Слабљење експерименталног аутоимуног увеитиса код пацова Левис бетаином

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Експериментални аутоимуни увеитис (ЕАУ) је животињски модел људског аутоимуног увеитиса који се карактерише инфилтрацијом аутоимуних Т ћелија са истовременим повећањем проинфламаторних цитокина и реактивних врста кисеоника. Ова студија је имала за циљ да процени да ли бетаин регулише прогресију ЕАУ код Левис пацова. ЕАУ је индукована имунизацијом са интерфоторецепторским ретиноид-везујућим протеином (ИРБП) и оралном применом вехикулума или бетаина (100 мг/кг) током 9 узастопних дана. Слезине, крв и мрежњаче су узорковани од експерименталних пацова у време жртвовања и коришћени за тест пролиферације Т ћелија, серолошку анализу, ланчану реакцију полимеразе у реалном времену и имунохистохемију. Тест пролиферације Т ћелија је открио да бетаин има мали утицај на пролиферацију Т ћелија слезине против антигена ИРБП у ин витро тесту 9. дана након имунизације. Серолошка анализа је показала да се ниво серумске супероксид дисмутазе повећао у групи која је примала бетаин у поређењу са оним у групи која је примала вехикулум.екстракт цистанцхе тубулосаАнти-инфламаторни ефекат бетаина је потврђен смањењем молекула повезаних са запаљењем, укључујући молекул И адхезије васкуларних ћелија и интерлеукин-1 у мрежњачи пацова са ЕАУ. Хистопатолошки налази су се слагали са онима имунохистохемијског молекула адаптера 1 јонизујућег калцијума, додатно потврђујући да је запаљење у ретини и цилијарним телима значајно потиснуто у групи која је третирана бетаином у поређењу са групом која је третирана вехикулом. Резултати ове студије сугеришу да је бетаин укључен у ублажавање ЕАУ кроз антиоксидативне и антиинфламаторне активности.

Кликните овде да бисте сазнали више

Кључне речи:Анти-инфламација, Анти-оксидација, Бетаин, Експериментални аутоимуни увеитис, Ретина

Увод

Хоминг аутореактивних Т ћелија и инфилтрација инфламаторних ћелија, као што су моноцити, изазивају увеитис и ретинитис у ЕАУ [6]. Ретина је оштећена упалом уз активацију глијалних ћелија које су подвргнуте оксидативном стресу[7].

Бетаин, такође назван триметилглицин (ЦХ:НО:), је алкалоидна и нетоксична природна супстанца из Фруцтус Лициа, и репрезентативна антиоксидативна супстанца [8]. Бетаин побољшава запаљење везано за старење код пацова кроз укључивање нуклеарног фактора-кБ преко киназе/И капа Б киназе која индукује нуклеарни фактор и протеин киназе активираних митогеном [9], хумано кардиоваскуларно обољење сузбијањем инфламаторних цитокина, укључујући интерлеукин (ИЛ){{ 6}} и фактор некрозе тумора-а(ТНФ-а)[10], и туморигенеза дебелог црева изазвана декстран сулфатом натријумом [11].рецензије цистанцхе тубулоса,Поред тога, бетаин је спречио патолошку ангиогенезу/неоваскуларизацију код пацова са дијабетичким ретинитисом [12] и заштитио ганглијске ћелије ретине да би повећао оштрину вида у животињском моделу глаукома [13]. Међутим, мало је познато о прецизним механизмима који леже у основи ефеката бетаина код увеитиса.

У овој студији је процењена ефикасност бетаина у ослобађању ЕАУ. Истраживали смо антиинфламаторни ефекат бетаина у ЕАУ на основу хистопатолошког прегледа и мерења цитокина. Штавише, специфичан механизам бетаина као антиоксиданса је процењен код пацова са ЕАУ.

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Животиње

Оба пола Левис пацова (стари 7~9 недеља; Ориент Био Инц, Гиеонгги-до, Кореја) смештени су у нашем објекту у лабораторијским условима (12-х циклус светлости/мрака, температура 23±2 степена). Све експерименталне процедуре су спроведене у складу са Смерницама за негу и употребу лабораторијских животиња Националног универзитета Јеју (број дозволе: 2020-0012). Сви протоколи за животиње су у складу са међународним законима и политикама НИХ, укључујући Негу и употребу лабораторијских животиња (публикација НИХ бр.85-23, 1985, ревидирана 1996).

Индукција ЕАУ

Пацови су имунизовани са 200 ул мешане емулзије састављене од једнаке запремине говеђег интерфоторецепторског ретиноид-везујућег протеина (ИРБП) (И мг/мл; ПТАРСВГААДГСС-ВЕГВГВВПДВ, Комабиотецх, Сеул, Република Кореја) и Фројндовог комплетног адјуванса )допуњен са мном мг/мЛ Мицобацтериум туберцулосис Х37Ра (Дифцо Лабораториес Инц., Детроит, МИ, САД) на јастучићима њихових задњих удова.

Експерименталне групе

Да би се проценили ефекти бетаина (слика 1А) на ЕАУ, четири експерименталне групе су означене на следећи начин: нормална контролна (н=8); ЦФА контрола (н=8);ЕАУ плус Вехицле (н=8); и ЕАУ плус Бетаин(н=8). Доза у третману за тестирање терапеутског ефекта бетаина(1 0 мг/кг телесне тежине/дан, Б2629, Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) је изабран на основу претходне студије [14]. Пацови су орално третирани 9. бетаином од 0. дана после имунизације до 9. дана после имунизације.

Припрема ткива

Пацови су жртвовани под дубоком анестезијом инхалацијом ЦО2 гаса 9. дана након имунизације.цистанцхе УКТкива за хистопатолошки преглед су умотана у парафински восак и пресечена

са микротомом (РМ 2135; Леица, Нуслоцх, Немачка) до дебљине 5 ум и обојен хематоксилином и еозином. Крв и мрежњаче су чувани на -80 степену за анализу серума и анализу ланчане реакције полимеразе (ПЦР) у реалном времену.

Тест пролиферације Т ћелија

Мононуклеарне ћелије слезине животиња у свакој групи су дисоциране и суспендоване као што је описано у нашој претходној студији [15]. Затим је у отворе додато 10 уг/мл ИРБП (коначна концентрација). После 48 х стимулације са ИРБП, ћелије су инкубиране у 1 μЦи 'Х-метил тимидина (специфична активност 42 Ци/ммол); Амерсхам, Арлингтон Хеигхтс, ИЛ, САД) током 18 х. Затим су ћелије сакупљене да би се измерила инкорпорација тимидина.

Цистанцхе може против старења

Серолошка анализа

Пацови су жртвовани на дан узорковања, а крв је узета кроз срце. Узорци пуне крви су раздвојени на серум и крвна зрнца помоћу центрифуге (ВС-5500ЦФН; Висион Сциентифиц, Даејеон, Република Кореја). Активност супероксид дисмутазе (СОД) у серуму је процењена коришћењем СОД комплета (аб65354; Абцам, Цамбридге, УК).

Имунохистоцхемистри

Имунохистохемија је обављена коришћењем истог протокола који је описан у нашој претходној студији [16]. Примарна антитела укључујући јонизовани молекул адаптера који везује калцијум (Ибал)(1:1,000;019-19741, Вако Пуре Цхемицал Индустриес,Лтд,Осака, Јапан),ЦД68(ЕД1;1:800;МЦА341,Серотец,Кидлингтон,УК) и глутамин синтетаза(ГС)(1:5,000;МАБ302,Цхемицон Ин -тернатионал, Темецула, ЦА,УСА) коришћени су као маркери за микрог-лију, макрофаге и Муллер ћелије, респективно.

ПЦР у реалном времену

Укупна РНК у очним јабучицама у свим групама (н=5 по групи) је изолована са ТРИзол РНК реагенсом за изолацију (Лифе Тецхнологиес, ​​Тхермо Фисхер Сциентифиц, Царлсбад, ЦА, УСА), а цДНК је припремљена помоћу ЦеллСцрипт М Алл-ин -Један 5Кс први стандардни микс за синтезу цДНК (ЦеллСафе, Гиеонгги-до, Република Кореја). Информације о прајмеру су наведене у Табели 1. ПЦР је изведен са МИЦ циклусером (БМС, Куеенсланд, Аустралија) коришћењем 2к СИБР Греен (ФилеКореа, Сеул, Република Кореја) и следећег програма: 55 циклуса денатурације (5 с,95 степен), жарење (20 с, 60 степени) и продужење (10 с, 72 степена).

Вестерн блот анализа

Вестерн блот анализа је обављена по истом протоколу који је описан у нашој претходној студији [16].цистанцхе виркунгПримарна антитела укључујући протеин 1 повезан са Келцховим ЕЦХ (Кеап1)(1:1,000;абл19403,абцам,МА,УСА) и фактор 2 (Нрф2) повезан са нуклеарним фактором еритроида-2- )(1:1,000;сц-722, Санта Круз, Калифорнија, САД).

Статистичка анализа

Сва мерења су приказана као просек три независна експеримента. Све вредности су представљене као средња стандардна грешка средње вредности (СЕМ). Резултати су анализирани коришћењем једносмерне анализе варијансе праћене Студент-Невман-Кеулсовим постхоц тестом за вишеструка поређења. П-вредност<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

РЕЗУЛТАТИ

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 у односу на ЕАУ плус возило). Ови подаци указују на то да бетаин није био укључен са Т ћелијама специфичним за ИРБП или њиховом ауто-реактивношћу.

Бетаин је повећао нивое СОД у серуму у ЕАУ

Процењивали смо оксидативна оштећења у серуму, користећи СОД као маркер оксидативне модификације. Није примећена значајна разлика између нормалне и ЦФА групе. Активност СОД се значајно смањила у групи са ЕАУ плус Вехицле, у поређењу са нивоима у нормалној контролној и ЦФА групи. Третман бетаином је значајно вратио ниво активности СОД на ниво нормалне контролне и ЦФА групе (слика 2). Овај резултат указује да је третман бетаином потиснуо оксидативни стрес код пацова са ЕАУ.

Бетаин је смањио инфилтрацију Ибал-позитивних ћелија у цилијарним телима и ретинама пацова изазваних ЕАУ

Цилијарно тело је главно место инфилтрације инфламаторних ћелија због обиља крвних судова[18]. Само неколико ћелија округлог типа је откривено у цилијарним телима у нормалним и ЦФА групама (сл. 3А, 3Б), док је инфилтрација неких ћелија округлог типа потврђена у групама изазваним ЕАУ (стрелице на сл. 3Ц ,3Д). Нормалне (Слика 3Е) и ЦФА (Слика 3Ф) групе су доследно показивале сличне резултате као и оне примећене за Ибал имунореактивност. Ибал-позитивна имунореактивност се повећала у групама ЕАУ плус Вехицле и ЕАУ плус Бетаин (врхови стрелица на сл. 3Г, 3Х). Међутим, број Ибал-позитивних ћелија се значајно смањио у групи која је примала ЕАУ плус бетаин у поређењу са групом ЕАУ плус Вехицле (слика 3И). Такође смо анализирали локализацију ЕДИ као даљи приступ за процену прецизне локације инфилтрације инфламаторних ћелија у цилијарном телу. ЕД1-позитивне ћелије су ретко откривене у нормалном (Слика 3Г) и ЦФА (Слика 3К )групе. Насупрот томе, бројне ЕД1-позитивне ћелије су откривене у групама ЕАУ плус Вехицле и ЕАУ плус Бетаин (двоструке стрелице на сл. 3Л, 3М).биофлавоноиди цитрусаСеми-квантитативна анализа броја ЕД1-позитивних ћелија потврдила је да је третман бетаином потиснуо инфилтрацију инфламаторних ћелија у цилијарним телима пацова изазваних ЕАУ.

Затим смо истраживали хистопатолошке промене на ретини (слика 4). Неколико инфламаторних ћелија је откривено у мрежњачи са ЕАУ, али не у нормалним и ЦФА ретинама пацова (Слика 4А~4Д). Лезије су оцењене хистопатолошки према тежини ЕАУ [17], откривајући олакшање упале мрежњаче (Сл. 4Е). Активација микроглијалних и Милерових ћелија која указује на упалу мрежњаче потврђена је на основу глобалне (сл. 4Ф~4И) и ГС имунореактивности (сл.4К~4Н), респективно. Локализација Ибала у микроглији била је веома ретка у нормалној и ЦФА групи (врхови стрелица на сл. 4Ф, 4Г, респективно). Активација микроглије је инхибирана код ЕАУ пацова (врхови стрелица на сл. 4Х) третманом бетаином (сл. 4И, 4Ј). ГС-позитивни резултат имунореактивности био је сличан резултату глобалне ретине (Слика 4К~4Н). Активиране Милерове ћелије у групи ЕАУ плус Вехицле имале су ниже нивое ГС-имунореактивности (слика 40).

Бетаин супримирао адхезиони молекул и проинфламаторни медијатори у ЕАУ

Затим смо испитали експресију молекула адхезије користећи ПЦР у реалном времену (слика 5А). Уочено је нагло смањење нивоа молекула адхезије 1(ВЦАМ1)мРНК васкуларних ћелија у групи ЕАУ плус бетаин (п<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

Бетаин је појачао регулацију антиоксидативних ензима каталазе (ЦАТ) и СОДинЕАУ

Проучавање нивоа оксидативног оштећења у серуму нас је подстакло да истражимо статус антиоксидативног одговора антиоксидативних ензима, укључујући ЦАТ, СОД1, СОД2 и СОД3 (слика 5Ц). Приметили смо значајно повећане нивое експресије ЦАТ, СОД1, СОД2 и СОД3 у очним јабучицама групе ЕАУ плус бетаин у поређењу са групом ЕАУ плус Вехицле.

Бетаин је активирао Кеапл-Нрф2 пут

Да би се подржао антиоксидативни ефекат бетаина, испитиван је Кеапл-Нрф2 пут (слика 6). Нивои протеина Кеапл (0.75±0.05 пута промене, п<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

у поређењу са нормалном контролом. С друге стране, Кеапл и Нрф2 су показали или 1,46±0.00 промене пута или 1,13±0,34 пута промене у односу на оне из ЕАУ плус Вехиде групе (п<0.01 and=""><0.001,>

ДИСКУСИЈА

Ово је прва студија која извештава да бетаин ублажава прогресију патогенезе ЕАУ кроз антиинфламаторне и антиоксидативне ефекте, али не сузбијањем пролиферације Т ћелија (Шематска илустрација на Сл.7).

Сматра се да је регулаторни ефекат бетаина код аутоимуних болести, као што је доказано коришћењем ЕАУ, прототипа аутоимуне болести, последица смањења оксидативног стреса и проинфламаторних медијатора, али не и пролиферације Т ћелија, бетаином [19]. Слично томе, ова студија је открила да бетаин има мали утицај на пролиферацију Т ћелија и профил цитокина у супернатанту културе у моделу ЕАУ, што сугерише да бетаин не утиче на имуни одговор пролиферације аутоимуних Т ћелија у ЕАУ. Увеа је циљни орган у ЕАУ. Увеа и ретина су имунолошки изоловани органи без лимфе [20]. Аутоимуне Т ћелије у ЕАУ су нападнуте преко гране цилијарних и офталмолошких артерија [21]. Оксидативни стрес је критична сигнализација за напредовање инфламаторног одговора, а повећана реактивна врста кисеоника изазива ендотелну дисфункцију и повреду ткива [22]. Поремећене ендотелне ћелије доводе до промоције пролаза инфламаторних ћелија и инфламаторних молекула [22]. Инфламаторни медијатори и ћелије увее се покрећу у пигментним епителним ћелијама ретине, које ремете спојеве између ћелија штапића и конуса и пигментираних епителних ћелија, што доводи до одвајања мрежњаче [23]. Цилијарно тело је улазно место за упалу ока. Типично запаљење мрежњаче је укључено у активацију резидентне микроглије и инфилтрацију инфламаторних ћелија због разградње крвно-ретиналне баријере [24]. У неуропатолошким стањима, укључујући туморе мозга [25], аксотомију [26] и вирусну инфекцију [27], Ибал је разликовао активиране макрофаге и микроглије. Поред тога, активирана резидентна микроглија је укључена у патолошке промене које се јављају код дегенеративних обољења ретине и ослобађају инфламаторне медијаторе који погоршавају процес болести [28]. Ови резултати сугеришу да бетаин испољава антиинфламаторне ефекте у увеи и цилијарном телу, главним циљевима ЕАУ, и може да смањи оксидативни стрес у серуму. Међутим, прецизан механизам остаје да се проучи.

Активирана микроглија је главни извор проинфламаторних цитокина у дегенеративним стањима ретине [29]. Проинфламаторни цитокини, укључујући ИЛ и ТНФ, снажно су повезани са упалом ока [30] и ретинитисом [6,29]. Поред микроглије, Милерове ћелије се активирају под свим патолошким догађајима који се јављају у ретини [31]. Активиране Милерове ћелије су укључене у неуроинфламаторни ефекат у ретини тако што синтетишу и ослобађају молекуле повезане са упалом [31]. Претпостављамо да бетаин ублажава инфламаторни одговор код пацова изазваних ЕАУ тако што потискује активацију микроглије и Милерових ћелија. Повећана регулација ВЦАМл је у великој мери укључена у инфилтрацију инфламаторних ћелија [32]. ВЦАМл се убрзава до ЦД4 Тлим-фагоцита унакрсним разговором са касним антигеном-4[3]. Поред тога, Серпина3н, ензим који иницира запаљење [34], откривено је у Милеровим ћелијама, астроцитима и пигментном епителу мрежњаче светлошћу оштећених ретина [35] и има значајно променљиве нивое у мрежњачи Нрл'миша са оштећеним ћелијама конуса [36]. Серпина3н је повећан у ЕАУ пацови са тешком инфламацијом мрежњаче, али су се значајно смањили у ЕАУ групи третираној бетаином. Сличан налаз је пријављен за шизофренију са неуроинфламацијом [34], пошто је мишји Серпина3н ортолог хуманог Серпина3 [37]. Штавише, уочено је повећање ИЛ-1 код повреде мрежњаче изазване високом фруктозом [38]. Претпостављамо да је антиинфламаторни ефекат бетаина повезан са смањеном регулацијом ВЦАМ1, Серпина3н и ИЛ-1 код пацова изазваних ЕАУ. Кееп-Нрф2 пут се користи за праћење оксидативног стреса [39]. Бетаин је био познат као молекул антиоксиданса, који је био повезан са Кеапл-Нрф2 путем у моделу акутног оштећења јетре изазваног ацетаминофеном [40]. Поред тога, профилисање хепатичне експресије гена је урађено након третмана 3Х-1,2-дитиол-3-тионом, који има улогу да појача детоксикацију канцерогена и заштити од неоплазије [4]. Резултат овог профилисања је открио да Кеап1-Нрф2 регулише нрф2-зависни 3Х-1,2-дитиол-3- индуциран ген, укључујући АФ033381, као бетаин хомоцистеин метил трансфераза, повећана је и укључена у детоксикацију и антиоксидацију [41]. Инфламаторни одговор у ЕАУ индукован је инфилтрацијом инфламаторних ћелија, као што су Т ћелије и макрофаги [42], и производњом оксидативног стреса, посебно у митохондријама фоторецептора у раној фази [43]. Према овим резултатима, третман бетаином је био кандидат за ублажавање оштећења ткива изазваног ЕАУ модулацијом Кеап1-Нрф2 пута, као кључног пута за регулацију оксидативног стреса.

Антиоксидативни ефекат бетаина је широко процењен у моделима повреда изазваних радикалима [44]. У мозгу изазваном оксидативним оштећењем леводопом, бетаин је повећан до нивоа ЦАТ и СОД, који су репрезентативни антиоксидативни ензими[4]. СОД1, СОД2 и СОД3 се активирају различитим механизмима и локализовани су у цитоплазми, митохондријима и екстрацелуларном матриксу [45]. Бетаин, као антиоксидативни молекул, учествује у смањењу оксидативног оштећења [46]. Смањени оксидативни стрес је проширен на решавање упале, на шта указују Ибал-позитивни макрофаги/микроглија код многих болести, укључујући Алцхајмерову болест, Паркинсонову болест и мултиплу склерозу [47]. Третман бетаином је повећан на нивое мРНА маркера оксидативног стреса, у поређењу са онима у групи ЕАУ плус Вехицле. Овај резултат имплицира да је третман бетаином смањио оксидативни стрес у циркулаторном систему без ометања пролиферације Т ћелија у имуним органима ЕАУ модела пацова.

Заједно, ова студија сугерише да бетаин може ублажити запаљење у мрежњачима и цилијарним телима пацова изазваних ЕАУ, вероватно кроз антиоксидационе и антиинфламаторне механизме.

Овај чланак је преузет са хттпс://дои.орг/10.5607/ен21011