Антиноцицептивна активност Цистанцхе Салса Столонс, расте у Републици Казахстан

Садни материјал

Цистанцхе салса(ЦАМеи.) Бецк, Оробанцхацеае,столони су сакупљени у пустињи Моинкум, село Баканас, јула 2014. у Алматију. Биљни материјал је идентификовала др Г. Ситпајева са Института за ботанику и фитоинтродукцију, Министарство образовања и науке Републике Казахстан, где је депонована под бројем 01-04/306.

Хемијска анализа

Столонс офЦ. салса(2 г) су подвргнути микроталасној екстракцији. У почетку је материјал самлевен на 0.001–2.000 мм, а затим стављен у херметичку посуду да се екстрахује 10 минута на 100–1100 степени са етанолом 80 процената ( однос 1:10). Екстракт хидроетанола (ЦСХЕ) је анализиран помоћу ХПЛЦ-МС. Сирови екстракт је растворен у метанолу (9,6 мг/мл) и филтриран кроз 0,45мм тефлонске мембране пре анализе. Модел течног хроматографа серије ХП 1100 (компанија Агилент Тецхнологиес, ​​Инц., Калифорнија, САД), опремљен проточним вакуумским дегазером, четвороканалном градијентом пумпом ниског притиска и аутоматскомињектор. Фенолна једињења су хроматографски раздвојена на колони Зорбак Ецлипсе КСДБ-Ц18, 2.1× 50 мм, пуњена октадецилсилил силика гелполимером (1.8μ). Хроматографска анализа је спроведена са протоком мобилне фазе од 0.2мл/мин, радни притисак елуента од 175–200 кПа, температура пећи на колони од 30 степени, запремина узорка 2 мл, режим довода елуента са градијентом: 0–36 мин 10 процената А – 90 процената Б; 36 мин – 100% Б (елуент А: метанол, елуент Б: 0,2% раствор мравље киселине). Детекција је извршена УВ на таласним дужинама од 254, 334, 350, 410, 450 и 550нм. За идентификацију хемијских једињења у екстракту коришћено је поређење добијених ретенционих времена, УВ и масеног спектра са референтним једињењима. Квантитативна анализа је извршена применом стандардног вербаскозидаи ехинакозид анализирани под истим хроматографским условима. Њихове калибрационе криве омогућиле су израчунавање количине једног другог фенилпропаноидагликозида у етанолном екстракту ове биљке. Метода није потврђена.

Животиње

Швајцарски мишеви Вебстер (20–25г, стар два месеца) коришћени су у овој студији (донатор Институто Витал Бразил, Нитерои, РЈ, Бразил). Животиње су држане у стандардним условима (циклус светло-мрак од 12 х, 22 ± 2 степена и 70–80 процената влажности. Храна и водапо вољи). Животиње су добијале само воду како би избегле мешање хране са апсорпцијом супстанце 12х пре почетка експеримената. Аклиматизација на лабораторијске услове десила се најмање 1 х пре сваког теста. Сви протоколи су вођени у складу са Смерницама о етичким стандардима за испитивање експерименталног бола код животиња и следили су принципе и смернице које је усвојио Национални савет за контролуЕкспериментисање на животињама (ЦОНЦЕА), одобрено од странеБиомедицински научни институт/УФРЈ, Етички комитет за истраживање животиња, и добио је број ДФБЦИЦБ015-04/16. Сви експериментални протоколи су изведени током светлосне фазе. Број животиња по групи био је минималан и према правилима из ЦОНЦЕА. На крају сваког експеримента мишеви су убијени предозирањем кетамин/ксилазином.

Третмани

У овој студији ЦСХЕ је оцењен са 10, 30 и 100 мг/кг. Екстракт је растворен у диметил сулфоксиду (ДМСО, Фисхер Биотецх) да би се припремио основни раствор на 100°Ц. мг/мл. ПБС је коришћен као разблаживач за припрему различитих доза. Решења која садрже 10, 30 и 100мг/кг хидроетанолног екстрактаЦ. салсабили припремљени. Стандардни лекови који су коришћени били су морфијум 2,5мг/кг (Мерцк, разблажен у физиолошком раствору фосфатног пуфера (ПБС)), ацетилсалицилна киселина 200мг/кг (Сигма Алдрицх, растворен са 5М натријум хидроксида(НаОХ) у 0.9 процената физиолошког раствора) и капсазепин 10 нМол по шапи. Негативној контролној групи дат је физиолошки раствор плус ДМСО (у истој концентрацији као код највећег третмана са екстрактом). Сви третмани (тестирани екстракт и стандарди) су давани оралним путем. Једини изузетак је био капсазепин који је даван интраплантарном ињекцијом.

Акутни бол изазван формалином

Убризган је раствор од 2,5% формалина (37% формалдехида) (20ул) у плантарној регији десне задње шапе мишева 60мин након третмана (хидроетанолни екстракт одЦ. салсаили ацетилсалицилна киселина 200 мг/кг или морфијум 2,5 мг/кг) (Матхеус ет ал., 2005). Животиње су појединачно стављене у провидну стаклену комору и време у секундама које су провеле лижући шапу након ињекције формалина је забележено и анализирано у два одвојена периода, раној фази неурогеног бола (0–5 мин након ињекције) и касна фаза - инфламаторни бол (15-30 мин након ињекције).

Ноцицепција изазвана капсаицином

Овај тест је заснован на методи коју су описали Сакурада ет ал. уз неке модификације (Сакурада ет ал., 1992). Капсаицин (20 ул) Ц18H27НЕ3(Галена, Цампинас, СП) је убризган у плантарну регију десне задње шапе мишева (1,6 уг/шапа) један сат након третмана (хидроетанолни екстрактЦ. салсаили капсазепин 10 нМол/шапа). Животиње су појединачно стављене у стаклену комору и трајање (с) лизања шапе је забележено између 0 и 5мин након ињекције капсаицина, а затим анализиран.

Ноцицепција изазвана глутаматом

У методи коју су описали Беирит и сар. (2002), раствор глутамата у ПБС (20 ул) (l-глутаминска киселина, Сигма–Алдрицх, 3,7 нг/шапа) је убризгана у плантарни регион десне задње шапе мишева један сат након третмана (хидроетанолни екстрактЦ. салсаили морфијум 2,5 мг/кг). Животиње су стављене појединачно у стаклену комору и трајање лизања шапе (секунде) је забележено између 0 и 15 минута након ињекције глутамата, а затим анализирано.

Статистичка анализа

Хемијски подаци су представљени као средња вредност ± СД за пет експеримената. Све фармаколошке експерименталне групе састојале су се од најмање шест мишева. Анализа једносмерне варијансе (АНОВА) праћена Дунеттовим тестом омогућила је визуелизацију статистичке значајности између група коришћењем софтвера ГрапхПад Присм 5.0.pвредности су се сматрале значајним када су биле мање од 0.05 (p < 0.05).

Дискусија

Укупно је идентификовано десет фенилпропаноидних глукозидаЦ. салса(расте у Казахстану) хидроетанолни екстракт. Ехинакозид (10,98 мг/г), актеозид (9,44 мг/г) и тубулозид Б (7,94 мг/г) су главна идентификована једињења. Добијени подаци су у корелацији са доступном литературом за врстеЦистанцхерасте у различитим регионима Азије (Зхоу ет ал., 2014, Ксие ет ал., 2005, Јианг ет ал., 2009). Ехинакозид и актеозид су главне компоненте, које чине основу за стандардизацију официналних врста.Ц. десертицолаиЦ. тубулоса, наведен у кинеској фармакопеји 2005. Предлажемо да се ова једињења могу користити и за стандардизацијуЦ. салсастолона из Казахстана, јер су они главни у проучаваном хидроетанолном екстракту.

Према фармаколошким резултатима ове студије могуће је сугерисати да је ЦСХЕ ефикасан агенс против неурогеног бола и запаљења као што је уочено у формалинском тесту. Најбоље од нашег знањаЦ. салсаникада није тестиран у односу на његово антиноцицептивно деловање. Студија из 2002. саЦ. десертицола(Лин ет ал., 2002) је показала да је ова биљка показала антиноцицептивне и антиинфламаторне активности када је испитана на моделима као што су тотално грчење, формалин и едем шапа. Иако није било покушаја да се истраже главни састојци у екстрактима који су били активни, сматрали су да су екстракт бутанола и водени слој активни. Није изненађујуће да су ови растварачи на скали поларитета која одговара фенилпропаноидугликозиди који се налазе уЦ. салса. Штавише, Лин и сарадници су установили да антиноцицептивно деловањеЦ. десертицолаекстракти нису настали због дејства једињења у опијатном рецепторуили у вези са имунолошким системом. У нашој студији, екстракт богат фенилпропаноидима показао је активност у обе фазе формалинског теста. Уочена активност је у ствари била последица фармаколошког циља који је испитиван, а не било какве могуће моторичке промене као што је доказано тестом рота штапа. Резултати теста на формалин указују на потенцијал за неурогени бол, као и бол изазванинфламаторни медијатори. У почетку смо одлучили да истражимо пут неурогеног бола. Пошто слична једињења из других врста које су претходно проучаване нису показала никакву активност рецептора опијата, одлучили смо да тестирамо друге моделе, као што су модели глутамата и капсаицина.

Глутамат је ексцитаторни неуротрансмитеркоји има важну улогу у модулацији бола у целом периферном и централном нервном систему. Ову акцију посредују лигандом управљани јонотропни глутаматни рецептори(иГлуРс) и метаботропни глутаматни рецептори. иГлуР-ови се могу поделити наN-метил-d-аспартат (НМДА) и -амино-3-хидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионска киселина (АМПА) (Колбер, 2015.). Истраживања су показала да када антагонизују НМДА и АМПА рецепторе са кетамином икаинате, респективно, примећује се ефекат антиноцицепције. Међутим, антагонисти који су до сада циљали на ове рецепторе изазвали су значајан нежељени ефекат и из тог разлога је спроведено ново истраживање фокусирано на мГлуРс у нади да ће лек посредован преко овог рецептора изазвати мање нежељених ефеката (Палацо и др., 2014). Резултати тестирања ЦСХЕ показали су да је овај третман био ефикасан у смањењу бола изазваног глутаматом. Међутим, још увек није познато да ли је овај ефекат посредован преко јонотропних и/или метаботропних рецептора. Морфијум је један од доступних лекова који утиче на глутаматергични пренос (Деиама ет ал., 2007.). У литератури је објављено да активација глутаматног рецептора повећава одговоре на ТРПВ1 (Сзтеин ет ал., 2015). Из тог разлога, могуће је да би ефекат примећен за ЦСХЕ могао бити последица активности на ТРПВ1, а не нужно кроз директан одговор на глутаматне рецепторе.

Следећи корак овог истраживања био је спровођење теста лизања шапе користећи капсаицин као алгетички агенс, који је агонист ТРПВ1 рецептора. Резултати су показали да заиста ЦСХЕ смањује бол преко ТРПВ1 рецептора.

У случају ЦСХЕ, скоро у свим тестираним методологијама, могли смо приметити да је доза од 30 мг/кг постигла боље резултате од 100 мг/кг. Ово може бити због засићења раствора што доводи до преципитираних једињења и ефективно мање количине лекова који су биорасположиви.

Потврда утврђеног хемијског састава за казахстански екстракт ЦСХЕ била је важан корак јер су главни састојци присутни у њему већ на неки начин потврдили своје антиноцицептивно/антиинфламаторно дејство. На пример, ехинакозид је установљен као један од активних принципа одговорних за антиноцицептивно деловањеЕцхинацеае(Хостеттманн, 2003). Такође, претходна студија Шаповала и сарадника (Сцхаповал ет ал., 1998) истакла је актеозид као један од главних активних принципа у екстракту етанола припремљеног саСтацхитарпхета цаиенненсискако је процењено едемом шапе и моделима вруће плоче. Бацкхоусе и сарадници (Бацкхоусе ет ал., 2008) су такође сматрали да је актеозид активни принципБуддлејаглобосакоришћењем неколико модела процене бола, укључујући формалински тест. Нове формулације се сада развијају користећи најсавременије знање како би се повећала стабилност и продужило антиноцицептивно дејство актеозида (Исаццхи ет ал., 2016).

Закључак

У столонима Казахстана идентификовано је десет супстанци фенолне природеЦ. салсапомоћу ХПЛЦ/МС анализе. Ова једињења могу бити одговорна за антиноцицептивну активност уочену у експерименталним моделима који су овде изведени. Узимајући у обзир да је на територији Казахстана родЦистанцхепредстављен је углавном врстамаЦ. салса, можемо препоручити његову бербу и стандардизацију коришћењем ехинакозида и актеозида као стандардних једињења, како бисмо добили сировину доброг квалитета за традиционалну кинеску медицину.