Апикални смичући стрес појачан транспорт органских катјона у људским ОЦТ2/МАТЕ1-трансфицираним ћелијама бубрега Мадин-Дарби паса укључује сенсинг цилијарног

За више информација:emily.li@wecistanche.com

Аисхвариа Јаиагопал, Паул Р. Бракеман, Петер Солер, Ницхолас Феррелл, Виллиам Фисселл, Деанна Л. Кроетз и Схуво Рои

Одељења за биоинжењеринг и терапеутске науке (АЈ, ПС, ДЛК, СР) и педијатрију (ПРБ),

Универзитет Калифорније у Сан Франциску (УЦСФ), Сан Франциско, Калифорнија;

и Одељење за медицину, Одсек за нефрологију, Медицински центар Универзитета Вандербилт, Нешвил, Тенеси (НФ, ВФ)

АПСТРАКТАН

Активан транспорт побубрежнипроксимални тубули играју значајну улогу у диспозицији лекова. Током развоја лека, процене одбубрежниизлучивање је неопходно за одређивање дозе. Биореактори бубрега који репродукују физиолошке рођаке бубрега, као што је напон смицања изазван протоком, могу боље предвидети понашање лека ин виво него тренутни ин витро модели. У овој студији смо истраживали улогу смичног напрезања на активни транспорт 4-(4-(диметиламино)-стирил)-Н-метил пиридинијум јодида (АСП плус) од стране Мадин-Дарби пасабубрегаћелијеегзогено експримирајући хумани транспортери органских катјона, транспортер органских катјона 2 (ОЦТ2) и протеин за екструзију више лекова и токсина 1 (МАТЕ1). Ћелије култивисане у паралелној плочи под континуираном перфузијом медија формирале су чврсти монослој са високом баријером за инулин. Као одговор на повећање нивоа смичног напона (0.2-2 дина/цм), ћелије су показале одговарајуће повећање транспорта АСП плус, достижући максимално 4.2- пута повећање на 2 дина/цм² у поређењу са ћелијама култивисаним у статичким условима. Овај транспорт је инхибиран имипрамином, што указује на присуство активног транспорта у условима смицања. Ћелије изложене стресу смицања од 2 дина/цм² такође су показале повећање експресије РНК и код трансфицираних људи и код ендогеног ОЦТ2 (3.7- и 2.0- пута, респективно). Уклањање цилија амонијум сулфатом је елиминисало ефекте смицања на транспорт АСП плус на 0.5 дина/цм² без утицаја на транспорт АСП плус у статичким условима. Ови резултати указују да напон смицања утиче на активни транспорт органских катјонабубрежницевастиепителне ћелије на начин зависан од цилија.

Цистанцхе је добар за функцију бубрега

Увод

Упркос великом напретку у претклиничким методама за одабир оптималних кандидата за лек, развој лекова остаје дуг и скуп процес који има веома низак принос нових молекуларних ентитета који се пласирају на тржиште (Ваткинс, 2011). Главни недостатак претклиничких модела је немогућност предвиђања клиренса и токсичности код људи. Отприлике 30 процената лекова који су успешни у претклиничким студијама не успевају код људи као резултат неочекиваних вредности клиренса или токсичности (Кола и Ландис, 2004).

Бубрег је посебно важна мета за ин витро моделирање ћелијске културе јер је одговоран за елиминацију више од трећине свих лекова и већине метаболита (Морриссеи ет ал., 2013). Тхебубрежнипроксимални тубул је важан за тестирање лекова током развоја јер обавља већину активног транспорта кандидата за лек и посебно је осетљив на токсичне повреде (Гиацоминиет ал.,2010). Тхебубрежнитубулује монослој епителних ћелија са филтратом који тече преко апикалне површине. Базална мембрана лежи испод тубуларног епитела, а суседне перитубуларне капиларе омогућавају реапсорпцију воде и салута. Микроокружење проксималних тубула, посебно течни смичући стрес и апикобазални онкотски градијенти, непотпуно се репродукују конвенционалним техникама ћелијске културе. Биореактори епителних ћелија који обухватају истакнуту ин виво физиологију могу побољшати тачност предвиђања клиренса и токсичности изведених из ин витро тестова (Пфаллер и Гстраунтхалер, 1998; Астасхкина ет ал., 2012).

Све већи докази указују на то да морфологија и функционалност ћелија проксималних тубула могу варирати у зависности од окружења раста, као што је порозност површине раста, излагање течности са обе стране и/или напон смицања течности. Претходни рад Ессига и Фриедландера (2003), као и из наше лабораторије (Феррелл ет ал., 2010), показао је да је преуређење тока тубуларне течности изазвано у апикалним актинским цитоскелетом ћелија проксималних тубула (Феррелл ет ал., 2010) . Након тога, неколико студија је показало да напон смицања утиче на нивое експресије и локализацију вишеструких уноса и ефлуксних транспортера, укључујући натријум-водоник антипортер 3. На/К-АТПазу, транспортере глукозе, епителни натријумски канал и рецепторе за ендоцитозу, мегалин и тубулин (Дуан ет ал., 2010; Рагхаван ет ал., 2014; Јансен ет ал. 2016; Ернандез ет ал., 2018). Други рад је показао да се струјање смицања у цевастом биореакторском систему оријентише и издужујебубрежницевастићелије дуж путање тока (Вензац ет ал. 2018). Ин витро докази указују на то да су неке промене у структури цитоскелета и транспортној функцији вероватно повезане са механосензорном функцијом цилија (Овергаард ет ал.. 2009; Рагхаван ет ал..2014); међутим, неколико студија је разматрало ефекат смичног напрезања на транспортере лека у бубрежним ћелијама. Штавише, мало се зна о утицају различитих брзина смицања на функционалност ћелије, посебно уз трајно излагање напону смицања. Већина студија је разматрала једну стопу напона на смицање и изводила су само краткорочне експерименте (1-6 сати), што отежава разликовање правих ефеката смицања и ћелијског стресног одговора на нагле промене у микроокружењу (Дуан ет ал.2010; Јанг ет ал.2013: Маггиорани ет ал.2015).

Овде је коришћен микрофлуидни биореактор да се испита ефекат степенастих нивоа смичног напрезања набубрежнитранспортери лека у ћелијама проксималних тубула, транспортер органских катјона 2 (ОЦТ2) и протеин за екструзију више лекова и токсина 1 (МАТЕ1). Показали смо да повећање апикалног смичног стреса доводи до повећања транспорта органских катјона и експресије транспортера и да су цилије укључене у овај ћелијски одговор на стрес смицања.

Материјали и методе

Израда и монтажа уређаја. Раније смо објавили наш дизајн за биореактор са паралелном плочицом који обезбеђује пут протока течности подесиве висине преко апикалне стране ћелија и статички резервоар на базалној страни (Бракеман ет ал., 2016). За рад који је овде представљен, прилагодили смо наш претходни дизајн да креирамо мултиплексирани уређај са четири одвојена путања протока како бисмо омогућили тестирање четири биолошка стања одједном (слика 1). Сваки уређај се састоји од три слоја: основе са 5-мл апикалним резервоаром, средње плоче за држање Снапвелл уметка (Цостар, Цорнинг, Цорнинг, НИ) са површином ћелије од 1,12 цм² и горње плоче која садржи а 1-до 2-мл базолатералног резервоара. Тањири

су машински обрађени од полисулфона да би се омогућила стерилизација аутоклавом. Ласерски резане силиконске заптивке висине од 500- до 1000- ум су постављене између сваког сета плоча да би се затвориле одељке за течност и на апикалној страни да би се дефинисала висина канала. Биореактор је састављен помоћу вијака. Резервоар за медије и хватач мехурића је уграђен у стуб. Улази и излази су повезани помоћу бодљикавих конектора на Мастерфлек ЛС14 силиконске цеви са унутрашњим пречником од 16-мм (Цоле Пармер Лаб Супплиес, Вернон Хиллс, ИЛ). Проток течности, а тиме и апикални смичући напон су подешени и контролисани помоћу перисталтичке пумпе (Цоле Пармер).

Ћелијска култура и проток. МДЦК ћелије трансфектоване или празним вектором или паром транспортера за унос и ефлукс (хОЦТ2/хМАТЕ1) (Кониг ет ал..2011) обезбедио је др Мартин Фром (Ерланген, Немачка) и узгајане у минимални есенцијални медијум са Еарлеовим избалансираним раствором соли (УЦСФ Целл Цултуре Фацилити) са 10 процената феталног говеђег серума (Гибцо, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА) и 1 проценат пеницилин-стрептомицина (УЦСФ Целл Цултуре Фацилити). Петсто микрограма по милилитру хигромицина (УЦСФ Целл Цултуре Фацилити) и 100 мг/х мл генетицина (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) је додато у медијум за двоструко трансфициране ћелије. За експерименте протока, хОЦТ2/хМАТЕ1 МДЦК ћелија су постављени на доњу страну Снапвелл уметака (Цорнинг) у густини од 300,000 ћелија/бунарићу (250,000 ћелија/цм"), узгајани у статичким условима до спајања. а затим стављени у биореактор. Проток апикалног медија је повећан током 7 дана са 0,1 на 1-6млмин док се не постигне жељени напон смицања, а затим остављен стабилан 72 сата пре експериментисања. Ћелије су узгајане у статичким условима исто време као и контроле .

Имунофлуоресценција. Ћелије су фиксиране са 4 процента параформалдехида (Тхермо Фисхер Сциентифиц), пермеабилизоване са 0.1 процентом Тритон-Ксин ПБС (Сигма-Алдрицх) и блокиране са говеђим серумским албумином (Сигма-Алдрицх). Они су накнадно инкубирани са 1:50 разблажењем Алека 488 обележеног зонула оццлуденс-1 мишјег моноклонског антитела (Лифе Тецхнологиес, ​​Царлсбад, ЦА) или примарним ацетилираним мишјим моноклоналним антителом -тубулином (Лифе Тецхнологиес) током 60 минута. Ћелије третиране антителом на а-тубулин су затим инкубиране са секундарним 561 анти-мишјим козјим антителом (Лифе Тецхнологиес) и фалоидином (Тхермо Фисхер Сциентифиц) за бојење Ф-актина. Снимање је изведено коришћењем Никон (Токио, Јапан) спектралног конфокалног микроскопа са 40к уљним објективом.

Барриер Перформанце. Инулин, полимер од 5000 Да, је добро познати маркер брзине гломеруларне филтрације и маркер пропуштања проксималног тубула ин виво (Сохтелл ет ал, 1983):

Инулин обележен ФИТЦ (Сигма-Алдрицх) је додат у апикални медијум и остављен да тече кроз уређаје. Узорци су сакупљени из базалног резервоара свака 24 сата и анализирани на садржај инулина коришћењем Гениос Про флуоресцентног читача плоча (Тецан, Маннедорф, Швајцарска). Баријерна функција ћелијског монослоја је израчуната из нивоа инулина измерених у апикалним и базалним одељцима као што је описано у једнаџби 1. Овде је капитал концентрација инулина у апикалном одељку, а Ц Мал је концентрација у базалном одељку. Пропуштање инулина је израчунато као концентрација у базалном (донорском) одељку подељена са површином ћелије након 24 сата.

АСП плус транспорт. Трансдуковани транспортерски гени су индуковани са 10 мМ На-бутирата (Сигма-Алдрицх) 24 сата пре транспортног експеримента, као што је претходно описано (Кониг ет ал, 2011). Када је било потребно, ћелије су инкубиране са инхибитором (500 μМ имипрамина или 1 мМ циметидина (Сигма-Алдрицх)) на базалној страни 30 минута, након чега је додато 25 μМ 4- (4-диметиламино)- стирил-Н-метил пиридинијум (АСП плус) (Лифе Тецхнологиес) и инкубација 1 сат. Узорци су сакупљени из апикалних и базалних медија. Ћелије су затим три пута испране ледено хладним фосфатним пуфером и лизиране ради мерења АСП плус акумулације и транспорта. Експерименти транспорта су истовремено изведени на ћелијама под стресом смицања и култивисани у статичким условима. АСП плус концентрација је квантификована на Гениос Про флуоресцентном читачу плоча (Тецан) на таласној дужини ексцитације од 485 нм и таласној дужини емисије од 590 нм.

Квантификација протеина. Ћелије су лизиране са 1 процентом СДС-10 М НаОХ пуфера за лизу уз мућкање преко ноћи. Садржај протеина је мерен коришћењем стандардног Пиерце БЦА протеинског комплета (Тхермо Фисхер). Тамо где је било потребно, садржај протеина је нормализован на подручје раста ћелије.

РНК експресија. РНК је екстрахована из ћелија коришћењем комплета за екстракцију РНеаси РНК (Киаген, Хилден, Немачка), а цДНК је генерисана коришћењем скрипт комплета (Био-Рад, Херцулес, ЦА). цДНК је коришћена за детекцију ОЦТ2 и МАТЕ1 људи и паса и П-гликопротеин паса (П-ГП) квантитативном ланчаном реакцијом реверзне транскриптазе-полимеразе коришћењем Тагман теста и сонди (Апплиед Биосистемс) на Фаст Реалтиме ПЦР инструменту (Апплиед Биосистемс). Рибосомални протеин С18 (РС-18) је коришћен као контрола домаћинства. Ефекат смичног напрезања на експресију транспортера је анализиран коришћењем 4АЦт методе коришћењем нивоа транспортера изражених у односу на РС-18(Петерс ет ал.2007; Сцхмиттген и Ливак,2008). П-ГП је коришћен као мера глобалних ефеката смичног напрезања на експресију транспортера.

Децилиатион. Ћелије су узгајане до спајања и затим инкубиране у одсуству или присуству 30 мМ амонијум сулфата (Флука АГ) током 24 сата пре мерења АСП плус транспорта (Окергард ет ал 2009). Присуство цилија је одређено снимањем а-тубулина као што је већ описано овде.

Статистика. Сви експерименти су изведени у три примерка са најмање две техничке реплике у оквиру сваког експеримента. Подаци су изражени као средња вредност ± СД и графички приказани као дијаграми кутија и бркова. Статистичке анализе су вршене неупареном једносмерном или двосмерном анализом варијансе, а П-вредност од<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Резултати

Морфологија ћелије и функција баријере. Иммунофлуо-ова недавна анализа ћелија смештених испод тока открила је једнообразно формирање монослоја са протеином чврстог споја, зонула оццлуденс-1, локализованим на уским спојевима између ћелија иу статичким и у условима протока (Слика 2, А–Ц). Квантификација укупног садржаја протеина показала је повећање садржаја протеина до 16- пута по квадратном центиметру монослоја као одговор на напон смицања (слика 2Д). Затим смо измерили пропустљивост инулина, маркера пропуштања проксималних тубула, преко монослоја. Уређаји су задржали стопу перформанси баријере од 97,9 процената 6 1.42 процената током 7 дана културе под напоном смицања до 2 дина/цм2 (слика 2Е), што је резултирало коначном стопом цурења инулина 6. дана { {15}}.13–0.69 мг/цм2 дневно.

Утицај смичног напрезања на транспорт органских катјона. Транспорт АСП плус, аутофлуоресцентног супстрата ОЦТ2 и МАТЕ1, мерен је 1 сат на различитим нивоима напона смицања (0.2-2 дина/цм²). МДЦК ћелије које егзогено експримирају хОЦТ2 и хМАТЕ1 показале су 42- пута повећање транспорта АСП плус као одговор на смичући напон од 2 дина/цм² што се одражава у мерама ћелијске акумулације (Слика 3А) и трансћелијског транспорта (Сл. 3Б). Ефекат смичног напрезања на АСП плус акумулацију или трансћелијски транспорт био је сличан под напоном смицања од 0.5 и 2 дина/цм². Да би се утврдило да ли је активни АСП плус транспорт повећан, транспорт АСП плус ћелијама изложеним 0.2 дина/цм смичног напона је мерен са или без претходног третмана са 500 уМ имипрамина, ОЦТ{{20} } и МАТЕ1-специфични инхибитор. АСП плус транспорт је инхибиран имипрамином за 60,3 процената ± 15,8 процената под условима смицања у поређењу са 47,6 процената ±19,7 процената у статичким условима (Слика 3Ц).

Да би се ово запажање даље разумело, ефекат смицања на експресију хуманог ОЦТ2 (трансфектованог), пасјег ОЦТ2 (ендогеног) и пасјег П-ГП (ендогеног) мерен је у ћелијама изложеним различитим нивоима смицања током 72 сата након споро повећање смицања током 7 дана (слика 4). У поређењу са ћелијама култивисаним у статичким условима, МДЦК ћелије изложене смицању показале су повећану експресију трансфектованог хуманог и ендогеног ОЦТ2 (до 3.7- и 2.0- пута, респективно), без значајног ефекта на експресију трансфектованог МАТЕ1 или ендогеног П-ГП.

Улога Цилиа у одговору на смицање. Снимање је показало да двоструко трансфектоване МДЦК ћелије експримирају цилије иу статичким иу условима протока (Слика 5, А и Е). Излагање ћелија 30 мМ амонијум сулфата током 24 сата изазвало је потпуни губитак цилија (Сл.5, Ц и Г). Важно је да децилијација није имала грубе ефекте на спојеве ћелијске мембране, што је мерено снимањем Ф-актина, који учвршћује протеине чврстог споја на спојевима ћелијске мембране у епителним ћелијама (Слика 5.Д и ХД (Стевенсон и Бегг. 1994). Иако постоји одређено задебљање бојења Ф-актина на овим сликама, ово није био конзистентан налаз, па стога нисмо квантификовали овај ефекат. Децилијација није имала утицаја на транспорт ћелија култивисаним у статичким условима. али је потпуно елиминише ефекте смичног напрезања на АСП плус транспорт у ћелијама изложеним смицању од 0,5 дина/цм² (слика 6).

Дискусија

Бубрези игра централну улогу у елиминацији лекова у људском телу. Важно је тачно опонашати сложеност физиологије бубрега за ин витро тестирање лекова, посебно у погледу протока течности. Показало се да напон смицања услед протока течности утиче на морфологију ћелије и транспортере јона ин витро, али се мало зна о ефектима на транспортере лекова (Дуан ет ал., 2010; Феррелл ет ал., 2012; Јансен ет ал., 2016) . Поред тога, већина претходних студија је мерила само ефекат краткотрајног смицања (1-6 сати), што је мало вероватно да ће у потпуности изоловати ефекте стреса на смицање од других ћелијских одговора на стрес (Дуан ет ал..2010; Јанг ет ал. 2013; Маггиорани ет ал.. 2015). У овим студијама, фокусирали смо се на ефекте трајног (7 дана) напона на смицање од протока течности на транспорт лека како бисмо боље опонашали трајно напон смицања који доживљавабубрежницевастићелије ин виво.

Разумевање начина на који транспортери лека реагују на трајни смичући стрес може побољшати ин витро предвиђања ин виво руковања лековима путем бубрега. Прецизно дизајнирани ин витро модели бубрега могу стандардизовати претклиничка испитивања и смањити стопе неуспеха лека.

У овом раду, паралелни микрофлуидни биореактор је коришћен за одређивање ефеката трајног смичног напрезања на транспорт органских катјона помоћу ОЦТ2 и МАТЕ1 убубрежнитубулућелијска линија. Неколико ћелијских линија је узето у обзир за ове студије, укључујући људске ћелијске линије као што су ћелије проксималних тубула људи из Хопферове групе (Оросз ет ал, 2004) и РПТЕЦс (ЦРЛ-4031:Америцан Типе Цултуре Цоллецтион, Манассас, ВА)( Виесер ет ал., 2008), али су двоструко трансфектоване хОЦТ2/хМАТЕ1 МДЦК ћелије сматране најприкладнијим избором за ову студију из неколико разлога. Прво, МДЦК ћелије доследно показују робусну везу за трансвелл уметке, што им омогућава да издрже почетни стрес протока течности. Друго, ове ћелије формирају чврсте монослојеве, што спречава цурење и неопходно је за проучавање трансцелуларног транспорта маркерских супстрата. Коначно, егзогена експресија транспортера омогућава побољшану детекцију активног транспорта и ефекта пертурбација.

Ћелије постављене испод тока формирале су конфлуентни монослој и локализовали протеин чврстог споја на периферији ћелије. Такође су задржали високу функцију баријере мерену пропустљивошћу инулина. Способност епителних ћелија да формирају монослој који спречава цурење течности и протеина је изузетно важна за правилну функцију тубула. Овде је цурење кроз МДЦК ћелије било минимално на мање од 1 уг/цм² дневно и знатно ниже од оног кроз људске ћелије. Раније смо показали да монослојеви људских ћелија бубрега имају цурење инулина 10-20 уг/цм² по дану (Бракеман ет ал., 2016), подржавајући закључак да су ћелије хОЦТ2/хМАТЕ1 МДЦК формирале робустан монослој.

Транспорт АСП плус је значајно повећан у хОЦТ2/хМАТЕ1 МДЦК ћелијама изложеним различитим нивоима смицања током 72 сата у поређењу са статичким контролама. АСП плус преузима ОЦТ2 (СЛЦ22А2) и избацује МАТЕ1 (СЛЦ47А1), два транспортера органских катјона који раде заједно како би олакшалибубрежнилучење често коришћених лекова, као што су метформин и цисплатин (Биерманн ет ал.2006; Виттвер ет ал.2013). Слични ефекти напона смицања су пријављени за транспортере јона у проксималним тубулима. Пријављено је повећање уноса албумина, реапсорпције јона и експресије и функције мегалина и тубулина као одговор на повећан стрес смицања (Овергаард ет ал..2009; Дуан ет ал.2010.: Феррелл ет ал..2012:Рагхаван ет ал., 2014). Излагањебубрежнићелије проксималних тубула на стрес смицања је такође повезан са смањеном апоптозом и бржим опоравком од акутне токсичности цисплатина и појачаном инхибицијом транспорта органских ањона (Јанг ет ал.2013). Пошто је напон смицања од протока течности стално присутан у проксималном тубулу, ови налази заједно подржавају употребу више физиолошких ин витро модела система за предвиђање диспозиције и токсичности лека у бубрезима. Важно је напоменути да не постоји значајна разлика у функцији транспортера између 0.5 и 2.0 дина/цм² смичног напона. Претходне студије Ессига и Фриедландера (2003) су откриле да је потребан минимални ниво смицања од 0,17 дина/цм2 да би се изазвала промена у морфологији ћелија, а друге студије су измериле ефекте на физиологија до 1 дин/цм² (Дуан ет ал., 2010). Ово је прва студија која истражује ефекте низа виших и дуготрајних нивоа смичног напрезања на функционалност бубрежних транспортера лекова, и могуће је да је величина биолошке разлике између 0,5 и 2,0 дина/цм² смичног напрезања коју ми процењено није било довољно велико да омогући идентификацију разлика између ових нивоа напона на смицање у нашим тестовима. Иако је потребно даље истраживање, наши резултати бацају светло на потребне услове за физиолошки релевантне моделе и ефекте повећаних нивоа напона на смицање услед болести на руковање бубрежним лековима.

Једно од ограничења наших експерименталних метода је то што смо се бавили транспортом само на пХ 7,4 користећи медијум са пХ 7,4 на апикалним и базалним странама, опонашајући експерименталне методе које су претходно описане за хОЦТ2/хМАТЕ1 МДЦК ћелије (Кониг ет ал..2011). Апикални према базалном пХ градијенту може утицати на функцију ОЦТ2 и МАТЕ1, а обично постоји пХ градијент у физиолошким условима (Муллер ет ал., 2013). Наше методе су, стога, ограничиле нашу способност да проценимо интеракцију између апикалног и базалног пХ градијента и напона смицања на ОЦТ2 и МАТЕ1 функцији. Пошто смо користили конзистентан пХ од 7,4 у свим експерименталним условима, мало је вероватно да би овај недостатак пХ градијента утицао на наше налазе, али потенцијално ограничава применљивост наших налаза на транспорт ОЦТ2 и МАТЕ1 у присуству апикалног према базалном пХ градијенту.

Изненађујуће, експресија мРНК трансфектованог хуманог и ендогеног ОЦТ2 је повећана у ћелијама изложеним свим нивоима смицања у поређењу са статичким контролама. Ова регулација експресије транспортера била је специфична, без мерљивог ефекта на ендогену експресију П-ГП или трансфектовани МАТЕ1. Повећање експресије транспортера даје увид у механизам који стоји иза повећаног транспорта и може бити резултат побољшане стабилности мРНК или повећане транскрипције мРНК. Занимљиво је напоменути да су и трансфектовани и ендогени транспортери били појачано регулисани, што је неочекивано пошто је трансфектовани ОЦТ2 експримиран под промотором цитомегаловируса и не би требало да буде подложан регулаторним механизмима експресије ендогених гена. Иако изненађујуће, ово запажање није без преседана. Пријављен је сличан ефекат на ћелије проксималних тубула трансфектованих ОАТ1 изложених перфузији, али механизам за повећану експресију остаје нејасан (Јансен ет ал., 2016). У другој студији, откривено је да сигнализација Нрф2 игра улогу у повећању ендогене експресије МАТЕ2-К као одговор на напон смицања (Фукуда ет ал., 2017). Даља студија о овоме је оправдана и биће предмет будућих истрага.

Такође смо идентификовали да је увођење апикалног смичног тока повећало садржај протеина по квадратном центиметру ћелија. Овај ефекат је био исте величине и за 0.5 и 2 дина/цм² смицања, сличан ефекту уоченом за експресију мРНА и транспорт АСП плус. Постоје неки докази да напон на смицање изазива повећање висинебубрежниепителне ћелије, што би резултирало већом запремином ћелија по квадратном центиметру и тиме вероватно повећањем протеина по квадратном центиметру; међутим, овај претходно објављени феномен био је само мање запажање у већем броју података и није квантитификован (Лонг ет ал., 2017). Повећање укупног протеина у ћелијама узгајаним у присуству апикалног смичног тока може представљати нормалан садржај протеина за здравебубрежницевастиепителних ћелија које се могу постићи само излагањем ћелија апикалним смицањем. Стога, нижи нивои садржаја протеина у ћелијама узгајаним у статичкој култури могу представљати абнормално ћелијско стање које се клинички може јавити у ситуацијама ниског апикалног протока филтрата, као што је акутна повреда бубрега. Овај феномен заслужује даље проучавање.

Познато је да цилије имају механосензорне улоге у проксималном тубулу (Рагхаван и Веисз,2016). Стога, да би се утврдило да ли оне играју критичну улогу у повећаном транспорту посредованом ОЦТ2 и МАТЕ1-о коме је овде наведено, мерен је ефекат уклањања цилија на функцију транспортера. Потпуна блокада повећања АСП плус транспорта у зависности од смицања уклањањем цилија у нашим студијама је слична ефекту који је пронађен у студијама Рагхавана ет ал. (2014), који је показао повећање регулације ендоцитозе зависну од цилија као одговор на проток течности. Амонијум сулфат вероватно има друге некарактеристичне ефекте на понашање и функционалност ћелије који могу индиректно утицати на транспорт раствора. Упркос могућим ефектима ван циља, овај метод децилијације тестира улогу цилијарног сенсинга у кретању органских раствора посредованим транспортером. Механизам сигнализације између механо-сензорних протеина у цилијама и транспортера тренутно је непознат. Једна хипотеза је да се функција транспортера органских катјона мења измењеним транспортом јона. Познато је да уклањање цилија мења покретљивост раствора у ћелијама проксималних тубула, посебно смањењем Нат/К плус. Локализација АТПазне мембране и модификовање парацелуларног транспорта (Овергаард ет ал., 2009). Могуће је да ово резултира променама у функцији МАТЕ1, антипортеру који зависи од Х градијента. Друга хипотеза је да осећај смичног напона утиче на експресију транспортера органских катјона. Напон смицања модулише функцију МАТЕ2-К путем Нрф2 сигнализације (Фукуда ет ал., 2017). Други транспортери органских катјона могу слично реаговати на напон смицања, који би био елиминисан када се уклоне механосензорне цилије. Много тога је непознато и захтева даље проучавање. Занимљиво је да уклањање цилија није имало значајан ефекат на АСП плус транспорт ћелијама изложеним напону смицања од 0,2 дина/цм², али је уочен снажан ефекат када је смичући стрес повећан на 0,5 дина/цм2. Ово сугерише да цилије осећају гранични ниво напона смицања; заузврат, промене сигнала цилија у експресији и функцији транспортера пре него што се очекују мерљиви ефекти на транспорт. Све у свему, зависност транспорта органских катјона од цилијарног сенсинга напона смицања пружа увид у укључени механосензорни сигнални пут и минимални ниво стреса који би могао бити потребан да би се покренуо снажан одговор на смицање.

Укратко, ови подаци показују да напон смицања од протока течности има значајан утицај на функцију и експресију транспортера органских катјона у МДЦК ћелијама. Штавише, регулација транспорта органских катјона зависила је од присуства цилија. Предлажемо да је апикални смични напон важна компонента сваког ин витро моделирањабубрежницевастићелије и вероватно ће бити важна компонента моделирања клиренса бубрежне секреције и нефротоксичности лекова. Специфичан механизам којим сигнали механичког стреса повећавају активност и експресију транспортера је још увек нејасан и захтева даље проучавање.

Референце

Астасхкина А, Манн Б, и Граингер ДВ (2012) Критичка процена ин витро модела ћелијске културе за скрининг и токсичност лекова високе пропусности. Пхармацол Тхер 134:82-106.

Биерманн Ј, Ланг Д, Горбоулев В, Коепселл Х, Синдиц А, Сцхротер Р, Звирблиене А, Павенстадт Х, Сцхлаттер Е, и Циаримболи Г (2006) Карактеризација регулаторних механизама и стања људског транспортера органских катјона 2. Ам Ј Пхисиол Целл Пхисиол 290: Ц1521–Ц1531.

Бракеман П, Миао С, Цхенг Ј, Лее ЦЗ, Рои С, Фисселл ВХ и Феррелл Н (2016) Модуларни микрофлуидни биореактор са побољшаним протоком за процену поларизованих ћелија епитела бубрега. Биомицрофлуидицс 10:064106.

Дуан И, Веинстеин АМ, Веинбаум С, и Ванг Т (2010) Промене локализације и експресије мембранског транспортера изазване стресом смицања у ћелијама проксималних тубула миша. Проц Натл Ацад Сци УСА 107: 21860–21865.

Ернандез Т, Удван К, Цхассот А, Мартин ПИ и Фераилле Е (2018) Унион нефректомија и смицање апикалне течности смањују обиље ЕНаЦ у главним ћелијама сабирних канала. Ам Ј Пхисиол Ренал Пхисиол 314:Ф763–Ф772.

Ессиг М и Фриедландер Г (2003) Тубуларни смичући стрес и фенотип бубрежних проксималних тубуларних ћелија. Ј Ам Соц Непхрол 14 (Суппл 1): С33–С35.

Феррелл Н, Десаи РР, Флеисцхман АЈ, Рои С, Хумес ХД и Фисселл ВХ (2010) Микрофлуидни биореактор са интегрисаним електродама за мерење трансепителног електричног отпора (ТЕЕР) за процену ћелија епитела бубрега. Биотецхнол Биоенг 107:707–716.

Феррелл Н, Рицци КБ, Гросзек Ј, Мармерстеин ЈТ и Фисселл ВХ (2012) Руковање албумином од стране бубрежних тубуларних епителних ћелија у микрофлуидном биореактору. Биотецхнол Биоенг 109:797–803.

Феррелл Н, Рицци КБ, Десаи РР, Гросзек Ј, Мармерстеин ЈТ и Фисселл ВХ (2012) Микрофлуидни биореактор за студије епителних ћелија под стресом смицања течности. ФАСЕБ Ј 26:911.3.

Фукуда И, Каисхима М, Охнисхи Т, Тохиама К, Цхисаки И, Накаиама И, Огасавара-Схимизу М и Кавамата И (2017) Напон смицања флуида стимулише експресију МАТЕ2-К путем активације пута Нрф2. Биоцхем Биопхис Рес Цоммун 484:358–364.

Гиацомини КМ, Хуанг СМ, Твеедие ДЈ, Бенет ЛЗ, Броувер КЛР, Цху Кс, Дахлин А, Еверс Р, Фисцхер В, Хиллгрен КМ, ет ал.; Међународни конзорцијум транспортера (2010) Мембрански транспортери у развоју лекова. Нат Рев Друг Дисцов 9: 215–236.

Јанг КЈ, Мехр АП, Хамилтон ГА, МцПартлин ЛА, Цхунг С, Сух КИ и Ингбер ДЕ (2013) Проксимални тубул на чипу људског бубрега за транспорт лекова и процену нефротоксичности. Интегр Биол 5:1119–1129.

Јансен Ј, Федецостанте М, Вилмер МЈ, Петерс ЈГ, Креусер УМ, ван ден Броек ПХ, Менсинк РА, Болтје ТЈ, Стаматиалис Д, Ветзелс ЈФ, ет ал. (2016) Биоинжењеринг бубрежних тубула ефикасно излучују уремичне токсине. Сци Реп 6:26715.

Кола И и Ландис Ј (2004) Може ли фармацеутска индустрија да смањи стопе осипања? Нат Рев Друг Дисцов 3:711–715.

Кониг Ј, Золк О, Сингер К, Хоффманн Ц и Фромм МФ (2011) Двоструко трансфектоване МДЦК ћелије које експримирају хумани ОЦТ1/МАТЕ1 или ОЦТ2/МАТЕ1: детерминанте узимања и трансцелуларне транслокације органских катјона. Бр Ј Пхармацол 163:546-555.

Лонг КР, Схипман КЕ, Рбаиби И, Менсхикова ЕВ, Ритов ВБ, Есхбацх МЛ, Јианг И, Јацксон ЕК, Бати ЦЈ и Веисз ОА (2017) Апикална ендоцитоза проксималног тубула је модулисана стресом смицања течности преко пута који зависи од мТОР. Мол Биол Целл 28: 2508–2517.

Маггиорани Д, Диссард Р, Беллои М, Саулниер-Блацхе ЈС, Цасемаиоу А, Дуцассе Л, Грес С, Беллиере Ј, Цаубет Ц, Басцандс ЈЛ, ет ал. (2015) Промена епителне организације изазвана стресом смицања у људским бубрежним тубуларним ћелијама. ПЛоС Оне 10:е0131416.

Морриссеи КМ, Стоцкер СЛ, Виттвер МБ, Ксу Л и Гиацомини КМ (2013) Бубрежни транспортери у развоју лијекова. Анну Рев Пхармацол Токицол 53:503–529.

Муллер Ф, Кониг Ј, Хоиер Е, Мандери К и Фромм МФ (2013) Улога транспортера органских катјона ОЦТ2 и протеина за екструзију више лекова и токсина МАТЕ1 и МАТЕ2-К за транспорт и интеракције лекова антивирусног ламивудина. Биоцхем Пхармацол 86: 808–815.

Оросз ДЕ, Воост ПГ, Колб РЈ, Финесилвер МБ, Јин В, Фриса ПС, Цхоо ЦК, Иау ЦФ, Цхан КВ, Ресницк МИ, ет ал. (2004) Потенцијал раста, имортализације и диференцијације нормалних ћелија проксималног тубула одраслих људи. Ин витро Целл Дев Биол Аним 40:22–34.

Овергаард ЦЕ, Санзоне КМ, Спицзка КС, Схефф ДР, Сандра А и Иеаман Ц (2009) Децилиација је повезана са драматичним ремоделирањем спојева епителних ћелија и површинских домена. Мол Биол Целл 20:102–113.

Петерс ИР, Пеетерс Д, Хелпс ЦР, и Даи МЈ (2007) Развој и примена вишеструких интерних референтних (домаћица) генских тестова за тачну нормализацију студија експресије псећих гена. Вет Иммунол Иммунопатхол 117:55–66.

Пфаллер В и Гстраунтхалер Г (1998) Испитивање нефротоксичности ин витро--шта знамо и шта треба да знамо. Енвирон Хеалтх Перспецт 106 (Суппл 2): 559–569.

Рагхаван В, Рбаиби И, Пастор-Солер НМ, Цараттино МД, и Веисз ОА (2014) Регулација апикалне ендоцитозе у ћелијама проксималног тубула бубрега зависна од смичног стреса посредована примарним цилијама. Проц Натл Ацад Сци УСА 111:8506–8511.

Рагхаван В и Веисз ОА (2016) Уочавање улоге механосензора у регулисању функције проксималног тубула. Ам Ј Пхисиол Ренал Пхисиол 310:Ф1–Ф5.

Сцхмиттген ТД и Ливак КЈ (2008) Анализа ПЦР података у реалном времену компаративном Ц(Т) методом. Нат Протоц 3:1101–1108.

Сохтелл М, Карлмарк Б и Улфендахл Х (1983) ФИТЦ-инулин као маркер бубрежних тубула код пацова. Ацта Пхисиол Сцанд 119:313–316.

Стевенсон БР и Бегг ДА (1994) Ефекти зависни од концентрације цитохаласина Д на чврсте спојеве и актинске филаменте у МДЦК епителним ћелијама. Ј Целл Сци 107: 367–375.

Вензац Б, Мадоун Р, Бенараб Т, Монниер С, Цаирац Ф, Мирам С, Лецонте Л, Амблард Ф, Виови ЈЛ, Десцроик С, ет ал. (2018) Инжењеринг малих цеви са променама у пречнику за проучавање организације ћелија бубрега. Биомицрофлуидицс 12: 024114.

Ваткинс ПБ (2011) Науке о безбедности лекова и уско грло у развоју лекова. Цлин Пхармацол Тхер 89:788–790.

Виесер М, Стадлер Г, Јеннингс П, Стреубел Б, Пфаллер В, Амброс П, Риедл Ц, Катенгер Х, Гриллари Ј и Гриллари-Воглауер Р (2008) хТЕРТ сам по себи овековечује епителне ћелије проксималних тубула бубрега без промене њихових функционалних карактеристика. Ам Ј Пхисиол Ренал Пхисиол 295: Ф1365–Ф1375.

Виттвер МБ, Зур АА, Кхури Н, Кидо И, Косака А, Зханг Кс, Морриссеи КМ, Сали А, Хуанг И и Гиацомини КМ (2013) Откриће моћних, селективних инхибитора транспортера више лијекова и токсина 1 (МАТЕ1, СЛЦ47А1) кроз профилисање лекова на рецепт и рачунарско моделирање. Ј Мед Цхем 56:781–795.