Одговарајући ниво вежбања смањује дисбиозу црева и повећање валеринске киселине како би се побољшала неуропластичност и когнитивне функције после операције код мишева, део 3

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Експерименталне протоколе и процедуре одобрио је Институционални комитет за негу и употребу животиња Универзитета Вирџиније (Шарлотсвил, ВА, САД; број протокола: 3114).

Памћење је једна од способности које често треба да користимо у свакодневном животу. Може учинити људе паметнијима, осетљивијима и погоднијима за каријеру и међуљудске односе. Због тога многи људи желе да побољшају своје памћење. Постоји веза између експерименталних протокола и меморије. Хајде да истражимо ово питање следеће.

Прво, експериментални протоколи могу помоћи људима да побољшају своје памћење. У експерименту, људи треба да прате одређене кораке да би завршили експерименталну операцију. Ова активност корак по корак може довести људски мозак у стање високе пажње и концентрације, чиме се промовише перформансе можданих функција. Истовремено, током експеримента морате запамтити неке експерименталне податке и експерименталне кораке, који ће такође вежбати меморијску функцију мозга. Вишекратним вежбањем на овај начин, ваше памћење ће се постепено побољшавати.

Друго, чулно искуство током процеса памћења је такође уско повезано са дизајном експерименталног плана. У експериментима, дизајнери често постављају одређене специфичне задатке током експеримента, тако да учесници треба да понове исту операцију више пута, као што су памћење и писање бројева, памћење и препознавање блокова боја, итд. Ово искуство које се понавља може ојачати људе способности пажње и памћења, што олакшава људима да прераде ове информације у дугорочну меморију.

Поред тога, у експериментима, употреба репрезентативних стимулативних материјала (као што су слике, звукови, мириси, итд.) такође може дати добре резултате. Зато што ови стимуланси могу покренути мождано узбуђење и процесе памћења, чиме се побољшава способност памћења људи. У исто време, ови стимуланси се такође могу повезати са окружењем и ситуацијама у животу, чиме се смањује појава раздвајања и чине информације лакшим за памћење и кохезивнијим.

Да сумирамо, експериментални план игра кључну улогу у побољшању људског памћења. Спровођењем експеримената, људи могу да вежбају своје когнитивне способности, побољшају ниво памћења и истовремено промовишу функцију мозга. Стога би требало да наставимо да учимо нове експерименталне методе и учествујемо у више експеримената како бисмо побољшали ниво памћења и дали већи допринос нашој каријери, односима и здрављу. Види се да морамо побољшати памћење, а Цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење, јер Цистанцхе десертицола има антиоксидативна, антиинфламаторна и анти-агинг ефекта, што може помоћи у смањењу оксидације и инфламаторних реакција у мозгу, чиме се штити здравље нервног система. Поред тога, Цистанцхе десертицола такође може да подстакне раст и поправку нервних ћелија, чиме се побољшава повезаност и функција неуронских мрежа. Ови ефекти могу помоћи у побољшању памћења, способности учења и брзине размишљања, а такође могу спречити развој когнитивне дисфункције и неуродегенеративних болести.

Кликните на Знај краткорочну меморију како да побољшате

Све експерименте на животињама извршио је водич Националног института за здравље за негу и употребу лабораторијских животиња (НИХ публикације број 80–23) ревидиран 2011. Извори кључних материјала наведени су у Табели кључних ресурса у Додатним материјалима.

Животиње и експериментални дизајн

Осмонедељни мужјаци Ц57БЛ/6 Ј мишеви тежине 19–22 г смештени су у просторију која је одржавана у константним условима околине (температура 22–24 степена, циклус светлости/мрака од 12 сати и 50 ± 10% влажности) са слободним приступом храни и воду.

Свима је дозвољено да се аклиматизирају недељу дана пре експеримената. Они су насумично распоређени у следеће групе у првом експерименту: (1) контролна група (није била изложена анестезији и операцији), (2) група за вежбање (вежбана са 35–40% максималног капацитета, али није била изложена анестезији и операцији) , (3) хируршка група (излагање левој каротидној артерији 15 минута под анестезијом изофлураном 2 х), и (4) до (6) Еке-л+Сур, Еке-м+Сур и Еке-х+Сур групе: вежба се на 35 –40%, 55–60% и 75–80% максималног капацитета, респективно, и били су подвргнути анестезији и операцији.

Животиње су коришћене за учење и тестове памћења почевши од 4 дана након операције (н=20) или су њихови мозгови сакупљени за биохемијске анализе 6 х, 24 х, 48 х, 72 х, 96 х и 7 дана након операције (н=9 или 14), за имунофлуоресцентно бојење 48 сати и 19 дана након операције (н=6), и за Голгијево бојење 19 дана након операције (н=8).

Крв и измет мишева из прве 4 групе су сакупљени за мерење СЦФА 7 дана након операције (н=7) и за 16 С анализе 3 и 7 дана након операције (н=8) или у на крају 4-недељног протокола вежбања (н=8) ​​или у одговарајуће време у прве 2 групе (н=16). Мишеви за сакупљање ткива били су различите кохорте мишева који су коришћени за тестове учења и памћења. У другом експерименту, мишеви су насумично распоређени у (1) Трансцонтрол+Сур групу и (2) Транс-еке+Сур групу.

Мишеви у првој групи примали су 500 ул фекалног раствора од контролне групе путем желудачне сонде и 600 ул клистиром једном дневно током 7 узастопних дана након третмана антибиотицима да би се елиминисала нативна цревна микробиота код прималаца. Мишеви у другој групи примали су 500 ул фекалног раствора од мишева за вежбање путем желудачне сонде и 600 ул клистиром једном дневно током 7 узастопних дана након третмана антибиотиком. Измет од прималаца је сакупљен 14 дана након фекалне трансплантације за 16 С анализу. Мишеви су тада били подвргнути операцији.

Учење и памћење су процењени 4 дана након операције (н=15). Мозак је сакупљен за биохемијске студије као у првом експерименту (н=10). У трећем експерименту, мишеви су насумично распоређени у (1) Трансцонтрол групу и (2) Транс-цонтрол+Сур групу. Мишеви у обе групе су примили трансплантацију фекалија контролних мишева. Друга група је оперисана 14 дана након фекалне трансплантације. Хипокампус је сакупљен 2 дана након операције ради мерења ГДНФ (н=10). У четвртом експерименту, мишеви су насумично распоређени у (1) контролну групу (наивни мишеви који нису били изложени ниједним експерименталним условима описаним у овој студији), (2) група антибиотика која је примала антибиотике 7 дана и (3) транс-контролна група која је примила трансплантацију фецеса контролних мишева.

Учење и памћење су процењени 19 дана након завршетка фекалне трансплантације (26 дана након завршетка третмана антибиотиком у групи антибиотика) (н=12). У петом експерименту, мишеви су насумично распоређени у (1) контролну групу, (2) Транс-контролна група која је примила трансплантацију фецеса од контролних мишева и (3) Транс-хируршка група која је примила ординације за трансплантацију од хируршких мишева. 

Трансплантација фекалија је изведена као што је описано у другом експерименту. Измет од прималаца је сакупљен 14 дана након фекалне трансплантације за 16 С анализу (н=10). Учење и памћење су процењени 4 дана након што је узорак фекалије сакупљен (н=17). У шестом експерименту, мишеви су насумично распоређени у (1) операцију плус нормални физиолошки раствор који је примио 200 µл нормалног физиолошког раствора (НС) једном интраперитонеалном ињекцијом недељно током 4 недеље, а затим операција, (2) вежба плус нормалан физиолошки раствор плус хируршка група која је примила 200 µл НС интраперитонеалном ињекцијом једном недељно током 4-недељне вежбе са 35–40% максималног капацитета, а затим операцијом, (3 ) вежба плус валеринска киселина плус хируршка група која је примала валеринску киселину (200 мг/кг у 200 µл) интраперитонеалном ињекцијом једном недељно током 4-недељне вежбе са 35–40% максималног капацитета, а затим хируршким захватом.

Ињекција је дата ујутру првог дана вежбања у недељи. Једна додатна ињекција је урађена на дан операције. Бихејвиорални(н=13) и биохемијски (н=10) исходи су процењени као у овом другом експерименту. У седмом експерименту, 13-недељни (тежине 23–27 г) мужјак Ц57БЛ/ 6 Ј мишева је насумично распоређено у (1) контролну групу, (2) НС групу која је примала 4 µл НС интрацеребровентрикуларним ињекцијама једном дневно током 4 узастопна дана, и (3) групу валеринске киселине која је примала 4 мг/кг у 4 µл интрацеребровентрикуларно ињекција једном дневно током 4 узастопна дана. Лева и десна церебровентрикула су убризгане по наизменичном распореду. Учење и памћење су процењени 4 дана након ињекције (н=15).

У осмом експерименту, мишеви су насумично распоређени у групу (1) операција плус диметил сулфоксид (ДМСО) која је примала ДМСО интрацеребровентрикуларном ињекцијом једном дневно током 4 узастопна дана почевши од дана операције, (2) операцију плус групу Ц3ар антагониста која је примила антагонист Ц3ар2901577 ( ) интрацеребровентрикуларном ињекцијом једном дневно током 4 дана почевши од дана операције, (3) вежба плус ДМСО плус хируршка група која је примала ДМСО интрацеребровентрикуларном ињекцијом једном дневно током 4 узастопна дана почевши од дана операције након 4-недељне вежбе у 35. –40% максималног капацитета и (4) вежба плус Ц3ар агонист плус хируршка група која је примала Ц3арагонист интрацеребровентрикуларном ињекцијом једном дневно током 4 узастопна дана почевши од дана операције после 4-недељне вежбе при 35–40% максималног капацитета . Тестови понашања су започети од 4 дана након операције као што је горе наведено (н=15).

У деветом експерименту, мишеви су насумично распоређени у (1) контролну групу, (2) операцијску групу, (3) операцију плус ГДНФ групу која је примила ГДНФ интрацеребровентрикуларном ињекцијом када су имали операцију, и (4) операцију плус топлотно инактивирани ГДНФ група која је примила топлотно инактивирани ГДНФ интрацеребровентрикуларном ињекцијом када су имали операцију. Хипокампи су сакупљени 48 х након операције за ЕЛИСА студију (н=12). После једне недеље аклиматизације, стари мишеви (18-месечни мужјаци Ц57БЛ/6 Јмишеви) тежине 30–36 г су коришћени у три студије. У првом експерименту, стари мишеви су насумично распоређени у (1) контролну групу, (2) групу за вежбање у којој су мишеви имали 4-недељну вежбу са 35–40% максималног капацитета, (3) групу за операцију и (4) Еке+Сур група у којој су мишеви имали 4-недељне вежбе са 35–40% максималног капацитета пре операције. Животиње су коришћене за учење и тестове памћења почевши 4 дана након операције (н=12) или су њихови мозгови сакупљени за биохемијске тестове 48 х након операције (н=10 или 12), за имунофлуоресцентно бојење 48 х и 19 дана након операције (н=6), и за Голгистанинг 19 дана након операције (н=8).

Крв и измет мишева из 4 групе су сакупљени за мерење СЦФА 7 дана након операције (н=7) и за 16 С анализе 3 и 7 дана након операције (н=8) или на крају од 4-недељног протокола вежбања или у одговарајуће време у прве 2 групе (н=16). Мишеви за прикупљање ткива били су различите кохорте које су коришћене за учење и тестове памћења. У другом експерименту, стари мишеви су насумично распоређени у (1) Транс-Олд Цонтрол+Сур групу и (2) Транс-Олд Еке+Сур групу. Ови мишеви су подвргнути операцији 14 дана након фекалне трансплантације као што је описано у други експеримент са младим одраслим мишевима. Учење и памћење су процењени 4 дана након операције (н =10).

У трећем експерименту, стари мишеви су насумично распоређени у (1) операцију плус НС групу; (2) група вежбе плус НС плус операција; и (3) вежба плус валеријанска киселина плус група операција. Ови мишеви су примили кондиционирање и валеринску киселину као што је описано у шестом експерименту са младим одраслим мишевима. Исходи понашања су тестирани почевши од 4 дана након операције (н=11). Горе описане величине узорка (н) представљају број животиња које су рандомизиране у сваку групу/стање. Ови бројеви животиња су били збир најмање 3 понављања сваког експеримента. Животиње су насумично распоређене у групе на основу компјутерски генерисаних табела рандомизације у сваком експерименту.

Одређивање максималног капацитета вежбања и вежбање

Пре операције, {{0}}недељни и 18-месечни мишеви су били изложени 4-недељној аеробној вежби на траци након одређивања максималног капацитета вежбања појединачних мишева. Ово одређивање је извршено на начин сличан онима описаним раније [47, 48]. Укратко, мишеви су аклиматизовани на траку за трчање првог дана са почетним подешавањима ударне мреже на 25 В, 0,3 мА и 2 Хз и брзином и нагибом на нули током 10 минута. Брзина траке за трчање је затим повећана на 10 цм/с са нагибом постављеним на 50 током 10 мин. Затим су брзина и нагиб траке за трчање повећани на 15 цм/песак 100 током 5 мин.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50% времена на мрежи; и/или (3) недостатак мотивације за ручно подстицање. Миш је одмах уклоњен из одговарајуће траке када се испуни један или више критеријума. Следећег дана, мишеви су трчали на истој траци за трчање половином просечне максималне брзине (35 цм/с код младих мишева или 30 цм/с код старих мишева) и 100 нагиба док поново нису достигли један од критеријума исцрпљености и трајање континуирано вежбање је забележено као максимални капацитет вежбања сваког миша. Након ова два протокола, мишеви су смештени одвојено 30 минута да би се избегло приметно агресивно понашање након вежбе.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >3% укупног времена у 3 узастопна дана би било искључено.

Групе које нису вежбале у истом скупу експеримената као и групе за вежбање стављане су на покретну траку за трчање дневно око 30-40 минута. Добили су 10 шокова у трајању од укупно 5 с, просечне количине шокова коју су мишеви у групи за вежбање примили сваког дана, током свог боравка на покретној траци за трчање. Ако скуп експеримената није имао групу за вежбање, ниједан мишеви у сету експеримената није добио шокове.

Лечење антибиотицима

Да би се олакшала колонизација трансплантиране микробиоте, мишевима примаоцима је даван антибиотски третман једном дневно током 7 узастопних дана како би се елиминисала њихова оригинална цревна микробиота како смо описали ми и други [11, 36]. Укратко, након пражњења са 10% магнезијум сулфата (200 ул/10 г, два пута у интервалима од 3 х) гагаважом првог дана, мишеви Ц57БЛ/6 Ј примали су амоксицилин/клавуланску киселину (200 мг/кг), метронидазол ( 200 мг/кг) и цефазолин (2 г/кг) путем желудачне сонде анденема (у 300 ул за желучану гаважу и 400 ул НС за клистир) ујутру једном дневно током 7 узастопних дана и амоксицилин/клавуланска киселина (20 мг/кг ), метронидазол (20 мг/кг) и цефазолин (300 мг/кг) у 200 ул НС дневно интраперитонеалном ињекцијом истих 7 дана (од 16 до 17 часова). Да би се спречила унакрсна бактеријска контаминација, руковање мишем и свакодневне промене кавеза и боца за воду обављали су техничари који су носили чисту хаљину и рукавице у вентилираној хауби. Измет са ових мишева је сакупљен 24 х након последњег третмана за 16 С анализе да би се одредио ефекат.

Трансплантација фекалија

Свеже фекалне пелете сакупљене у року од 30 минута након пражњења црева од контролног миша, мишева одмах након завршетка 4-недељне вежбе, или мишева 2 до 8 дана након операције су разблажене са 100 мг/мл стерилног физиолошког раствора. Све фекалне пелете од 7 -10 донора са сваким експерименталним стањем је помешано и поново суспендовано заједно у физиолошком раствору. Укратко, фекална материја је мешана вортексом током 5 минута, а затим је прошла кроз цедиљку за ћелије од 70 μм да би се уклонила несварена храна и честице. Прималац је примио 500 ул одговарајућег фекалног раствора гастроном гаважом ујутру и 600 ул клистиром поподне од 24 сата након последње дозе антибиотика током 7 узастопних дана. Трансплантирани мишеви су одржавани 2 недеље након фекалне трансплантације пре него што су подвргнути сакупљању фекалија за 16 С анализе и операцију.

Анестезија и хирургија

Операција је била изложена каротидној артерији као што смо описали раније [6]. Укратко, мишеви су анестезирани са 2% изофлурана и одржавани спонтано дисање са маском за лице снабдевена 100% кисеоника током процедуре. Ректална температура је праћена и одржавана на 37 степени уз помоћ грејног покривача. Рез на средини врата 2-цм и дисекција меког ткива са експозицијом заједничке артерије дужине 1-цм урађени су без икаквог оштећења вагусног нерва након што је миш анестезиран изофлураном у трајању од најмање 20 минута. Рана је затим иригирана и затворена хируршким шавом 4–0. Хируршка процедура је изведена у подстерилним условима и трајала је око 15 минута код младих мишева и 12 минута код старих мишева. Укупно трајање опште анестезије било је 2 сата. Након операције, све животиње су примиле субкутану ињекцију од 3 мг/кгбупивакаина. Није примећен одговор на штипање прстију током анестезије.

Интрацеребровентрикуларне ињекције

Као што је горе описано, неке групе мишева су примиле интрацеребровентрикуларну ињекцију. Укратко, ови мишеви су постављени у стереотактички оквир главе у лежећем положају. Место ињекције је лоцирано као: 1.00 мм медиолатерално, −0.3 мм антеропостериорно од Брегме и −2,5 мм дорсовентрална дубина. Мишеви у операцији плус ГДНФ група су добили интрацеребровентрикуларну ињекцију од 1{{ 20}} уг/кг рекомбинантног мишјег ГДНФ у 3 ул фосфатно пуферованог физиолошког раствора (ПБС) као што је описано у претходним студијама [6, 26], а мишеви у групи ГДНФ инактивирани плус топлотом добили су ињекцију топлотно денатурисаног (5 мин 1000Ц). ) ГДНФ решење. Мишеви у операцији плус група Ц3ар антагониста су примили 10 уг/кг СБ290157 у 3 ул ПБС који садржи 5% ДМСО у 0 х, 24 х, 48 х и 72 х након операције. Мишеви у вежби плус Ц3ар агонист и хируршка група примили су 1 уг/кг Ц3ар агониста у 3 ул ПБС који садржи 5% ДМСО у исто време као и за СБ290157. Мишеви у групи са валеринском киселином у шестом експерименту добијали су 4 мг/кг валеринске киселине у 4 µл током 4 узастопна дана.

Тестирање понашања

Учење и памћење су процењени помоћу препознавања нових објеката и Барнсовог теста лавиринта. Сви тестови понашања су спроведени у 10:00 ам−5:00пм у звучно изолованој просторији. Мишеви коришћени у тестовима учења и памћења нису коришћени за било какве биохемијске студије да би се избегли ефекти ових тестова.

Тест за препознавање нових објеката

Као што смо ми и други описали раније [20, 49, 50], мишеви су стављени у отворену комору на 5 минута ради навикавања 4 дана након операције. Тест је изведен на следећи начин. Два иста предмета су постављена под суседним угловима коморе на дан учења. Мишеви су стављени у комору са леђима окренутим према објектима и остављени су да слободно истражују комору 5 минута. Животиња је елиминисана ако је укупно време истраживања на два објекта било<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Барнес лавиринт

Седам дана након операције, животиње су биле подвргнуте Барнсовом лавиринту да би се тестирало њихово просторно учење и памћење као што смо претходно описали [6, 49]. Барнсов лавиринт је кружна платформа са 20 једнако распоређених рупа (СДИнструментс, Сан Диего, ЦА). Једна од рупа била је повезана са мрачном комором која се звала кутија за мете. Тест је започео постављањем животиња у средину Барнсовог лавиринта. Аверзивна бука (85 дБ) и јака светлост (200 В) на платформи су коришћени да подстакну мишеве да пронађу ову кутију. После тренинга од 4 дана, њихова референтна меморија је тестирана 5. и 12. дана. Ниједан тест није обављен током периода од 5. до 12. дана. Латенција за улазак у циљну кутију током сваког испитивања је забележена помоћу АНИМазе система за видео праћење (СД Инструментс).

For more information:1950477648nn@gmail.com