Антимеланогено и антиоксидативно деловање етанолног екстракта Куммеровиа Стриата: Куммеровиа Стриата регулише антимеланогену активност кроз смањење ТРП-1, ТРП-2 и МИТФ експресије

АПСТРАКТАН

Куммеровиа стриата (К. стриата) се користи као традиционална медицина за терапију запаљења. Да бисмо утврдили да ли има корисне антимеланогене и антиоксидативне активности, истражили смо биолошке активности етанолног екстракта Куммеровиа стриата (ЕКС) користећи различите ин витро и системе модела ћелијске културе. Антимеланогена активност је процењена у ћелијама меланома Б16Ф10 у смислу синтезе меланина и ин витро инхибиторне активности тирозиназе. Антиоксидативни тестови су обављени коришћењем 2,2-дифенил-1-пикрилхидразила (ДППХ) и 2,2'-казино-бис (3-етилбензотиазолин-6-сулфонске киселине) дијамонијум соли (АБТС). ЕКС је показао снажне антиоксидативне активности у ДППХ и АБТС тестовима. Нивои транскрипције мРНК и нивои експресије протеина тирозиназе, протеина 1 везаног за тирозиназу, протеина 2 повезаног са тирозиназом и транскрипционог фактора повезаног са микрофталмијом смањили су се на начин који зависи од дозе са ЕКС третманом.

Поред тога, ЕКС није утицао на виталност ћелија у различитим концентрацијама које су коришћене у овој студији, што указује да механизам деловања ЕКС посредоване инхибиције синтезе меланина не укључује цитотоксичност. Такође, потврдили смо да су п-кумаринска киселина и кверцетин важна једињења за антимеланогенезу и антиоксидативна својства ЕКС. Заједно, наши налази по први пут показују да ЕКС поседује антимеланогене и антиоксидативне активности. Даља евалуација и развој ЕКС-а као функционалног додатка или козметике може бити корисна за избељивање коже и смањење бора.

За избељивање смо открили да Цистанцхе има ефекат бељења, а Цистанцхе је богат витамином Ц, који се сматра веома ефикасним средством за избељивање. Витамин Ц може инхибирати синтезу меланина, врсте меланина која може учинити кожу досадном. Истовремено, витамин Ц такође може да подстакне производњу колагена, супстанце која чини кожу чвршћом и еластичнијом.

Поред наведених састојака, Цистанцхе садржи и разне аминокиселине и елементе у траговима, који су такође веома корисни за здравље коже. На пример, цинк садржан у Цистанцхе-у може помоћи у лечењу акни и опекотина од сунца, а истовремено спречава старење коже. Штавише, Цистанцхе такође има добар заштитни ефекат на јетру и имуни систем.

Цлицк цистанцхе десертицола додатак производу

1. Представљање

Студије о спољашњем старењу су објавиле да кожа игра главну улогу у идентификацији људског старења [1,2]. Старење коже се може поделити на два типа: хронолошко старење, које је праћено прогресивним пропадањем структуре и функције коже током времена, и друго је егзогено старење (фотостарење) где се текстура коже мења услед дуготрајног старења коже. временско излагање сунчевој светлости [3,4]. Слободни радикали и реактивне врсте кисеоника су најважније компоненте које подстичу старење коже. Они изазивају оксидативни стрес у ћелијама коже, а супстанце настале током овог процеса изазивају повећану производњу меланина и боре.

Меланин се синтетише оксидацијом тирозиназе или Л-3,4-дихидроксифенилаланина (Л-ДОПА) преко активности тирозиназе и протеина 1 повезаног са тирозиназом (ТРП-1). Меланоцити играју важну улогу у заштити коже од оштећења зрачења [5,6]. Биосинтезу меланина у меланоцитима посредује ензим тирозиназа који регулише формирање Л-ДОПА хидролизом тирозина и формирање ДОПА хинона оксидацијом ДОПА [7,8]. Поред тога, фактор транскрипције повезан са микрофталмијом (МИТФ) је кључни фактор транскрипције који регулише транскрипцију меланогених ензима (тј. тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2) [9,10]. Тирозиназу и ТРП-1 транскрипцијски регулише МИТФ, који игра важну улогу у путу синтезе меланина [11,12].

Куммеровиа стриата (Тхунб. ек Мурраи) Сцхиндл (К. стриата) је једногодишња биљка аутохтона у источној Азији, укључујући Кореју, Кину и Јапан. Биљка се дуго користила као традиционална лековита биљка у терапији против упале. Ова студија је имала за циљ да анализира потенцијалне антимеланогене и антиоксидативне активности етанолног екстракта К. стриата (ЕКС) и његова два једињења. Антиоксидативна активност је процењена у смислу њихове активности уклањања слободних радикала коришћењем 2,2'-казино-бис (3-етилбензотиазолин-6-сулфонске киселине) диамонијум соли (АБТС) и 2,{{11 }}дифенил-1-пикрилхидразил (ДППХ) тестови. Активности против тирозиназе су процењене коришћењем теста инхибиције тирозиназе. Открили смо да су ЕКС и његова једињења обећавајући кандидати за употребу у козметичким производима за избељивање коже и смањење бора.

2. Материјал и методе

2.1. Услови културе ћелија

Ћелијске линије меланома миша Б16Ф10 купљене су од Америчке колекције типских култура (Манассас, ВА, САД). Ћелије су узгајане у Дулбеццо-овом модификованом медијуму орла (ДМЕМ, Гибцо, Сан Јосе, Калифорнија, САД) са додатком 10 процената феталног говеђег серума (ФБС) и пеницилина/стрептомицина (Гибцо, САД) у влажној атмосфери која садржи 5 процената ЦО2 у ваздуху на 37 степени.

2.2. Реагенси

Следећа антитела су купљена из комерцијалних извора: анти-тирозиназа, анти-ТРП-1, анти-ТРП-2 и анти-МИТФ (ТхермоФисхер Сциентифиц, Роцкфорд, ИЛ, САД); анти- - антитела на актин и коњугате мишјег и зечјег ИгГ-пероксидазе рена (Целл Сигналинг, Беверли, МА, САД).

2.3. Припрема екстракта Куммеровиа стриата

Надземни делови К. стриата (Тхунб. ек Мурраи) Сцхиндлер прикупљени су у Гимпоу, Гиеонгги, Јужна Кореја у септембру 2013. и идентификовани од стране професора Јоа Суб Ох, Факултета фармације, Универзитета Данкоок, Цхеонан, Јужна Кореја. Узорак ваучера (Г63) депонован је у Био-центру, Гиеонггидо Бусинесс & Сциенце Аццелератор, Сувон, Јужна Кореја. Надземни делови К. стриата (Тхунб. ек Мурраи) Сцхиндлер (1,8 кг) екстраховани су са 70 процената ЕтОХ (3 × 18 Л) на собној температури. Комбиновани ЕтОХ екстракти су затим концентровани ин вацуо на 40 степени да би се добило 180 г остатка. Екстракт ЕтОХ је суспендован у дестилованој води и затим подељен узастопно са дихлорометаном (ЦХ2Цл2), етил ацетатом (ЕтОАц) и бутанолом (н-БуОХ). МЦ фракција (7,52 г) је одвојена хроматографијом на течној колони [стаклена колона (7,5 × 40 цм) напуњена силика гелом (70–230 месх)] коришћењем градијента смеша као елуенса (ЦХ2Цл2 → МеОХ).

Фракције елуента Ф001–Ф006 су добијене из ове почетне течне хроматографске сепарације. Фракција Ф003 је пречишћена хроматографијом на колони коришћењем стаклене колоне (5,0 × 40 цм) напуњене ОДС-Ц18 гелом. Колона је затим елуирана са Х2О → МеОХ дајући седам подфракција (Ф007-Ф013). п-кумаринска киселина (15,2 мг) је изолована из Ф007 хроматографијом на течној колони [стаклена колона (3,0 × 40 цм) напуњена ОДС-Ц18] коришћењем градијентног елуирања (Х2О → МеОХ). Кверцетин (13,5 мг) је изолован из Ф004 хроматографијом на течној колони [стаклена колона (3,0 × 40 цм) напуњена ОДС-Ц18] коришћењем градијентног елуирања (Х2О → МеОХ). Њихове структуре су разјашњене комбинацијом 1Д и 2Д нуклеарне магнетне резонанце (НМР) и масене спектрометрије, као и поређењем са објављеном литературом [13,14].

2.4. Општи поступци

1Д и 2Д [1Х-1Х корелациона спектроскопија (ЦОСИ), хетеронуклеарна једнострука квантна кохеренција (ХСКЦ) и хетеронуклеарна корелација вишеструких веза (ХМБЦ)] НМР спектри су мерени на Брукер Асценд ИИИ 70{ {25}} МХз НМР спектрометар (Рхеинстеттен, Немачка) са тетраметилсиланом као интерним стандардом. Хемијски помаци су изражени као δ вредности. Масени спектри јонизације електроспрејом (ЕСИ) су добијени на масеном спектрометру ЛТК Орбитрап КСЛ (Тхермо Сциентифиц). Отворена колонска хроматографија је изведена коришћењем силика гела (Киесел гел 60, 70–230 месх и 230–400 месх; Мерцк) и ОДС-Ц18 гела ОДС-А (12 нм С7 μм, ИМЦ ГЕЛ, Јапан). Танкослојна хроматографија је изведена коришћењем претходно обложеног силика гела 60 Ф254 (0,25 мм, Мерцк) и претходно обложеног силика гела 60 РП-18 Ф-254С (0,25 мм, Мерцк), респективно. Све хемикалије и растварачи су били аналитичког квалитета и коришћени су без даљег пречишћавања.

2.5. Тест виталности ћелија

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолијум бромид (МТТ) тест је извршен да би се одредио ефекат ЕКС на ћелију Одрживост. Ћелије меланома миша Б16Ф10 су култивисане у 96- плочама са бунарима (1 × 104 ћелије/бунарићу) и третиране са ЕКС током 24 х. Укупно је додато 100 μЛ медијума без серума који садржи 10 процената МТТ раствора (5 мг/мл) и инкубирано 3 х. Медијум је уклоњен и два пута испран физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС). Након тога, 100 μЛ диметил сулфоксида (ДМСО) је додато у сваки бунар и растворено у шејкеру. Апсорбанца је мерена на 540 нм коришћењем ЕЛИСА читача (Молецулар Девице, УСА).

2.6. Садржај ћелијског меланина

Б16Ф10 ћелије су култивисане у 6-плочама са бунарима при густини од 1 × 105 ћелија по бунарчићу и инкубиране 24 х. Меланогенеза је индукована са 100 нМ -Меланоцит-стимулишућег хормона (-МСХ). Ћелије су третиране арбутином (позитивна контрола) и ЕКС у различитим концентрацијама и култивисане 72 х. После два пута испирања са ПБС, додат је пуфер за лизу [100 мМ натријум фосфат (пХ 6,8) и 0,1 мМ фенилметан сулфонил флуорид (ПМСФ), 1 проценат Тритон Кс-100] и растворен на -80 степени током 30 минута. После сакупљања ћелија, 1 Н НаОХ који садржи 10 процената ДМСО је реаговао на 65 степени током 1 х да би се пелет растворио, а апсорбанца је измерена на 405 нм.

2.7. Тест инхибиције тирозиназе

Инхибициона активност тирозиназе је мерена коришћењем методе коју су описали Иаги ет ал. [15]. Реакција је изведена у 0.1 М калијум-фосфатном пуферу (пХ 6,5) који садржи 1,5 мМ Л-тирозина и 1250 јединица/мл тирозиназе печурака. Реакциона смеша је инкубирана на 37 степени 20 мин. Узорци за тестирање су анализирани на инхибицију тирозиназе мерењем њеног ефекта на активност тирозиназе коришћењем ЕЛИСА читача на 490 нм. Арбутин је коришћен као позитивна контрола.

2.8. Тест активности уклањања радикала ДППХ

Активност уклањања радикала ДППХ мерена је коришћењем методе коју су описали Блоис ​​[16] и Озген ет ал. [17]. Укратко, 100 μЛ раствора ДППХ раствореног у метанолу додато је у 100 μЛ ЕКС, који је разблажен до потребне концентрације, а реакција је изведена на собној температури 30 мин. Апсорпција је мерена на 517 нм коришћењем ЕЛИСА читача (Молецулар Девице, УСА). Као позитивна контрола коришћен је антиоксидант бутиловани хидроксианизол (БХА) и одређена је ИЦ50 вредност ЕКС.

2.9. Активност уклањања радикала АБТС

Активност уклањања радикала АБТС мерена је коришћењем претходно описане методе [18,19]. АБТС плус је формиран мешањем 7 мМ раствора АБТС и 2,45 мМ раствора калијум персулфата (К2С2О8) са АБТС: К2С2О8 (однос 2: 1) током 12–16 х да би се формирао катјон (АБТС плус). Вредност апсорпције на 734 нм била је 1,35 ± 0.05. Укупно, 100 μЛ разблаженог раствора и 100 μЛ ЕКС разблаженог до потребних концентрација реаговало је на собној температури током 6 минута, а апсорбанца је измерена на 734 нм помоћу ЕЛИСА читача. Као позитивна контрола коришћена је БХА, антиоксиданс, а одређена је ИЦ50 вредност ЕКС.

2.10. Ланчана реакција полимеразе реверзне транскрипције (РТ-ПЦР)

Ћелије меланома Б16Ф10 су засејане у 6- плоче са бунарима при густини од 1 × 106 ћелија/бунарићу и третиране са ЕКС (100–400 уг/мЛ) током 72 х. Да би се екстраховала укупна РНК, Тризол реагенс (Инвитроген, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц.) је додат у сваки бунар за лизу ћелија и додато је 200 μЛ хлороформа. Затим је смеша центрифугирана на 13,000 рпм током 20 минута на 4 степена, а супернатант је мешан са изопропанолом 30 минута на -70 степени. После центрифугирања на 13,000 рпм током 20 минута на 4 степена, супернатант је уклоњен и у сваку епрувету је додат 70% ЕтОХ-диетилпирокарбонат воде. После центрифугирања на 13,000 рпм током 5 минута на 4 степена, супернатант је уклоњен и осушен на собној температури.

Након тога, 1 уг екстраховане укупне РНК је реверзно транскрибован у једноланчану цДНК са олиго дТ коришћењем Так ДНК полимеразе и СуперСцрипт®ИИИ система за синтезу првог ланца (Инвитроген, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц.). цДНК је амплификован у МиГене™ Сериес Пелтиер Тхермал Цицлер Модел МГ96 Г (ЛонгГене Сциентифиц Инструментс, Хангзхоу, Кина) коришћењем специфичних прајмера и АццуПовер® Пфу ПЦР премикса (Бионеер Цорпоратион, Даејеон, Република Кореја). Услови ПЦР циклуса били су 5 минута на 95 степени, након чега је уследило 30 циклуса од 30 с на 95 степени, 30 с на 60 степени, 1 мин на 72 степена, и коначно продужење од 10 минута на 72 степена. После амплификације, ПЦР производи су подвргнути електрофорези на 1,5 процентном агарозном гелу који садржи етидијум бромид и анализирани коришћењем УВ трансилуминатора.

2.11. Вестерн блот анализа

Ћелије меланома Б16Ф10 су култивисане у ДМЕМ са додатком 10 процената ФБС-а при густини од 1 × 106 ћелија у 6- плочама бунара на 37 степени и 5 процената ЦО2 током 24 сата. Након уклањања медијума за културу, ЕКС (100–400 уг/мл) разблажен у медијуму је третиран 72 х. Ћелије су испране ПБС-ом, сакупљене коришћењем РИПА пуфера (Сигма Алдрицх) и центрифугиране на 15,000 рпм током 15 минута на 4 степена. Укупни протеини су екстраховани из ћелија и квантификовани коришћењем Брадфордове методе. Протеини су раздвојени 8% електрофорезом натријум додецил сулфат-полиакриламидног гела и пребачени на нитроцелулозну мембрану (Вхатман, Дассел, Немачка). Мембрана је блокирана са 5 процената БСА током 1 х на собној температури и инкубирана преко ноћи са примарним антителом на 4 степена. Мембрана је затим испрана и инкубирана са секундарним антителима коњугованим с пероксидазом рена 1 х на собној температури. Мембрана је испрана и детектована помоћу СуперСигнал® Вест Пицо хемилуминисцентног супстрата (ТхермоФисхер Сциентифиц, Роцкфорд, ИЛ, УСА).

2.12. Статистичка анализа

Статистичка анализа је извршена коришћењем Студентовог т-теста са програмом Мицрософт Екцел 2007 (Мицрософт Цорпоратион, Редмонд, ВА, УСА). Резултати су представљени као средње вредности ± стандардна девијација, а стр< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference. 

Слика 1. Ефекти етанолног екстракта Куммеровиа стриата на инхибицију тирозиназе, виталност ћелија и синтезу меланина (А) Инхибициона активност тирозиназе етанолног екстракта Куммеровиа стриата (ЕКС) је анализирана мерењем количине допахрома створеног у реакцији. Арбутин је коришћен као позитивна контрола. (Б) Садржај меланина у Б16Ф10 ћелијама стимулисаним са 100 нМ МСХ. Садржај меланина је израчунат као проценат садржаја у контроли. (Ц) Б16Ф10 ћелије меланома миша третиране су са ЕКС (25–400 уг/мл) и арбутином (400 уг/мл). Цитотоксичност ЕКС и арбутина је одређена коришћењем МТТ теста. Вредности представљају средњу вредност ± СД за три независна понављања. Статистичка значајност је назначена као *П < 0,05, **П < 0,01, у поређењу са нетретираним узорцима или ћелијама третираним -МСХ.

\

Слика 2. Антиоксидативна активност етанолног екстракта Куммеровиа стриата (А и Б) Активност уклањања слободних радикала одређена је како је описано. Антиоксидативна активност је мерена коришћењем ДППХ теста активности уклањања радикала и теста АБТС плус катјона радикала. Бутиловани хидроксианизол је коришћен као позитивна контрола. Вредности представљају средњу вредност ± СД за три независна понављања. Статистичка значајност је назначена као *П < 0.05, **П < 0,01, у поређењу са нетретираним узорцима.

3. Резултати

3.1. Ефекти ЕКС против меланогенезе

Да бисмо одредили антимеланогене активности ЕКС-а, користили смо тест тирозиназе печурака користећи Л-тирозин као супстрат и тирозиназу печурака као извор ензима. Пошто је тирозиназа кључни ензим који катализује корак који ограничава брзину у биосинтези меланина, прво смо измерили способност ЕКС да инхибира тирозиназу. Као што је приказано на слици 1А, ЕКС је испољио значајан инхибиторни ефекат на активност тирозиназе на начин који зависи од дозе. Ови резултати сугеришу да је ЕКС показао инхибиторне ефекте на активност тирозиназе печурака, а инхибиторни ефекат ЕКС-а био је сличан оном код арбутина који се користи као позитивна контрола.

Затим, да би се одредио ефекат ЕКС-а на синтезу меланина, квантификован је садржај меланина у ћелијама меланома Б16Ф10 третираних ЕКС-ом. Као што је приказано на слици 1Б, ЕКС третман је смањио садржај меланина у ћелијама меланома на начин који зависи од дозе, што указује да смањење ћелијског меланина може бити последица инхибиције активности тирозиназе. Поред тога, испитивање ефекта ЕКС на виталност ћелија меланома Б16Ф10 показало је да ЕКС није имао значајан цитотоксични ефекат на Б16Ф10 ћелије у коришћеној концентрацији (слика 1Ц). Ови налази јасно показују да ЕКС испољава анти-меланогене ефекте кроз инхибицију активности тирозиназе и синтезе меланина у ћелијама меланома Б16Ф10 без изазивања цитотоксичности.

3.2. Антиоксидативна активност ЕКС

Активност чишћења ЕКС-а је одређена коришћењем слободних радикала ДППХ (слика 2А). ЕКС је показао већу антиоксидативну активност (активност чишћења=50.22 процента, ИЦ50=98.71 уг/мл). Капацитет чишћења ЕКС-а је такође процењен коришћењем катјона радикала АБТС (слика 2Б). Капацитет уклањања радикала АБТС ЕКС био је сличан оном код позитивне контроле БХА (капацитет чишћења=99.53 процента, ИЦ50=24.64 уг/мл). Ови резултати указују да ЕКС има већу антиоксидативну активност.

3.3. Ефекат ЕКС на експресију гена за синтезу меланина

Да бисмо истражили молекуларне механизме помоћу којих ЕКС даље регулише меланогенезу, испитали смо промене у експресији меланогених гена и протеина, као што су тирозиназа, ТРП-1, ТРП-2 и МИТФ, који играју кључну улогу у меланогенези [20]. Као што је приказано на слици 3А, експресија мРНК тирозиназе, ТРП-1, ТРП-2 и МИТФ-а је покренута -МСХ; међутим, ЕКС третман је значајно смањио експресију мРНА (100–400 уг/мл). Штавише, ЕКС је показао моћну инхибиторну активност сличну оној код позитивне контроле арбутина. Затим, ефекат ЕКС-а на експресију протеина повезаних са меланогенезом је процењен Вестерн блот анализом. Као што је приказано на слици 3Б, ЕКС третман је значајно инхибирао -МСХ-индуковане нивое експресије тирозиназе, ТРП-1, ТРП-2 и МИТФ у Б16Ф10 ћелијама. Узети заједно, ови налази показују да инхибиторни ефекти ЕКС-а на меланогенезу у Б16Ф10 ћелијама могу бити посредовани смањењем регулације меланогених гена и протеина, као што су тирозиназа, ТРП1, ТРП-2 и МИТФ.

Слика 3. Ефекти етанолног екстракта Куммеровиа стриата на процес биосинтезе меланина (А) Експресија тирозиназе, ТРП1, ТРП2 и МИТФ на нивоу мРНА одређена је коришћењем РТ-ПЦР. Арбутин је коришћен као позитивна контрола. ИРНК тирозиназе, ТРП1, ТРП2 и МИТФ анализиране су протоколом дензитометрије. Арбутин је коришћен као позитивна контрола. (Б) Експресија тирозиназе, ТРП1, ТРП2 и МИТФ на нивоу протеина одређена је Вестерн блотингом. Арбутин је коришћен као позитивна контрола. Тирозиназа, ТРП1, ТРП2 и МИТФ су анализирани протоколом дензитометрије. Арбутин је коришћен као позитивна контрола. Вредности представљају средњу вредност ± СД за три независна понављања. Статистичка значајност је назначена као *П < {{10}}.05, **П < 0,01, у поређењу са ћелијама третираним -МСХ.

Слика 4. Инхибициона активност тирозиназе и антиоксидативна активност активних једињења етанолног екстракта Куммеровиа стриата (А) Анализирана је активност инхибитора тирозиназе п-кумаринске киселине и кверцетина (12,5–50 μМ). (Б) Анти-меланогена активност кумаринске киселине и кверцетина (100–400 μМ) је анализирана у Б16Ф10 ћелијама. (Ц) Антиоксидативна активност п-кумаринске киселине и кверцетина (6,25–100 μМ) мерена је коришћењем АБТС плус теста катјона радикала. Арбутин и БХА су коришћени као позитивна контрола. Вредности представљају средњу вредност ± СД за три независна понављања. Статистичка значајност је назначена као *П < 0,05, **П < 0,01, у поређењу са нетретираним узорцима.

3.4. п-кумаринска киселина и кверцетин из ЕКС-а показали су снажне антимеланогене и антиоксидативне активности

Затим смо покушали да идентификујемо и пречистимо функционална једињења присутна у ЕКС-у која показују снажна анти-меланогена и антиоксидативна својства. Различита једињења су идентификована као лутеолин, п-кумаринска киселина, розмаринска киселина, кверцетин, генистеин и (плус)-катехин. Међу њима, п-кумаринска киселина и кверцетин су инхибирали тирозиназу, а синтезу меланина и испољили капацитет чишћења сличан арбутину, добро познатом агенсу за депигментацију, на начин који зависи од дозе (слика 4). Ови резултати показују да су п-кумаринска киселина и кверцетин важна једињења за антимеланогена и антиоксидативна својства ЕКС.

4. Дискусија

У овој студији, имали смо за циљ да анализирамо антимеланогени и антиоксидативни потенцијал ЕКС-а и његова два једињења п-кумаринске киселине и кверцетина и открили смо да ЕКС поседује моћне антимеланогене и антиоксидативне активности.

Пигментацију коже углавном изазивају меланоцити у базалном слоју коже, након стимулације УВ зрачењем. Стимулисани кератиноцити луче -МСХ (мали пептидни хормон) [21]. Дакле, излагање УВ зрачењу изазива производњу меланина што доводи до хиперпигментације [22]. Недавно су се многи истраживачи фокусирали на развој нових и ефикасних једињења за избељивање, јер козметика са ефектом избељивања чини велики део козметичког тржишта. Студије о инхибицији биосинтезе меланина откриле су да арбутин, којична киселина и многи други природни производи инхибирају меланогенезу и хиперпигментацију. Међутим, недавно су пријављени нежељени ефекти арбутина [23] и којичне киселине [24], а употреба ових супстанци може бити ограничена. Због тога постоји потреба за развојем безбедних материјала за избељивање коже без нежељених ефеката. Најновија истраживања су се фокусирала на развој козметике за избељивање коже од природних материјала.

Неколико студија је показало различите биолошке активности екстракта К. стриата. Конкретно, К. стриата је фармацеутски ефикасна за упале и оксидацију [25,26]. Међутим, ефекти и молекуларни механизми К. стриата на меланогенезу до данас нису пријављени. У овој студији по први пут показујемо да ЕКС поседује антимеланогене и антиоксидативне активности.

Тирозиназа, ТРП-1 и ТРП-2 играју важне улоге у биосинтези меланина [27]. Дакле, механизам који лежи у основи дејства агенаса за избељивање коже укључује инхибицију производње меланина смањењем активности тирозиназе [28]. Познато је да експресију гена тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 регулише МИТФ [29]. У овој студији, утврђено је да су антимеланогене активности ЕКС посредоване инхибицијом активности тирозиназе и синтезом меланина изазване -МСХ у ћелијама меланома Б16Ф10, без индукције цитотоксичности (слика 1). Утврђено је да су ове антимеланогене активности ЕКС посредоване смањењем мРНА изазване -МСХ и експресијом протеина тирозиназе, ТРП-1, ТРП-2 и МИТФ (слика 3). Антиоксидативне активности мерене су ДППХ и АБТС тестовима. ЕКС је показао снажну антиоксидативну активност сличну БХА, која је коришћена као позитивна контрола (слика 2). Активна једињења присутна у ЕКС су изолована и потврђена као п-кумаринска киселина и кверцетин. Иако су различите биолошке активности, укључујући кардиопротективну [30], антиинфламаторну [31,32], антимутагену [33] антиоксидативну [34,35] и антимеланогену [36] активност, пријављене за п-кумарне киселина и кверцетин из различитих биљака, ово је прва студија која је објавила да п-кумаринска киселина и кверцетин из ЕКС-а поседују антимеланогене и антиоксидативне активности.

У овој студији су процењене антимеланогене и антиоксидативне активности ЕКС. ЕКС је испољавао антимеланогене и антиоксидативне активности путем регулације активности тирозиназе и синтезе меланина изазване -МСХ у ћелијама меланома Б16Ф10, без изазивања цитотоксичности. Главна активна једињења су били п-кумаринска киселина и кверцетин. Дакле, наши налази по први пут показују да се ЕКС може користити као потенцијални депигментирајући и антиоксидативни агенс.

Сукоби интереса

Аутори изјављују да нема сукоба интереса.

Финансирање

Овај рад је подржан од стране Програма за развој технологије (С2393982) који финансира Министарство малих и средњих предузећа и стартапа (МСС, Кореја).

Транспарентност документа

Документ о транспарентности повезан са овим чланком може се наћи у онлајн верзији.

Референце

[1] П. Лимтракул, С. Иодкеерее, П. Тхиппрапхан, В. Пунфа, Ј. Срисомбоон, Ефекти против старења и инхибиције тирозиназе екстракта бутанола цвета касије фистуле, БМЦ Цомплемент. Алтерн. Мед. 16 (2016) 497.

[2] А. Грагнани, С. Цорницк, В. Цхомински, С. Рибеиро де Норонха, С. Алвес Цорреа де Норонха, Л. Ферреира, Преглед главних теорија старења коже, Адв. Агинг Рес. 3 (2014) 265–284.

[3] ТД Педроса, АО Баррос, ЈР Ногуеира, АЦ Фрует, ИЦ Родригуес, ДК Цалцагно, МА Смитх, ТП де Соуза, СБ Баррос, МЦ де Васцонцеллос, ет ал., Ефекти јуке против бора и избељивања ( Либидибиа ферреа Март.) екстракти, Арцх. Дерматол. Рес. 308 (2016) 643–654.

[4] Н. Делалле-Лозица, Локална терапија као основна превенција против старења, Ацта Цлин. Хрват. 49 (2010) 529–536.

[5] Н. Маддоди, А. Јаиантхи, В. Сеталури, Сјајно светло на пигментацију коже: тамнија и светлија страна ефеката УВ зрачења, Пхотоцхем. Пхотобиол. 88 (2012) 1075–1082.

[6] Ц. Дессиниоти, АЈ Стратигос, Д. Ригопоулос, АД Катсамбас, Преглед генетских поремећаја хипопигментације: лекције научене из биологије меланоцита, Екп. Дерматол. 18 (2009) 741–749.

[7] А. Нисхина, А. Миура, М. Гото, К. Теракадо, Д. Сато, Х. Кимура, И. Хираи, Х. Сато, Н. Пхаи, Мансононе Е из Мансониа гагес инхибирају -МСХ-индуковану меланогенезу у Б16 ћелијама инхибицијом ЦРЕБ експресије и фосфорилације у ПИ3К/Акт путу, Биол. Пхарм. Бик. 41 (2018) 770–776.

[8] ВЈ Хеаринг, ТМ Екел, Тирозиназа сисара. Поређење хидроксилације тирозина и формирања меланина, Биоцхем. Ј. 57 (1976) 549–557.

[9] М. Канлаиаваттанакул, Н. Лоуритх, Биљке и природни производи за лечење хиперпигментације коже – преглед, Планта Мед. (2018), хттпс://дои.орг/10.1055/а0583-0410 [Епуб испред штампања].

[10] М. Канлаиаваттанакул, Н. Лоуритх, Третман хиперпигментације коже коришћењем биљака: преглед клиничких доказа, Ј. Цосмет. Ласер Тхер. 20 (2018) 123–131.

[11] ЈЈ Хсиао, ДЕ Фисхер, Улога транскрипционог фактора повезаног са микрофталмијом и пигментације у меланому, Арцх. Биоцхем. Биопхис. 563 (2014) 28–34.

[12] ЛА Гарраваи, ХР Видлунд, МА Рубин, Г. Гетз, АЈ Бергер, С. Рамасвами, Р. Бероукхим, ДА Милнер, СР Грантер, Ј. Ду, Ц. Лее, ет ал., Интегративне геномске анализе идентификују МИТФ као онкоген за преживљавање лозе појачан у малигном меланому, Натуре 436 (2005) 117–122.

[13] Кс. Зханг, П. Гуо, Г. Сун, С. Цхен, М. Ианг, Н. Фу, Х. Ву, Кс. Ксу, Фенолна једињења и флавоноиди из плодова Панданус тецториус Соланд, Ј. Мед . Плантс Рес. 6 (2012) 2622–2626.

[14] Х. Ли, К. Ма, И. Лиу, Ј. Киан, Ј. Зхоу, И. Зхоу, Цхемицал цонституентс фром Полигонум перфолиатум, Цхин. Ј. Аппл. Енвирон. Биол. 15 (2009) 615–620.

[15] А. Иаги, Т. Канбара, Н. Моринобу, Инхибиција печурке-тирозиназе екстрактом алоје, Планта Мед. 56 (1987) 515–517.

[16] МС Блоис, Одређивање антиоксиданса употребом стабилног слободног радикала, Натуре 181 (1958) 1199–1200.

[17] У. Озген, А. Мави, З. Терзи, А. Иилдιрιм, М. Цоскун, ПЈ Хоугхтон, Антиоксидативна својства неких медицинских врста Ламиацеае, Пхарм. Биол. 44 (2006) 107–112.

[18] Њ Миллер, Ц. Рице-Еванс, МЈ Давиес, В. Гопинатхан, А. Милнер, Нова метода за мерење антиоксидативног капацитета и њена примена за праћење антиоксидативног статуса код превремено рођених новорођенчади, Цлин. Сци. 84 (1993) 407–412.

[19] С. Дудонне, Кс. Витрац, П. Цоутиере, М. Воиллез, ЈМ Мериллон, Упоредна студија антиоксидативних својстава и укупног фенолног садржаја 30 биљних екстраката од индустријског значаја коришћењем ДППХ, АБТС, ФРАП, СОД и ОРАЦ тестова , Ј. Агриц. Фоод Цхем. 57 (2009) 1768–1774.

[20] М. Отреба, Ј. Рок, Е. Бусзман, Д. Врзесниок, Регулација меланогенезе: улога цАМП и МИТФ, Постепи Хиг. Мед. Досв. 66 (2012) 33–40.

[21] ЈС Хан, ЈХ Сунг, СК Лее, Активност антимеланогенезе хидролизованог екстракта гинсенга (ГИНСТ) преко инхибиције ЈНК митоген-активиране протеин киназе у Б16Ф10 ћелијама, Ј. Фоод Сци. 81 (2016) Х2085–Х2092.

[22] М. Цхататикун, А. Цхиабцхалард, Тајландске биљке са високим нивоом антиоксиданса, активношћу уклањања слободних радикала, анти-тирозиназном и анти-колагеназном активношћу, БМЦ Цомплемент. Алтерн. Мед. 17 (2017) 487.

[23] Ц. Цоутеау, Љ Цоиффард, Одређивање фотостабилности арбутина, агенса за избељивање поврћа, Фармацо 55 (2000) 410–413.

[24] И. Хигасхи, И. Фујии, Одређивање којичне киселине у козметици за избељивање коже течном хроматографијом високих перформанси у комбинацији са ултраљубичастом детекцијом после дериватизације пре колоне са 4-флуоро-7-нитро{4} {6}},1,3-бензоксазол, Ј. Цосмет. Сци. 63 (2017) 205–212.

[25] ЈИ Тао, Л. Зхао, ЗЈ Хуанг, КСИ Зханг, СЛ Зханг, КГ Зханг, Зханг БХ ФеиКсиао, КЛ Фенг, ГХ Зхенг, Анти-инфламаторни ефекти екстракта етанола из Куммеровиа стриата (Тхунб.) Сцхиндл на ЛПС-у. стимулисана ћелија РАВ264.7, Инфламматион 31 (2008) 154–166.

[26] Ј.-Х. Лее, Ј.-С. Парк, Антиоксидативна активност фракција екстрахованих растварачем из Куммеровиа стриата (Тхунб.) Сцхиндл, Индиан Ј. Сци. Тецхнол. 8 (2015) 28–31.

[27] С. Киппенбергер, С. Лоитсцх, Ф. Солано, А. Бернд, Р. Кауфманн, Квантификација транскрипта тирозиназе, ТРП-1 и Трп{2}} у људским меланоцитима компетитивним реверзном транскриптазом мултиплекс ПЦР – регулација стероидним хормонима, Ј. Инвест.Дерматол. 110 (1998) 364–367.

[28] ИД Парк, СИ Ким, ИЈ Лиоу, ДИ Лее, ЈМ Ианг, ТКСМ13 ћелије хуманог меланома: нови извор за кинетику инхибиције хумане тирозиназе и за скрининг агенаса за избељивање, Биоцхем. Целл Биол. 84 (2006) 112–116.

[29] А. Туеркунтаии, ИК Лиу, А. Тулаке, М. Кабас, А. Еблимит, ХА Аиса, екстракт Кализири повећава експресију тирозиназе, ТРП-1, ТРП-2 и МИТФ код мишјег меланома Б16 ћелије, БМЦ комплемента. Алтерн. Мед. 14 (2014) 166.

[30] Н. Прасанна, ДН Крисхнан, М. Расоол, Кардиотоксичност изазвана натријум арсенитом код пацова: заштитна улога п-кумаринске киселине, уобичајени полифенол у исхрани, Токицол. Мецх. Методе 23 (2013) 255–262.

[31] СЈ Прагасам, В. Венкатесан, М. Расоол, Имуномодулаторни и антиинфламаторни ефекат п-кумаринске киселине, уобичајеног полифенола у исхрани на експерименталну инфламацију код пацова, Инфламматион 36 (2013) 169–176.

[32] М. Лее, М. Сон, Е. Риу, Ким ЈГ Иу СС, БВ Канг, ГХ Сунг, Х. Цхо, Х. Канг, Кверцетином индукована апоптоза спречава ЕБВ инфекцију, Онцотаргет 6 (2015) 12603–12624 .

[33] ЛР Фергусон, ИФ Лим, АЕ Пеарсон, Ј. Ралпх, ПЈ Харрис, Бактеријска анти мутагенеза хидроксициметним киселинама из зидова биљних ћелија, Мутат. Рес. 542 (2003) 49–58.

[34] Ц. Цастеллуццио, Г. Паганга, Н. Меликиан, ГП Болвелл, Ј. Придхам, Ј. Сампсон, Ц. Рице-Еванс, Антиоксидативни потенцијал интермедијара у метаболизму фенилпропаноида у вишим биљкама, ФЕБС Летт. 368 (1995) 188–192.

[35] ИМ Ерден, А. Кахраман, Заштитни ефекат флавонол кверцетина против ултраљубичастог индукованог оксидативног стреса код пацова, Токицологи 154 (2000) 21–29.

[36] СМ Ан, Кох ЈС и Боо ИЦ: п-кумаринска киселина не само да инхибира активност хумане тирозиназе ин витро већ и меланогенезу у ћелијама изложеним УВБ, Пхитотхер. Рес. 24 (2010) 1175–1180.

For more information:1950477648nn@gmail.com