 посто). Сваки третман ГАГ-ом и хондроитин сулфатом смањио је пероксидацију липида у хепатоцитима (слика 4а). Концентрација карбонила протеина у крви смањена је у односу од 68,52 процената, 36,89 процената и 53,70 процената у ГаГ5, ИКГ5 и ЦС10, респективно (слика 4б). Али, сваки ГАГ није имао статистичке разлике у поређењу са контролом у садржају карбонила хепатоцита (подаци нису приказани).

Квантификација оксидативних ензима (каталаза, ГПк, ГСТ, СОД).

Активност каталазе (мг протеина/мин) у хепатоцитима после 1 месеца ГАГ третмана била је следећа: ЦОН, 17,72 ± 2,81; ЦаГ5, 19,87 ± 3,88; ИКГ5, 17,22 ± 4,55; ЦС10, 19,23 ± 3,55. Повећана је активност каталазе у свим групама хепатоцита третираних са ЦаГ. Супер оксид дисмутаза (СОД) је ензим за уклањање слободних радикала (супер оксида). Активност СОД (нмол/мин/мл) повећана је у третираним групама у поређењу са контролом: контрола, 381,44 ± 85,32; ЦаГ5, 400,56 ± 60,62; ИКГ5, 386,72 ± 69,22; ЦС10, 513,05 ± 60,07. Активност глутатион пероксидазе (јединица/мг протеина) у групи хепатоцита третираних ЦаГ је значајно повећана третманом (ЦаГ5 наспрам ЦОН, п < 0,05),="" а="" активност="" глутатион="" с-трансферазе="" (нмол/мин/мл)="" у="" цаг="" група="" је="" такође="" значајно="" повећана="" у="" односу="" на="" контролну="" групу="" (цаг5="" наспрам="" цон,="" п="">< 0,05)="" (табела="">

Производња цитокина ИЛ-1 и ИЛ-10

Повећање нивоа ИЛ-10 примећено је у групи која је третирана ЦаГ. Нивои ИЛ-1 (ρг/мл) у серуму су смањени за 1

Табела 1. Серолошки налази остарелих пацова третираних ЦаГ или ИКГ током 1 месеца

месец ЦаГ или ИКГ третмана, демонстрирајући антиинфламаторно дејство једињења: контрола, 251,3 ± 70.7; ЦаГ5, 102,9 ± 9,5; ИКГ5, 110,4 ± 5,2; ЦС10, 110,4 ± 10,1 (свака група наспрам ЦОН, п < 0,05).="" ил-10="" активност="" (ρг/мл)="" после="" 1="" месеца="" цаг="" третмана="" код="" пацова="" је="" повећана:="" цон,="" 34,9="" ±="" 11,5;="" цаг5,="" 67,4="" ±="" 13,3="" (цаг5="" наспрам="" цон,=""><0.05); iqg5,="" 55.5="" ±="" 24.7;="" cs10,="" 28.0="" ±="" 3.8="" (fig.="" 5).="" the="" il-10="" levels="" in="" the="" cs10="" group,="" was="" statistically="" different="" from="" that="" in="" the="" con="" group="" (cs10="" vs.="" con,p=""><>

Експресија гена квантитативном ПЦР анализом у реалном времену

The data represented that PCR cycle required number (Ct value) when the concentration of PCR amplicon are equilibrated by sample amplicon. Median CT values of 5 sample's represented, but there was no difference from the control group (Ct vale >2.0) на коришћеној секвенци прајмера (подаци нису приказани).

ДНК микромреж

Анализа микромрежа коришћењем мишјег 28 К цДНК низа клонова је обављена да би се идентификовали профили експресије гена у јетри СД пацова третираних са ЦаГ, ИКГ и ЦС третираним 15- месец дана старим СД пацовима и да би се пружиле информације о потенцијалнимпротив старењамаркери.

У поређењу са контролном групом, ЦаГ5 група је показала 2- до 4- пута повећање у 118 гена, 4- 8- пута повећање код 11 гена и више од 8- пута повећање у 2 гена. Нивои експресије преосталих ~30,000 гена су остали исти. Шездесет гена је смањено са 2- на 4-пут, а 4 су показала 4- до 8- пута смањење.

У ИКГ5 групи у поређењу са контролном групом, 162 гена су се повећала за 2- до 4- пута, 10 гена су порасла 4- до 8- пута, а 3 гена су порасла за више од 8- пута. С друге стране, 66 је смањено за 2- до 4-пута, а 7 је смањено за 4- на 8- пута.

Табела 2 Активности антиоксидативних ензима гликозаминогликана балеге у јетри старих пацова

У ЦС10 групи у поређењу са контролном групом 63 гена су повећана 2- до 4- пута, 2 гена су повећана 4- до 8- пута, а 2 гена су повећана за више од 8- пута. Тридесет осам гена је смањено 2- до 4-пута, 4 су смањено 4- до 8- пута, а 4 су смањена више од 8-пута.

У поређењу са контролном групом, ген за липокалин2 (Лцн2) је повећан за око 10-пута у ЦаГ5- третираном ткиву јетре, 46- пута у ИК5 групи и {{6} }пресавијте у ЦС10 групу. У ткивима јетре мишева третираних ЦаГ5-, лизил оксидаза (Лок) је смањена у односу 0,13, односно смањена је експресија гена. Група пацова третирана ЦаГ5, у поређењу са контролном, показала је да је 131 ген укључујући липокалин 2, протеин који везује олигосахариде (Лбп) и инхибитор серин пептидазе, Касзал тип 3 (Спинк3) појачан (Табела 3) и 64 гена укључујући лизил оксидазу (Лок), серин дехидратаза (сдс) и ретинол засићени (Ретреат) су били смањени (Табела 4). Група која је третирана ЦаГ{20}}у поређењу са контролном групом, показала је повећану регулацију 131 гена, укључујући липокалин 2, протеин који везује олигосахариде (Лбп) и инхибитор серин пептидазе Касзал тип 3 (Спинк3) (табела 3 ) и смањење регулације 64 гена, укључујући лизил оксидазу (Лок), серин дехидратазу (сдс) и ретинол засићење (Ретсат) (Табела 4). Ови подаци указују на липокалин 2 и адипокине, као појачано регулисане гене, и лизил оксидазу (у вези са хепараназом), као нискорегулисани ген, као потенцијалне терапеутске маркере који делују против старења и гојазности.

Карактеризација ЦаГ

Састав амино, киселих и неутралних моносахарида ГаГ одређен је помоћу ГЦ-МС (Табела 5). Примарни амино моносахариди ЦаГ су следећим редоследом: Д-глукозаминска киселина > Н-ацетил-галактозамин > Н-ацетил-Д-гактозаминитол > галактозамин ХЦл > галактозаминска киселина > галактозамин > глукуронска киселина. Такође, неутрални моносахариди који се налазе у ЦаГ су углавном - глукоза и манитол, док су мањи моносахариди арабиноза и рамноза.

Индикатори кардиопротекције

У овом експерименту смо окарактерисали директан ефекат ЦаГ на артерије отпора користећи судове инкубиране ин витро са контракцијом изазваном фенилефрином и релаксацијом изазваном ацетилхолином. ЦаГ је оцењен као кардиопротективни агенс. Крива концентрација-одговор на ЦаГ је померена наниже у поређењу са оном која је виђена након контролног третмана (само ПБС), показујући да се стимулација срца одвија на начин који зависи од концентрације (слика 6).

Дискусија

Старење је процес прогресивног опадања физиолошких капацитета организма, који се манифестује нагомиланим променама и дестабилизацијом на нивоу целог система [13]. Сматра се да гликозаминогликан умањује штетне ефекте старења спречавањем уништавања хрскавице, костију, дискова, коже [23], васкуларног система [8], итд. тренутно се сматра једним од утврђених биокомпатибилних и компатибилних са крвљу

биоматеријали који нуде изванредан однос структуре и својстава као што је имобилизација хепарина на хитозаном модификованим полиуретанским графтовима са антиадхезивним и антимикробним својствима [24]. У данашње време, појава контроле температуре омогућила је пројектовање система за узгој инсеката великих размера. Дакле, гликозаминогликан

може се добити из кортекса инсеката као остатак екстракта алкохола. Такви сирови лекови из балеге и матица Б. игнитус су проучавани у настојању да се идентификују њихове активне компоненте или да се екстракти учине безбеднијим за људску употребу. Балега буба Ц. молоссус је пречишћена да би се добили Н-ацетилдопамин димери, молосусамид АЦ (1–3), показујући

ЦОКС-1 и ЦОКС-2 инхибиторна активност [25]; хитозан [26]; меланин [27]; и серинске протеазе [9, 28]. Показало се да екстракт бумбара (Бомбус игнитус) садржи серинску протеазу пчелињег отрова [29], пероксиредоксине [30] и протеин за препознавање пептидогликана (ПГРП-С) [31].

Стратегије за спречавање или одлагање старења укључивале су узимање антиоксиданата за поправку оксидативног ћелијског оштећења ДНК, протеина и липида, као и регенерацију ткива посредовану матичним ћелијама и генску терапију [32]. Као маркер оксидативног оштећења липида у стањима оксидативног стреса липида хепатоцита, малондиалдехид је смањен ЦаГ третманом. Такође, садржај карбонила у крви, посебно неутрофила, смањен је ЦАГ третманом и показао је поправљање оштећења ћелијског оксидативног протеина.

Гликозаминогликани из матица Ц. молоссус и Б. игнитус састоје се углавном од Д-глукозаминске киселине као киселог моносахарида и Н-ацетил-галактозаминитола као аминокиселине

моносахарида, заједно са -глукозом и Д-манитолом као неутралним моносахаридима. Дакле, једињење може приступити рецепторима ћелијске мембране и може спречити узроке болести повезаних са старењем мењајући енергетски метаболизам. Гликозаминогликани могу да поправе везивно ткиво [23], еродирану хрскавицу, дискове, кости и гликопротеине на молекуларном нивоу, при чему ГАГ формира везу између протеина [9]. У овом експерименту коришћени пацови су били стари и тежили су око 680 г, тако да није било лако постићи смањење телесне тежине, али смо приметили смањену масу масног ткива и број адипоцита. Као и код већине гликозаминогликана, ЦаГ и ИКГ су довели до смањења серумских нивоа параметара повезаних са запаљењем: слободне масне киселине, АСТ (СГПТ), креатинин киназе (повезане функције срца), глукозе, мокраћне киселине и хипергликемије. нивои: холестерола, укупног, триглицерида, ЛДЛ холестерола, итд. Нивои слободних масних киселина (повезана масна јетра) у третираним групама су статистички значајно смањени, 36,7 процената у ЦаГ групи и 40,94 процената у ИКГ групи. Такође, ниво сГПТ (повезана функција јетре) је значајно смањен, 51,58 процената у ЦаГ групи и 43,38 процената у ИКГ групи.

Подаци добијени анализом ДНК микромрежа подржавајупротив старењаефекат ИКГ, са значајним променама у профилима експресије гена код 14-месечних СД пацова уочених после 1-месечног периода лечења. Пацови третирани ЦаГ5-, у поређењу са контролном групом, имали су повећање у 131 гену, укључујући липокалин 2 [33], протеин који везује липосахариде (Лбп) [34] и инхибитор серин пептидазе, Казал тип3 (Спинк3) [35] и смањује се у 64 гена, укључујући лизил оксидазу (Лок) [36], серин дехидратазу (сдс) [37] и ретинол сатуразу (Ретсат) [38]. Подаци указују на липокалин 2 и адипокине, који су били повишено регулисани, и лизил оксидазу (у вези са хепараназом), која је била смањена, као потенцијалне терапијске маркере запротив старењаефекти код гојазних животиња.

Ова студија је приметила значајне промене у профилима експресије гена код старијих пацова након третмана са ЦаГ или ИКГ током 1 месеца. Експресија гена липокалина-2, који је адипокин укључен у инсулинску резистенцију [39] и секреторни протеин са просперитетом везивања липида, повећана је за око 10 пута. Ово је у сагласности са студијом микромрежа која је известила да гутање соје изазива повећање ендогеног амилоид-шаперона, простагландин Д2 синтазе липокалинског типа (Птгдс), што доводи до супресије амилоида и спречава когнитивне дисфункције [4{{ 22}}]. Липополисахарид (ЛПС) везујући протеин (ЛБП), сурогат маркер микробне транслокације, повезан је са смањеном физичком функцијом и повећаном инфламацијом [41]. Нормалан процес старења мења систем коагулације крви код људи; Природни антикоагуланси, укључујући антитромбин ИИИ, хепарин кофактор ИИ, протеин Ц, протеин С и инхибитор путева ткивног фактора, могу модулирати реакције система коагулације крви [42]. У овој студији, дошло је до значајног повећања фактора И (фибриногена) у ЦаГ (162,6 процената), ИКГ (146,0 процената) и ЦС10 (184,0 процената) — третираним групама у поређењу са контролном групом која је третирана ПБС. Такође, ниво ЛБП (ЛПС везујући протеин) је повећан у нашим подацима о ДНК микромрежу, што сугерише да се хепарин (ГАГ) везује за ЛБП, олакшава трансфер ЛПС-а на ЦД14 и побољшава ЛПС посредовану активацију моноцита периферне крви, што доводи до антикоагулантна активност [43]. Инхибитор трипсина, инхибитор серинске протеазе Казал-тип 3 (Спинк3), је регулисан у овом експерименту, што указује на улогу паракрине модулације; такође је укључен у имплантацију ембриона [44]. Пошто је Спинк3 важан инхибитор серинске протеазе, његова регулација може да одражава важан ендогени цитопротективни механизам који би спречио даље повреде [45]. Смањење регулације лизил оксидазе може указивати на то да хепарин (ГАГ) који инхибира чврсто везивање лизил оксидазе за претходно формиране фибриле није био тешко погођен [46]. Смањење засићења ретинола уочено у овом експерименту је приметно, пошто ретинол сатураза промовише адипогенезу и смањена је код гојазности [47]. Према хипотези, густина масног ткива, нови биомаркер који предвиђа ризик од смртности код старијих одраслих особа, а не изгледа да је повезан са упалом [48], штавише, ЦаГ је значајно смањио густину масног ткива обећавајући моћнупротив старењаагент.

Закључци

Гликозаминогликан балеге је снизио ниво холестерола и триглицерида у серуму, довео до смањења тежине масног ткива и нормализације нивоа слободне масне киселине, ГПТ, глукозе и мокраћне киселине у серуму, као и продужење времена коагулације које би спречило агрегацију крви и липида. акумулација у васкуларним ендотелним баријерама које доприносе хомеостази у циркулаторном систему. ИЛ{{0}} (пг/мл) у серуму је смањен за 1 месец ЦаГ или ИКГ третмана, што показује антиинфламаторно дејство. Поред тога, липокалин за заштиту јетре је био високо (10- пута) пререгулисан, а лизил оксидаза је смањена (01- пута) код пацова третираних ЦаГ. ЦаГ добијен од инсеката може бити а

сигурнија замена за хепарин и друге ГАГ из извора сисара, пошто извори инсеката смањују могућност преношења инфективних вируса са животиња као што су свиње. Ови резултати сугеришу да ЦаГ и БИК не могу бити само природнипротив старењаагенси, али и функционална храна, слична хитозану и будућим биоматеријалима који играју виталну улогу у нашем данашњем животу.

Скраћенице

АЛП: алкална фосфатаза; АЛТ(ГПТ): Глутамат пируват трансаминаза; аПТТ: Активирано парцијално тромбопластинско време; АСТ(ГОТ): Глутамат оксалоацетат трансаминаза; БУН: Азот уреје у крви; ЦаГ 5: балега буба (Цатхарсиус молоссус) гликозаминогликан 5 мг/кг; ЦК: креатинин фосфокиназа; ЦОН: Контролна група; ЦРП: Ц-реактивни протеин;

ЦС10: хондроитин сулфат (10 мг/кг); ГАГ: Гликозаминогликан; ГГТ: - глутамил трансфераза; Х. Цхол: Висок холестерол; ИКГ5: Куеен оф Бомбус игнитус (врста бумбара) гликозаминогликан 5 мг/кг; л.Цхол: Низак холестерол; ЛДХ: лактат дехидрогеназа; ПТ: Протромбинско време; Т. Цхол: Укупни холестерол; ТГ: Триглицериди

Признања

Аутори захваљују Националној академији пољопривредних наука за финансијску (РДА, ПЈ011853) и техничку подршку.

Финансирање

Овај рад је подржан од стране Пројекта основних истраживања Управе за рурални развој, ПЈ011853.

Доступност података и материјала

Сви подаци доступни су на порталима часописа у достављеном рукопису. Уз овај поднесак нису потребне никакве друге пратеће датотеке/подаци.

Такмичарски интереси

Аутори изјављују да немају супротстављене интересе.

Прилози аутора

МИ је извршио већину експеримената, припремио рукопис: осмислио студију, учествовао у њеном дизајну и координацији, прикупио и анализирао податке и припремио рукопис. БЈ је спровео студије на животињама, учествовао у тесту ензима који се односи на оксидацију. ХЈ је извршио тестове цитокина. ЈС је учествовао у усклађивању генетских секвенци. КК је учествовао у ДНК микромрежу. ИС је спровео ин виво студију реаговања артерија отпора. Сви аутори су прочитали и одобрили коначни рукопис.

Сагласност за објављивање

Овај рукопис не садржи податке било које особе у било ком облику.

Етичко одобрење

Студије које су укључивале животиње одобрио је Етички комитет за лабораторијске животиње Националне академије пољопривредних наука, РДА, Јужна Кореја (НААС1503).

Студије које извештавају о рукописима нису садржале људске учеснике, људске податке или људска ткива.

Напомена издавача

Спрингер Натуре остаје неутралан у погледу јурисдикцијских захтева у објављеним мапама и институционалним везама.

Детаљи о аутору

1Одсек за пољопривредну биологију, Национална академија пољопривредних наука, Управа за рурални развој (РДА), Вању-Гун 55365, Јужна Кореја. 2 Фармацеутски колеџ, Универзитет Аџу, Сувон 442-749, Јужна Кореја. 3Пхармацогенецхипс Инц., Цхунцхеон 200-160, Јужна Кореја.