Везикули спољашње мембране бактерије изазивају транскрипциони помак у Арабидопсису ка активацији имуног система што доводи до супресије раста патогена у Планти

Апстрактан

Грам-негативне бактерије формирају сферичне мехуриће на периферији својих ћелија, које се касније одвајају од ћелијског зида бактерије и формирају екстрацелуларне везикуле. Показало се да ове структуре нано-размера, познате као везикуле спољашње мембране (ОМВ), промовишу инфекцију и болест и могу да изазову типичне имунолошке ефекте и код сисара и код биљака домаћина. Да бисмо боље разумели широку транскрипциону промену коју биљке пролазе након излагања ОМВ, третирали смо саднице Арабидопсис тхалиана (Арабидопсис) са ОМВс пречишћеним од грам-негативне биљне патогене бактерије Ксантхомонас цампестрис пв. цампестрис и извршили РНА-сек анализу на ОМВ и лажно третираним биљкама 2, 6 и 24 х након изазивања. Најизраженија транскрипциона промена десила се у прве две тестиране временске тачке, што се одражава у броју различито експримираних гена и просечној промени набора. ОМВ индукују велики транскрипциони помак ка активацији имуног система, регулишући мноштво путева повезаних са имунитетом, укључујући различите имуне рецепторе. Упоређујући одговор Арабидопсиса на ОМВ и пречишћене елициторе, откривено је да ОМВ индукују сличан скуп гена и путева као појединачни елицитатори, међутим, откривени су путеви које активирају ОМВ, а не други елицитори. Претходно третирање биљака Арабидопсис са ОМВ-има и накнадно њихово инфицирање бактеријским патогеном довело је до значајног смањења раста патогена. Мутације у рецептору фактора елонгације биљке (ЕФР), рецептору флагелина (ФЛС2) или ко-рецептору киназе повезане са брасиностероидима неосетљивом на брасиностероиде (БАК1) нису значајно утицале на имуни ефекат ОМВ-а. Заједно, ови резултати показују да ОМВ изазивају широку транскрипциону промену у Арабидопсису што доводи до регулације вишеструких имуних путева, и да ова промена транскрипције може олакшати отпорност на бактеријску инфекцију.

КЉУЧНЕ РЕЧИ

Арабидопсис тхалиана, бактеријска инфекција, екстрацелуларне везикуле, ОМВ, везикуле спољашње мембране, имунитет биљака, РНА-сек, Ксантхомонас цампестрис пв. цампестрис

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

1. ПРЕДСТАВЉАЊЕ

Биљке се стално суочавају са штетним микробима који напредују на њиховим ткивима и ометају нормалан раст. Ефикасан одбрамбени одговор у великој мери зависи од брзог и тачног откривања и идентификације инвазивног микроба. У ту сврху, биљке користе широке системе надзора за праћење инвазије патогена (Цоок ет ал., 2015). Нагађа се да је прва линија система за надзор биљке, или први ћелијски интерфејс где биљке и микроби интерагују, међућелијски простор, апопласт. Тамо је препознавање инвазивних микроба посредовано мембрански везаним, екстрацелуларно изложеним рецепторима за препознавање образаца (ПРР) (Боутрот & Зипфел, 2017; Цоуто & Зипфел, 2016). ПРР препознају микробне детерминанте које су широко присутне и очуване међу многим микробима и познате су као молекуларни обрасци повезани са микробом или патогеном (МАМП) (Ранф ет ал., 2016). Пошто микроби пролазе кроз мутагенезу великом брзином, еволутивно корисни имуни рецептори су прилагођени да открију високо очуване регионе кључних микробних компоненти које се не могу лако одбацити или мутирати због озбиљних трошкова фитнеса. На пример, бактеријски флагелин је кључни елемент у физиологији многих микроба, укључујући патогене, и тренутно је један од најбоље проучаваних МАМП (Фелик ет ал., 1999; Зипфел ет ал., 2004). Перцепција флагелина, или синтетичког епитопа флг22 (састоји се од високо конзервираних 22 аминокиселине на Н-крају грађевног блока флагелума, флагелина), од стране сродног биљног имунолошког рецептора флагелин сенсинг 2 (ФЛС2), доводи до велике транскрипционе промене , након чега следи ефикасан имуни одговор који зауставља инфекцију (Цхинцхилла ет ал., 2007; Гомез-Гомез & Боллер, 2000). Многи познати МАМП-ови повезани су са ћелијским зидом микроба. На пример, гљивични хитин (Фесел & Зуццаро, 2016), бактеријски пептидогликан (ПГ) (Ербс ет ал., 2008; Густ ет ал., 2007), бактеријски липополисахариди (ЛПС) (Дов ет ал., 2000; Силипо ет ал. ., 2005), флагелин (Боутрот & Зипфел, 2017; Фелик ет ал., 1999) и још много тога. Ипак, није сасвим јасно како ове компоненте повезане са ћелијским зидом реагују са својим сродним имунолошким рецепторима у плантажи. Да ли се то дешава услед ћелијске смрти и/или деградације ћелијског зида, или путем активног ослобађања компоненти као што је флагелум, тема је коју треба даље истражити (Бахар, 2020).

Пример активног ослобађања фрагмената ћелијског зида од стране грам-негативних бактерија је одвајање екстрацелуларних везикула (ЕВ) који се бледе и одвајају од спољашње мембране у околно окружење (Кулп & Куехн 2010; Тхери ет ал., 2018. ). Ови бактеријски ЕВ се обично називају везикули спољашње мембране (ОМВ), и од сада ћемо се придржавати ове номенклатуре (Сцхвецххеимер & Куехн, 2015). Процес ослобађања ОМВ одвија се континуирано и под различитим условима животне средине, укључујући и током колонизације домаћина (Гурунг ет ал., 2011; Ионесцу ет ал., 2014; Јин ет ал., 2011). Поред интегралних молекула спољне мембране као што су протеини спољне мембране (ОМ), ЛПС и липиди, ОМВ инкапсулирају периплазматске течности, које се састоје од разноврсног низа молекула као што су протеини, ензими за разградњу ћелијског зида, полисахариди и нуклеинске киселине (Ку Кести, 2005). Пошто се ОМВ ослобађају током колонизације домаћина, и пошто се њихов терет састоји од МАМП-ова, примамљиво је спекулисати да они делују као носиоци имуних елицитора који испоручују изазивајуће молекуле у непосредној близини њихових сродних имунолошких рецептора (Бахар, 2020; Катсир & Бахар, 2017). Заиста, показало се да ОМВ индукују и имуни систем сисара и биљака када се представе својим домаћинима (Бахар ет ал., 2016; Еллис & Куехн, 2010; Јанда ет ал., 2021; МцМиллан ет ал., 2021). Док у ћелијама сисара и ЛПС и протеинске компоненте ОМВ делују као имуни елицитори (Еллис ет ал., 2010), у биљкама још увек није јасно који су ОМВ молекули главни елицитатори имунитета.

Поред модулације имунолошког одговора домаћина, показало се да ОМВ носе факторе вируленције и да су укључени у мноштво процеса. Ово укључује ћелијску комуникацију (Деатхерагеа & Цооксона, 2012; Масхбурн & Вхителеи, 2005; Рапосо & Стахл, 2019), испоруку токсина циљним ћелијама (Еллис & Куехн, 2010; Кадуругамува & Беверидге, 1996), формирање биофилма (Сцхоофилм). & Беверидге, 2006), гашење антимикробних једињења (Маннинг & Куехн, 2011), одговор на стрес (МацДоналд & Куехн, 2013), хоризонтални трансфер гена (Фулсундар ет ал., 2014; Велимиров & Ранфтлер, 2018) и вируленција & Куехн, 2010; Кунсманн ет ал., 2015). Док већина ових примера потиче из студија о бактеријским патогенима сисара, недавне студије са биљним патогеним бактеријама такође подржавају да ОМВ промовишу вирулентност бактерија и колонизацију биљака. Јонеску и др. (Ионесцу ет ал., 2014) су показали да производња ОМВ биљног патогена Ксилелла фастидиоса током колонизације посуда ксилема инхибира везивање бактерија за елементе биљке које проводе воду (ксилем), нагињући равнотежу између сесилних и мобилних облика патоген према мобилном облику. Верује се да овај облик промовише дисперзију ћелија у ксилему, што доводи до бржег опадања биљке (Ионесцу ет ал., 2014). Две друге студије су показале да се фактори вируленције, као што су липаза/естераза и ксиланаза које се луче типа ИИ, и ефектори типа ИИИ, луче заједно са ОМВ (Цховдхури & Јаганнадхам, 2013; Сидху ет ал., 2008; Соле ет ал. ., 2015) што сугерише да ОМВ може имати важну улогу у вируленцији бактерија. Молекуларна сложеност ОМВ-а, заједно са његовим двоструким и евентуално супротстављеним функцијама у домаћину (изазивање имунитета и промовисање вируленције), подстиче нас да проучавамо шири транскрипциони одговор биљака Арабидопсис тхалиана (Арабидопсис) на изазов ОМВ-а и да тестирамо да ли ова транскрипциона промена би изазвало отпорност или подложност накнадној бактеријској инфекцији.

2. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ

2.1 Биљни материјал и услови раста

У овом истраживању коришћена је линија дивљег типа Арабидопсис тхалиана (Арабидопсис) Цол-0, као и следеће мутантне линије: бак- (Сцхлесингер ет ал., 2011) и Фаллс евер (Некрасов ет ал., 2009). Семе Арабидопсис је површински стерилисано и посејано на Мурасхиге и Скоог (МС) агар плоче као што је описано (Бахар ет ал., 2016). Плоче су држане у мраку на 4◦Ц током 2-4 дана, а затим су премештене на 22◦Ц ради клијања 5-8 дана. Проклијале саднице сличне величине пребачене су у 24- плоче (две саднице по бунарчићу) које садрже 1 мл МС медијума са 1% (в:в) сахарозе (Дуцхефа Биоцхемие) и узгајане још 8-10 дана на исти услови пре изазивања елицитором као што је описано у наставку. За прајмерске тестове, семе дивљег типа Арабидопсис Цол-0 линије и мутантне линије (опадају и назад-) су клијане као што је горе описано, а затим пресађене у саксије 7 × 7 × 6 цм (1 садница/лонац) које садрже мешавину соил Греен #7611 (Евенари, Ашдод, Израел) и узгајана у фотопериоду од 9,5 х на 22–24˚Ц. Биљке су биле

2.2 Пречишћавање везикула спољашње мембране бактерија

Залихе глицерола Ксантхомонас цампестрис пв. цампестрис(Ксцц) 33913 су исцртани на плочама са хранљивим агаром (Дифцо, НА, Бецтон, Дицкинсон и Цомпани) и узгајани 2–5 дана на 28˚Ц. Појединачне колоније су сакупљене и коришћене за инокулацију 3-мЛ ИЕБ (бујона екстракта квасца) стартера који садржи 10 уг/мл цефалексин хидрата (Цп, Сигма-Алдрицх). Стартери су узгајани преко ноћи на 28◦Ц уз мућкање на 185–200 обртаја у минути, а затим коришћени за инокулацију 500 мл ПСБ (пептон сахарозе) медијума са антибиотицима (као што је горе описано) у 2-л боцама у односу ∼1:1000 (в:в). Културе су узгајане као што је горе описано до ОД600 од 0,6–0,8, а затим су бактеријске ћелије центрифугиране и ОМВ су екстраховани из супернатанта као што је описано (Мордукховицх & Бахар, 2017). Сирови ОМВ препарат је затим подвргнут Оптипреп градијентном центрифугирању да би се добили пречишћени ОМВ, као што је описано (Бахар ет ал., 2016; Мордукховицх & Бахар, 2017). Свака серија ОМВ је пречишћена од 1.5-Л бактеријске културе и на крају је ресуспендована у 1 мл ПБС (пХ 7,3). Пречишћени ОМВ су коришћени одмах или чувани на 4◦Ц до 7 дана пре употребе. Расподела величине ОМВ-а је мерена коришћењем уређаја за динамичко расејање светлости (Зетасизер Нано ЗС, Малверн Паналитицал, Ворцестерсхире, УК) и имала је средњи пречник од 121,7 ± 55,43 нм (СД). Концентрација честица је на сличан начин измерена и дата је у опису сваког експеримента испод.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

2.3 Изазивање садница Арабидопсис са ОМВ

Да би се испитао транскрипциони одговор Арабидопсиса на ОМВ изазов, коришћене су саднице Цол-0 које су узгајане у 24-плочама са бунарима како је горе описано. Дан пре ОМВ изазова, МС медијум је извучен из плоча и замењен са 250 ул стерилног дХ2О, а плоче су остављене на клупи преко ноћи. Јутро након тога, 20 ул пречишћених ОМВ (30 уг по мл што одговара 1,44 × 109 честица по бунарчићу), или стерилног дХ2О као имитација, додато је у сваки бунар. Саднице су сакупљене 2, 6 и 24 х након изазивања, осушене на папиру и брзо замрзнуте течним азотом у 2-мЛ Еппендорф Сафе-Лоцк епруветама (Хамбург, Немачка). У свакој временској тачки, сакупљена су четири ОМВ-третирана и четири лажно третирана бунара, што представља четири биолошке реплике за сваки третман у свакој временској тачки.

2.4 Пречишћавање РНК

РНК је екстрахована из садница Арабидопсис помоћу ТРИзол реагенса (Инвитроген) према упутствима произвођача. РНК је даље пречишћена коришћењем Турбо комплета без ДНК (Амбион, Тхермо Фисхер Сциентифиц) и комплета за чишћење и концентрацију РНК (Норген Биотек) према упутствима произвођача. Пречишћени узорци РНК су подвргнути анализама концентрације и квалитета коришћењем машине ТапеСтатион 2200 (Агилент Тецхнологиес), траке за РНА екран и РНА екрана

2.5 Конструкција и секвенцирање РНК библиотеке

За сваки третман и временску тачку, за анализу су одабрана два узорка који показују највећу чистоћу. ТруСек мРНА библиотеке (Иллумина) са ПолиА хватањем припремљене су из одабраних узорака РНК на Цровн Институте оф Геномицс на Веизманн институту за науку (Реховот, Израел). Сваки узорак је обележен и од узорака је припремљена група. Овај скуп је затим учитан у две НГС траке и покренут у Иллумина ХиСек машини за секвенцирање, у режиму рада са високим излазом, једноструко читање (СР) 60 (в4).

2.6 Секвенцирање чита почетну обраду

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 Онтологије гена и описи гена 

Онтологије гена (ГО) су преузете коришћењем ТАИР-ових ГО анотација (хттп://ввв.арабидопсис.орг/тоолс/булк/го/индек.јсп). Описи гена, према моделима гена, добијени су коришћењем ТАИР-ове претраге описа гена (хттп://ввв.арабидопсис.орг/тоолс/булк/генес/). Обогаћивање ГО је израчунато коришћењем веб алата АгриГО (хттп://биоинфо.цау.еду.цн/агриГО/индек.пхп) користећи локус генома Арабидопсис (ТАИР10) као референцу

2.8 Квантитативна-ПЦР и РНА-сек валидација

За валидацију РНА-сек података, РНА узорци лажних и ОМВ-изазваних садница су коришћени за синтезу цДНК, а затим квантитативни ПЦР (кПЦР) коришћењем ген-специфичних прајмера (Супп. Табела С4), као што је описано (Бахар ет ал. , 2016). Све у свему, тестирано је 17 степени из РНА-сек скупа података, коришћењем четири биолошке реплике РНК ОМВ- или лажно третираних садница. Релативна експресија тестираних гена је упоређена са експресијом убиквитина, коришћењем 7500 Фаст ПЦР машине у реалном времену (Апплиед Биосистемс), како је описано (Бахар ет ал., 2016).

2.9 Поређење транскрипционог одговора Арабидопсис на МАМП и ОМВ 

Наш скуп података изазван ОМВ-ом упоређен је са доступним транскриптомима Арабидопсис изазваних са флг22, (Деноук ет ал., 2008) елф26 (Зипфел ет ал., 2006), ПГН (Виллманн ет ал., 2011), ОГ (Давидссон ет ал. , 2017) и ЛПС (Ливаја и сар., 2008). За поређење података, извршено је обогаћивање ГО термина и индуковани ГО су визуелизовани Веновим дијаграмима као што је горе описано.

2.10 Експерименти са прајмингом Арабидопсис

Да се ​​тестира ефекат прајминга Ксцц ОМВ на Арабидопсис инфициран са Псеудомонас сирингае пв. парадајз ДЦ3000 (Пст), пратили смо процедуру коју су описали Зипфел ет ал. (2004). Укратко, листови биљака Арабидопсис старих 6–8 недеља, узгајаних на горе описани начин, инфилтрирани су са 50–100 ул пречишћених Ксцц ОМВ (30 уг/мл, што одговара 3.6-7.2 × 109 честица по листу), 1 μМ флг22, или водом помоћу шприца без игле. За сваки третман коришћено је 5 листова по биљци и три реплика биљке. Пст инокулум је припремљен култивисањем бактерије на Кинг'с Б медијум плочама (20 г/Л пептона, 1,5 г/Л МгСО4 к7Х2О, 10 мл/Л глицерола и 15 г/Л агара) на 28˚Ц током 2–3 дана, а затим ресуспендовање колонија са водом и подешавање концентрације инокулума на 105 ЦФУ/мл. Пст инокулум је инфилтриран у прајмерисане листове 24 х након прајминга, користећи шприц без игле (приближно 100 ул је инфилтрирано у сваки лист). Раст бактерија је одређен на 0 (1 х након инокулације) и 2 дана након инокулације (дпи) прикупљањем и вагањем инокулисаних листова, мацерацијом у 1 мл 10 мМ МгЦл2 и наношењем 10- пута серијских разблажења на Кинг'с Б агар плоче. Број ЦФУ на свакој плочи је одређен 2 дана касније и израчунат по г листа.

СЛИКА 1 Транскрипциони одговор Арабидопсис на ОМВ на 2, 6 и 24 после изазивања. Анализа главних компоненти (А) и матрица корелације узорака (Б) транскрипционог одговора садница Арабидопсис на ОМВ, или лажна, 2, 6 и 24 х након изазивања

2.11 Ин витро тестови раста бактерија 

Да би се проценио ефекат пречишћених Ксцц ОМВ на раст Пст ин витро, Пстстартери су узгајани у Кинг'с Б течном медијуму 24 х на 28˚Ц, а затим коришћени за инокулацију три различите културе које садрже по 12 мл Кинговог Б медијума, у {{3 }}мЛ Фалцон епрувете у односу 1:100. Бактеријске културе су допуњене са 30 уг/мл ОМВ (1:50 или 1:100, што одговара 1,44 × 109 или 7,2 × 108 честица по мл, респективно), или ПБС као контрола, и инкубиране 20 х на 28˚Ц. Раст бактерија је мерен спектрофотометром (Амерсхам Биосциенцес) при оптичкој густини (ОД) од 600 нм током 22 х.

3 РЕЗУЛТАТА

3.1 РНА-сек анализа открива велики скуп гена Арабидопсис различито експримираних као одговор на ОМВ изазов

Да бисмо проучили транскрипциону промену код Арабидопсиса након изазивања ОМВ-а, третирали смо саднице Арабидопсис са ОМВс пречишћеним од бактеријског патогена Ксантхомонас цампестрис пв. цампестрис 33913 (Ксцц) и сакупила биљну РНК 2, 6 и 24 х након изазивања (хпц). РНК из ОМВ- и лажно третираних узорака је затим секвенционирана и анализирана као што је описано у Материјалима и методама. Анализа главне корелације (Слика 1А) и матрице корелације узорака (Слика 1Б) показују да се биолошке репликације у свакој групи третмана блиско заједно, што указује на свеукупну сличност транскрипционог одговора између биолошких реплика. ОМВ је третирао узорке у групи од 2 и 6 хпц заједно, што указује да је ОМВ третман имао већи ефекат на транскрипциони одговор од времена узорковања (Слика 1Б). С друге стране, узорци третирани ОМВ-ом се групишу заједно са њиховим одговарајућим лажним третманом на 24 хпц, што указује да се транскрипциона промена изазвана ОМВ-ом у овом тренутку смањила и била је слична оној код лажно третираних биљака.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

У свакој тестираној временској тачки, саднице третиране ОМВ су упоређене са лажно третираним садницама и екстраховани су различито експримирани гени (ДЕГ). У свим временским тачкама заједно, откривено је да су укупно 984 и 175 гена значајно (промена лог пута > 1 или ← 1, п вредност и ФДР < 0.05) регулисани навише или наниже, респективно, као одговор на ОМВ изазов (Слика 2А; Супп. Табела С1). Експресија гена Лог фолд-цханге (ЛогФЦ) кретао се од максимално 9,08 (АТ1Г26410, 6 хпц), што одговара преко 500-промени пута, до -5,73 (АТ3Г17520, 24 хпц). Највећи број ДЕГ је пронађен на 2 и 6 хпц, где је идентификовано укупно 647 и 876 ДЕГ (комбиновано регулисано нагоре и наниже). На 24 хпц, пронађено је 121 ДЕГ. Више од 50% гена са повећаном регулацијом 2 и 6 х након изазивања ОМВ-а подељено је између њих (Слика 2Б). Да бисмо испитали промену временске експресије гена, извукли смо све ДЕГ-ове који су регулисани навише који су пронађени у свим временским тачкама (37 гена) и упоредили њихову промену током времена (слика 2Ц). Експресија промене набора ових гена била је значајно различита у различитим временским тачкама (једносмерна АНОВА; Ф2,108=8.1633, п=0.0005). Пост хоц поређење коришћењем Тукеи Крамер ХСД теста показало је да је ЛогФЦ на 2 (М=3.45, СД=1.72) и 6 хпц (М=3.87, СД=1.98) је била знатно већа него на 24 хпц (М=2.32, СД=1.31) (п=0.0145 и п=0 .0005, респективно) (Слика 2Д). Док је средња ЛогФЦ експресија при 6 хпц била већа него при 2 хпц, није се статистички разликовала (п=0.5413). Дакле, када се узме у обзир број ДЕГ-ова и укупни ген ЛогФЦ у три тестиране временске тачке, можемо закључити да се најзначајнија транскрипциона промена догодила 2 и 6 х након ОМВ изазова. Да би се испитала валидност резултата РНА-сек, експресија 17 гена са регулацијом навише је одређена коришћењем квантитативне ПЦР (кПЦР) са специфичним прајмерима. Четрнаест тестираних гена је показало исти образац као у РНА-сек анализи и били су значајно повећани у поређењу са лажним. Три од тестираних гена су имала већу релативну експресију, али се нису значајно разликовала од моцк овом методом (Супп. Слика С1).

СЛИКА 2 Гени Арабидопсис су различито експримирани као одговор на ОМВ изазов. (А) Укупан број диференцијално експримираних гена (ДЕГ) (регулисан навише или наниже, ЛогФЦ > 1 или ← 1, п-вредност и ФДР < 0.05) на 2, 6 и 24 х после изазова. (Б) Преклапање између ДЕГ-ова у различитим временским тачкама (лево, регулисано нагоре; десно, регулисано надоле). (Ц) Навише регулисани гени пронађени у свим тровременим тачкама су уцртани на граф експресије ЛогФЦ, показујући експресију гена током времена. (Д) ЛогФЦ просек свих ДЕГ у различитим временским тачкама. Различита слова показују статистичку разлику на п < 0,05 према Тукеи-Крамер ХСД тесту

3.2 Арабидопсис реагује на ОМВ транскрипционим помаком ка активацији имуног система

Да бисмо идентификовали путеве Арабидопсис на које значајно утиче ОМВ изазов, користили смо АгриГО веб алат (Ду ет ал., 2010; Тиан ет ал., 2017). Идентификовали смо 333 и 55 значајно (ФДР < 0,05) термине онтологије гена са регулацијом навише и наниже (ГО), респективно, у свим временским тачкама комбинованим као одговор на ОМВ изазов. Скоро 25% горе регулисаних ГО је било повезано са одговором биљке на стимуланс (Слика 3А). Унутар категорије „одговор на стимулус“, најдоминантнији термини ГО били су повезани са одговором на стрес, на биотички стимулус, хемикалије и ендогени стимулус (Слика 3Б; Супп. Табела С2). АгриГО алат је такође идентификовао 103 значајно појачано регулисане молекуларне функције укључујући „активност трансферазе“, активност киназе, „активност фактора транскрипције“, „везивање јона и металних јона“, „везивање за угљене хидрате“, „везивање за протеине“, „каталитичку активност“ , 'Везивање аденил нуклеотида', 'активност трансмембранског рецептора' и више функција везивања (Супп. Табела С2). Ћелијска локација значајних појмова била је у различитим одељцима ћелије укључујући језгро, вакуолу и ендомембрански систем, али је најистакнутије била повезана са ћелијском периферијом и укључивала „плазма мембрану“, „екстрацелуларни регион“, „ћелијски зид“ и 'апопласт' онтологије (Супп. Табела С2). С друге стране, значајно смањени ГО су укључивали термине 'катаболички и метаболички процес токсина', 'одговор на недостатак воде и воде', 'транспорт и локализација липида' и друге (Супп. Табела С2). ГО који се односе на одговор на биотички стимулус нису били обогаћени генима са смањеном регулацијом. Значајно смањене молекуларне функције укључивале су многе редокс термине као што су 'активност оксидоредуктазе', 'везивање хема', 'везивање гвожђених јона', 'везивање липида', 'везивање кисеоника' и више функција везаних за кисеоник (Супп. Табела С2) . Термини регулисани надоле су се такође налазили у ванћелијском региону. Да бисмо утврдили којим ГО терминима припадају ДЕГ са највећом експресијом, филтрирали смо оригиналну ДЕГ листу одабиром гена који су имали ЛогФЦ већи од 4, или мањи од -4 (што одговара 16- пута разлици) . Идентификовали смо 117 гена који су испуњавали ове критеријуме, од којих је 115 било регулисано навише, а 2 наниже у свим временским тачкама заједно. Због малог броја наниже регулисаних гена са ЛогФЦ мањим од -4, нису идентификовани значајно потиснути ГО. С друге стране, идентификована су 72 ГО са значајно повећаном регулацијом, од којих се најзначајнији односе на 'одговор на спољашњи биотички стимуланс', 'одговор на друге организме', 'ћелијски одговор на ниво кисеоника', 'одбрамбени одговор' , 'одговор на стрес' и ГО који су повезани са имунитетом (Слика 3Ц).

СЛИКА 3 Термини онтологије гена Арабидопсис (ГО) обогаћени као одговор на Ксцц ОМВ изазов. Кружни графикон представља дистрибуцију категорија у терминима ГО регулисаних биолошких процеса (А) и одговора на стимуланс (Б). (Ц) Листа гена Арабидопсис са ЛогФЦ од > 4 као одговор на ОМВ изазов. Гени су филтрирани из комплетног скупа података ДЕГ-а и коришћени за идентификацију обогаћених ГО термина помоћу АгриГо веб алата. ФДР цутофф < 0.05

3.2 ОМВ изазов је довео до појачане регулације имунолошких рецептора

Сензирање МАМП-а и одговор биљке на МАМП су у великој мери посредовани ПРР-овима везаним за мембрану који посредују у перцепцији патогена и ефикасном ублажавању инфекције. ПРР се обично класификују у две групе рецепторских киназа (РКс) и протеина сличних рецепторима (РЛП) (Боутрот & Зипфел, 2017). Да бисмо идентификовали ПРР који су различито изражени као одговор на ОМВ, упоредили смо наш ДЕГ сет са претходно утврђеним листама РК Арабидопсис (Кеммерлинг ет ал., 2011; Мотт ет ал., 2016) и РЛП (Ванг ет ал., 2008). Идентификовали смо у нашем скупу података 33 и 10 РК-а и РЛП-ова са регулацијом навише, у свим временским тачкама заједно (табела 1). На нашој листи од 175 смањених гена нису пронађени РК или РЛП. Кеммерлинг ет ал. (2011) дефинисао је листу од 49 РК-а, чију експресију су значајно индуковали МАМП-ови као што су флг22 и НЛП (протеин сличан пептиду који индукује некрозу и етилен 1-) или третманом патогена. Упоредили смо ову листу са вишим регулисаним РЛК-овима из нашег експеримента и открили да је 45% РК-а дефинисаних од стране Кеммерлинг ет ал. (2011) такође су индуковани као одговор на ОМВ. Међу њима су вредни пажње ФРК1, СОБИР1, СЕРК4, РЛК/ИКУ2, ПСКР1, ХАЕСА, ЕФР, БИР и ИОС1 (Табела 1). Међу РК групом, ФРК1 је имао највећу експресију на 2 и 6 хпц са ЛогФЦ од 7,11 и 5,2, респективно, док је просечан ЛогФЦ свих РК био 2,11 и 2,13 при 2 и 6 хпц, респективно. Док РК-ови и РЛП-ови везани за мембрану углавном посредују у екстрацелуларном сенсингу инвазијских микроба, рецептори за понављање (ЛРР) богати леуцином (ЛРР) су интрацелуларни имуни рецептори. Пронашли смо 7 различитих НЛР гена који су регулисани као одговор на ОМВ-изазов на 2 и 6 хпц, ниједан није пронађен на 24 хпц (НЛР листа је екстрахована из ТАИР-а, 102 гена) (Табела 1).

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

3.3 ОМВ индукују експресију вишеструких ВРКИ транскрипционих фактора

Утврђено је да ВРКИ фактори транскрипције (ТФ) играју улогу у имунолошким одговорима биљака, учествујући у одговорима имунитета изазваног МАМП-ом (МТИ) и одговорима имунитета изазваног ефекторима (ЕТИ) (Биркенбихл ет ал., 2018; Русхтон ет ал., 2010. ). ОМВ изазов је довео до повећања регулације 20 различитих ВРКИ ТФ-ова (листа екстрахована из ТАИР-а, 70 гена) само при 2 и 6 ХПЦ (табела 1). ВРКИ ТФ-ови су били одсутни из нашег скупа гена који је наниже регулисан. Друга породица ТФ-ова на које утиче ОМВ изазов су протеини који садрже МИБ домен (Тсуда & Сомссицх, 2015), за које се зна да су укључени у више процеса укључујући биотички и абиотички стрес (Амбават ет ал., 2013). Све у свему, 9 различитих МИБ ТФ-ова (листа екстрахована из ТАИР-а, 211 гена) је различито експримирано као одговор на ОМВ изазов, 5 навише и 4 на ниже (Табела 1). Додатне класе диференцијално експримираних ТФ које су откривене су наведене у табели 1.

3.4 Поређење транскрипционог одговора Арабидопсис на ОМВ са одговором на пречишћени МАМП

Да бисмо сазнали о разликама у одговору Арабидопсис на пречишћени елицитор у односу на грубу и молекуларно сложену структуру - ОМВ, упоредили смо наше РНА-сек податке са постојећим транскриптомским подацима о одговору Арабидопсис на познате МАМП, укључујући флг22, (Деноук ет ал., 2008) елф26 (Зипфел ет ал., 2006), ПГН (Виллманн ет ал., 2011), ОГс (Давидссон ет ал., 2017) и ЛПС (Ливаја ет ал., 2008). Обогаћени ГО су екстраховани из горе наведених скупова података као што је горе описано (Супп. Табела С3) и упоређени са ГО обогаћеним након ОМВ изазова. Генерално, термини Арабидопсис ГО изазвани ОМВ-има били су слични онима индукованим појединачним, протеинским и непротеинским МАМП-овима, деле 56, 51 и 47% ГО-индукованих ОМВ-ом са ГО-овима изазваним флг22, елф26 и ПГН, респективно. С друге стране, уочено је ниже преклапање индукованих ГО код ЛПС и ОГ, које деле 24 и 33%, респективно, са ОМВ индукованим ГО (слика 4А). Значајно је да ген 1 (ПР1) повезан са патогенезом (Ат2г14610), обележје имуног одговора изазваног ЛПС-ом (Силипо ет ал., 2005, 2008), био је одсутан са листе гена изазваних ОМВ-ом у свим тестираним временским тачкама. Утврђено је да је 41 ГО изазван ОМВ-ом, а не било којим другим МАМП-ом који је овде тестиран (слика 4Б). Ова листа је укључивала ГО повезане са 'апоптозом', 'одговором на лек', 'транспортом лека и 'транспортом више лекова' и 'активношћу липазе' (Супп. Табела С3, означена звездицама и подебљаним фонтом).

3.5 ОМВ изазивају отпорност Арабидопсис на бактеријску инфекцију

Овде и раније (Бахар ет ал., 2016), пружили смо доказе који показују да је имуни систем Арабидопсис изазван ОМВ изазовом. Да бисмо испитали да ли је ова имунолошка индукција посредована ОМВ-ом преведена у ефикасан имуни одговор, користили смо тест раста бактерија планта (Зипфел ет ал., 2004) у којем су биљке Арабидопсис претходно третиране ОМВ-има након чега је уследила инокулација бактеријама. Значајно смањење више од 10-пута код Псеудомонас сирингае пв. парадајз ДЦ3000 (Пст) ЦФУ/г лист је примећен у биљкама претходно третираним ОМВ и флг22-у поређењу са лажним претходним третманом, два дана након инокулације (Слика 5А). На раст Пст ин витро није негативно утицало додавање ОМВ у медијум, што сугерише да је смањени раст Пст у плантажи повезан са ефектом прајминга ОМВ-а и није директан ефекат ОМВ-а на бактерије (Супп. Слика С2). Да бисмо тестирали да ли је ОМВ-индукована отпорност на Пст посредована ФЛС2, ЕФР или БАК1, поновили смо овај експеримент са Цол-0, бакмутантом, а линија двоструког мутанта пада ефр. Са обе мутантне линије, ОМВ предтретман је резултирао значајним смањењем Пст ЦФУ/г листа у поређењу са лажно третираним биљкама (Слика 5Б-Ц). Као што се и очекивало, флс ефр и бакмутантне линије третиране са флг22 имале су сличне титре Пст као нетретиране биљке јер је познато да не реагују на флг22. Да бисмо упоредили релативно смањење титра патогена у Цол-0 у односу на мутантне линије имуних рецептора које стално опадају и бак у грундираним биљкама, израчунали смо разлику у титру Пст код биљака третираних ОМВ и лажно третираних у три независна експеримента (Супп Слика С3). Просечно смањење Пст титра у задњим биљкама претходно третираним ОМВ било је мање од оног уоченог у Цол-0 биљкама (0,89 наспрам 1,14 Лог ЦФУ/гр смањења листова за бак и Цол-0, респективно, један- начин АНОВА; Ф2,4=4.3781, п=0.0523). Нисмо видели слично смањење код флс ефр мутантне линије (1,26 према 1,32 Лог ЦФУ редукције за флс ефр и Цол{41}}, респективно, једносмерна АНОВА: Ф1,4=0.0352, п=0.5698) (Слика 5Д-Е).

ТАБЕЛА 1 РКс/РЛП изазвани ОМВ-ом и фактори транскрипције у вези са имунитетом у садницама Арабидопсис

ТАБЕЛА 1 (Наставак)

ТАБЕЛА 1 (Наставак)

4. ДИСКУСИЈА

Везикуле спољашње мембране бактерија (ОМВ) су сложене наноструктуре које потичу од спољашње мембране бактерије и састоје се од стотина протеина и других компоненти ћелијског зида. Раније је показано да биљке Арабидопсис реагују на ОМВ изазов активирањем типичних имунолошких одговора као што су РОС бурст, експресија гена имунолошких маркера и алкализација медија (Бахар ет ал., 2016). У овој студији смо испитали шири транскрипциони одговор Арабидопсиса на бактеријске ОМВ и његов ефекат на каснију инфекцију. Свеобухватни закључак из РНА-сек анализа података извршених у овој студији је да је имуни систем Арабидопсис припремљен након излагања Ксантхомонас цампестрис пв.цампестрис (Ксцц) ОМВ. Овај закључак поткрепљују различите и комплементарне анализе. Прво, обогаћивање онтологије гена (ГО) у биљкама изложеним Ксцц ОМВ јасно показује да Арабидопсис перципира ОМВ као стресоре. Ћелијска локација одговора биљке била је повезана првенствено са ћелијском периферијом што сугерише спољашњу ћелијску перцепцију изазовног материјала, ОМВ-а. Ово пружа даљу подршку идеји да ОМВ и њихове састојке осећају екстрацелуларни рецептори, слично многим познатим МАМП-овима. Друго, приметили смо да је велики скуп РК-ова и РЛП-ова побољшан као одговор на изазов ОМВ-а. Познато је да многи од ових рецептора посредују у перцепцији патогена или је раније показано да су повезани са имунолошким одговором биљака. ФЛГ22-индукована рецептор-слична киназа 1 (ФРК1) била је најјаче индуковани рецептор. Ово је занимљиво јер нисмо могли да откријемо флагелин у нашој Ксцц ОМВ протеомичкој анализи (подаци нису приказани). Познато је да је ФРК1 такође индукован другим имуним елициторима, али је интригантно зашто је његова експресија толико већа од остатка РК-а који су овде регулисани навише. Експресија рецептора фактора елонгације (ЕФР) је, с друге стране, била значајно повећана само у временској тачки од 2 сата и имала је ЛогФЦ од 1,12, иако се ЕФ-Ту налази у Ксцц ОМВ (Бахар ет ал., 2016. ). Такође смо пронашли неколико НЛР гена који су регулисани као одговор на ОМВ изазов, од којих је половина означена као протеини отпорности на болести, али њихова функција у имунитету биљака није описана. Иако не претпостављамо да су НЛР директно укључени у перцепцију ОМВ-а, они би могли бити индуковани низводно од РК/РЛП-а који детектују ОМВ молекуле, што је такође примећено као одговор на пречишћене МАМП-ове као што су флг22, елф18 и ЛПС (Деноук ет ал., 2008. ; Ливаја и сар., 2008; Зипфел и сар., 2006). Треће, многи фактори транскрипције везани за имунолошки систем, ВРКИ, МИБ и други, значајно су повећани од стране ОМВ-а (Бјорнсон ет ал., 2021). У нашој студији, главна промена транскрипције као одговор на ОМВ десила се у прве две временске тачке (2 и 6 хпц). Ово је илустровано и значајно већим бројем диференцијално експримираних гена (ДЕГ) и значајно вишим Лог фолдцханге (ЛогФЦ) при 2 и 6 хпц. Ипак, од укупно 121 ДЕГ пронађених на 24 хпц, скоро половина (52) није пронађена на 2 или 6 хпц. Ово сугерише да су половина ДЕГ-ова на 24 хпц касно регулисани гени, чија је експресија била регулисана навише или наниже касније од 6 хпц. Заиста, раније су идентификовани гени Арабидопсис са различитом динамиком експресије након изазова елицитора (Бјорнсон ет ал., 2021).

СЛИКА 4 Поређење појмова обогаћене генске онтологије (ГО) као одговор на ОМВ и на појединачне пречишћене МАМП. Скупови података о експресији Арабидопсис као одговор на МАМП изазов (елф26, флг22, ОГс, ПГН и ЛПС; погледајте одељак Материјали и методе за референце) коришћени су за екстракцију обогаћених ГО помоћу веб алата АгриГо. Обогаћени ГО сетови сваког МАМП-а упоређени су са обогаћеном ГО листом као одговор на ОМВ коришћењем Веннија (А и Супп. Табела С3). ГО термини обогаћени само у ОМВ скуповима података приказани су у (Б) сортирани по њиховој ФДР вредности.

У нашој студији, главна промена транскрипције као одговор на ОМВ десила се у прве две временске тачке (2 и 6 хпц). Ово је илустровано и значајно већим бројем диференцијално експримираних гена (ДЕГ) и значајно већом променом Лог фолд (ЛогФЦ) при 2 и 6 хпц. Ипак, од укупно 121 ДЕГ пронађених на 24 хпц, скоро половина (52) није пронађена на 2 или 6 хпц. Ово сугерише да су половина ДЕГ-ова на 24 хпц касно регулисани гени, чија је експресија била регулисана навише или наниже касније од 6 хпц. Заиста, раније су идентификовани гени Арабидопсис са различитом динамиком експресије након изазова елицитора (Бјорнсон ет ал., 2021). Брзи и углавном пролазни образац експресије гена који смо овде видели је у складу са другим студијама које су тестирале временски одговор Арабидопсиса на МАМП. На пример, Деноук ет ал. (2008) и Бјорнсон ет ал. (2021) су показали да се транскрипциона промена код Арабидопсис-а као одговор на различите МАМП дешава у року од неколико минута до сати, а у већини случајева, ДЕГ се враћају на основне нивое ∼ у року од 24 х након изазивања биљке. За разлику од интеракција између биљке и патогена, где је интеракција динамична и стална када се изазове са неживим узорком, као што је пречишћени МАМП или са ОМВ- може се очекивати да ће одговор биљке, барем на нивоу транскрипције, било би пролазно и не би се одржавало данима. Интензивно истраживање у последње три деценије открило је више биљних имуних рецептора одговорних за препознавање микроба. Многи од ових рецептора имају капацитет да открију појединачне микробне карактеристике и детаљно се проучавају како би се боље разумела перцепција патогена, сигнализација имунолошког система и одговор модела и усева. Међутим, биљке су истовремено изложене вишеструким микробним карактеристикама из различитих извора, што додаје сложеност имунолошкој перцепцији и одговору. Били смо заинтересовани да испитамо разлике у транскрипционом одговору Арабидопсиса на сингуларне пречишћене МАМП у односу на ОМВ, који представљају природнију и сложенију микробну структуру, али степен сложености уклоњен од самог микроба. ОМВ носе факторе вируленције, деградативне ензиме, токсине и друге биомолекуле који би могли имати функционалну улогу за раст бактерија у плантажи, и стога је било интересантно тестирати да ли изазов ОМВ индукује јединствене ГО које нису индуковани синтетичким МАМП.

СЛИКА 5 ​​Претходно третирање листова Арабидопсис са ОМВ изазива отпорност на накнадну бактеријску инфекцију. Биљке Цол-0 (А) су претходно третиране са ОМВ, водом (моцк) или флг22 као контролама, и 24 х касније инокулисане са 105 ЦФУ/мл суспензије Пст ДЦ3000 коришћењем инфилтрације шприцем без игле . Титар Пст ДЦ3000 ћелија у инокулисаним листовима одређен је 48 х након инокулације серијским разблаженим плочама. Биљке Арабидопсис Цол-0 и флс ефр (Б), или бак (Ц) су тестиране у сличном експерименту као што је описано у (А). Упоређено је средње смањење Лог Пст ДЦ3000 ЦФУ/гр након претходног третмана ОМВ-ом (у поређењу са нетретираним биљкама) у Цол-0 и пада ефр (Д), и Цол-0 и назад (Е). Свака трака представља средњу вредност смањења Лог Пст ДЦ3000 ЦФУ/гр из три независна експеримента (подаци независних експеримената су представљени у Супп. Фиг. С3). Разлике нису биле статистички значајне (Т-тест ученика два репа. п вредности су назначене изнад трака графикона). Експерименти А, Б и Ц су спроведени најмање три пута са сличним резултатима (3 биљке/репликације по третману у сваком експерименту). Звездице (**) означавају значајну разлику у поређењу са лажним (Данетов тест п < 0,001)

За наша транскриптомска поређења прикупили смо податке из студија са сличним експерименталним условима, тј. у биљкама иу сличним временским тачкама. Значајно преклапање у обогаћивању ГО примећено је у одговору Арабидопсис на ОМВ и на флг22, елф26 и ПГН. Ово није неочекивано јер је познато да су многи одбрамбени путеви који се активирају након откривања патогена слични, без обзира на специфичан елицитор или његов извор (Бјорнсон ет ал., 2021; Зипфел ет ал., 2006). Ипак, утврђено је да су неке јединствене ГО регулисане од стране ОМВ-а, а не од других МАМП-а које смо испитали. Међу њима су ГО који се односе на деградацију ћелијског зида као што су 'активност липазе' и 'активност хидролазе која делује на гликозилне везе', што може указивати на то да одбрамбени систем биљке циља на деградацију ОМВ-а. Занимљиво је да су три ГО у вези са транспортом дроге такође била јединствено регулисана изазовом ОМВ-а. Ово може указивати на то да су биљке суочене са токсичним једињењима која се испоручују у њихове ћелије, можда испоруком посредованом ОМВ-ом. За разлику од Арабидопсисовог одговора на пептиде који изазивају имунитет и ПГН, приметили смо релативно мало преклапања између Арабидопсисовог одговора на ОМВс ОГс и ЛПС. Ово мало преклапање, посебно са ЛПС, донекле је изненађујуће, с обзиром на то да је у ћелијама сисара ЛПС добро познат као моћан допринос имунолошком одговору домаћина изазваном ОМВ (Еллис ет ал., 2010). Штавише, чињеница да нисмо могли да пронађемо повећање регулације ЛПС имунолошког обележја ПР1 (Силипо ет ал., 2005), могла би да сугерише да ЛПС није главни покретач имунолошке интеракције биљака са бактеријским ОМВ. Ово, међутим, остаје да се детаљније испита. Показало се да ОМВ доприносе бактеријској колонизацији и сисара и биљака домаћина, а у неким случајевима и вируленцији бактерија. С друге стране, ОМВ активирају имуни систем домаћина на тај начин, делујући као мач са две оштрице, промовишући преживљавање и вируленцију бактерија с једне стране, и хранећи систем за надзор домаћина и активирајући имунитет домаћина с друге (МцМиллан & Куехн, 2021. ). Наши примарни тестови су показали да је ОМВ изазов довео до значајне инхибиције Псеудомонас сирингае пв. раст парадајза ДЦ3000 (Пст) у плантама, сличан ефекту прајминга који се види код синтетичких МАМП (Јунг ет ал., 2009). Стога, у овом случају, пре-давање ОМВ-а у инокулисано ткиво није подстакло бактеријску колонизацију, већ је пре подстакло биљке да изазову ефикасан имуни одговор који инхибира раст патогена. Овај резултат је у складу са нашим транскрипционим подацима и нашом претходном студијом, подржавајући идеју да ОМВ изазивају снажан и ефикасан имуни одговор код Арабидопсис. Две недавне студије су такође показале да је предтретман Арабидопсис ОМВ из патогене или комензалне врсте Псеудомонас, потиснуо каснију инфекцију Пст (Јанда ет ал., 2021; МцМиллан ет ал., 2021). Ови резултати кумулативно указују да у тестираним условима, ОМВ инфилтрација не олакшава инфекцију патогеном. У претходној студији, показали смо да вишеструки мутанти имуних рецептора одржавају ВТ одговор на Ксцц ОМВ. Ови мутанти су укључивали познате ПРР, који препознају или протеинске (ФЛС2, ЕФР, РЛПРеМАКС) или непротеинске МАМП (ЛИМ1/ЛИМ3) (Бахар ет ал., 2016). Занимљиво је да Јанда и др. (2021) су известили да када је мутантна линија ФЛС2 рецептора Арабидопсис (грипа) била изазвана ОМВ из Пст, експресија ФРК1 је била непромењена и била је слична биљкама које су лажно третиране, што сугерише да ФЛС2 посредује у одговору на Пст ОМВ. Могуће је да је флагелин у већој количини у Пст ОМВ препаратима него у Ксцц 33913 ОМВ, па је стога уклањање рецептора флагелина имало израженији ефекат на одговор биљке на Пст него на Ксцц ОМВ.

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

Показало се да различити имунолошки тестови биљака могу дати различите резултате, што доводи до наводно контрадикторних закључака. На пример, показали смо да је у тесту распрскавања РОС-а на листовима диска, одговор Арабидопсиса на ОМВ зависио од ЕФР рецептора, међутим, у тесту експресије гена имуног маркера са садницама Арабидопсис, икад мутантна линија је била подједнако осетљива на ОМВ као и тхе ВТ. МцМиллан ет ал. (2021) су показали да различити физички третмани примењени на ОМВ укидају одређене активности као што је инхибиција раста садница. Међутим, то није променило друге имунолошке ефекте као што је прајмерисање биљака. Стога је важно комбиновати различите тестове да би се тестирали различити имуни резултати како би се добио што шири поглед на имуни одговор биљке на дати елицитор. Да бисмо даље испитали укључивање неких од познатих ПРР-ова и ко-рецептора, тестирали смо све падове и бак мутантне линије користећи есеј прајминга биљака. Наши резултати показују да су падови дупле мутантне линије Арабидопсис били на сличан начин припремљени од стране Ксцц ОМВ као и ВТ биљке, подржавајући идеју да су МАМП-ови осим флагелина и ЕФ-Ту такође присутни у Ксцц 33913 ОМВ. На основу тестова експресије гена имуних маркера, раније смо сугерисали да је ко-рецептор БАК1 укључен у перцепцију и/или одговор ОМВ (Бахар ет ал., 2016). У овој студији, поново смо размотрили ову сугестију користећи основни тест. Овде је бак мутантна линија прајмирана ОМВ предтретманом, али у нешто мањој мери него биљке ВТ Цол-0. Иако ова маргина није била статистички значајна, била је већа од оне уочене код линије двоструких флс мутанта. Овај резултат је такође у складу са недавном студијом која је показала да је бак мутантна линија реаговала на ОМВ као ВТ биљке у експериментима имунолошког прајминга (Тран ет ал., 2021). Све у свему, ово може сугерисати да, иако је БАК1 укључен у перцепцију ОМВ, друге имунолошке перцепције и сигналне путеве припрема ОМВ, што доводи до ефикасног имунолошког одговора и супресије раста патогена. Учешће ко-рецептора БАК1 и СОБИР1 као одговор на ОМВ (Бахар ет ал., 2016) довело нас је до претпоставке да су вишеструки имуни рецептори, вероватно ПРР, укључени у перцепцију ОМВ. Међутим, недавна студија је сугерисала да имунолошка активација биљака помоћу ОМВ-а може бити независна од МАМП-а и да је резултат физичко-хемијских промена у биљној плазма мембрани изазваних интеграцијом ОМВ-а (Тран ет ал., 2021). Ово је интригантна хипотеза којој остаје да се даље бави. Занимљиво је да МцМиллан ет ал. (2021) су известили да су ОМВ третирани протеиназом К задржали свој имуни примарни капацитет, што указује да ова активност може бити независна од ОМВ протеинског терета. Иако овај резултат може подржати хипотезу о имунолошкој активацији независне од МАМП-а Тран ет ал. (2021), други непротеински МАМП присутни у ОМВ као што су ЛПС и ПГН могу активирати МТИ (Бахар ет ал., 2016; МцМиллан ет ал., 2021). Поред тога, ОМВ третирани протеиназом К задржали су своју способност да индукују инхибицију раста садница, што указује да инхибиција раста зависи од протеинског терета ОМВ (МцМиллан ет ал., 2021). Све у свему, ови резултати додатно наглашавају сложеност одговора биљака на ОМВ и важност употребе различитих излазних података за тестирање укључености одређеног елицитора у специфичне путеве.

Током 2021. године, четири независне студије, укључујући ову (које су се вероватно одвијале истовремено), објавиле су да бактеријски ОМВ модулирају имуни систем биљке и изазивају ефикасан одговор на инфекцију патогеном (Јанда ет ал., 2021; МцМиллан ет ал., 2021; Тран ет ал., 2021). Ови узбудљиви резултати позиционирају ОМВ као новог и важног играча у интеракцијама између биљака и микроба, где има још много тога да се научи. У овој студији пружамо шири поглед на транскрипциони одговор Арабидопсис на Ксцц ОМВ. Биће потребни комплементарни истраживачки приступи да би се даље разумеле компоненте и механизми укључени у перцепцију ОМВ-а на биљкама.

РЕФЕРЕНЦЕ

Амбават, С., Схарма, П., Иадав, НР, & Иадав, РЦ (2013). Гени фактора транскрипције МИБ као регулатори одговора биљака: преглед. Физиологија и молекуларна биологија биљака, 307–321.

Бахар, О. (2020). Мембрански везикули из биљних патогених бактерија и њихова улога током интеракција између биљака и патогена. У: М. Капаракис-Лиаскос, & ТА Куфер едс. Бактеријске мембранске везикуле – биогенеза, функције и примена. Спрингер Интернатионал Публисхинг, Швајцарска, 119–129.

Бахар, О., Мордукховицх, Г., Луу, ДД, Сцхвессингер, Б., Дауди, А., Јехле, АК, Фелик, Г., & Роналд, ПЦ (2016). Бактеријске везикуле спољашње мембране индукују имуне одговоре биљака. Молекуларне интеракције биљака и микроба, 374–384.

Биркенбихл, РП, Крацхер, Б., Росс, А., Крамер, К., Финкемеиер, И., & Сомссицх, ИЕ (2018). Принципи и карактеристике Арабидопсис ВРКИ регулаторне мреже током раног имунитета изазваног МАМП-ом. Плант Јоурнал, , 487–502.

Бјорнсон, М., Пимприкар, П., Нурнбергер, Т., & Зипфел, Ц. (2021). Транскрипциони пејзаж Арабидопсис тхалиана је покренуо имунитет. Природа Биљке, , 579–586.

Болгер, АМ, Лохсе, М., & Усадел, Б. (2014). Триммоматиц: Флексибилни тример за Иллумина секвенце података. Биоинформатика, 2114–2120.

Бутрот, Ф. и Зипфел, Ц. (2017). Функција, откривање и експлоатација рецептора за препознавање биљних образаца за отпорност на болести широког спектра. Годишњи преглед фитопатологије, 257–286.

Цхинцхилла, Д., Зипфел, Ц., Робатзек, С., Кеммерлинг, Б., Нурнбергер, Т., Јонес, ЈДГ, Фелик, Г., & Боллер, Т. (2007). Комплекс рецептора ФЛС2 и БАК1 изазван флагелином покреће одбрану биљке. Природа, 497–500.

Цховдхури, Ц., & Јаганнадхам, М. в. (2013). Фактори вируленције се ослобађају заједно са везикулама спољашње мембране Псеудомонас сирингае пв. парадајз Т1 током нормалног раста. Биоцхимица Ет Биопхисица Ацта-Протеини и протеомика, (1), 231–239.

Цоок, ДЕ, Месарицх, ЦХ и Тхомма, БПХЈ (2015). Разумевање имунитета биљака као система надзора за откривање инвазије. Годишњи преглед фитопатологије, 541–563.

Цоуто, Д., & Зипфел, Ц. (2016). Регулација сигнализације рецептора за препознавање образаца у биљкама. Натуре Ревиевс Иммунологи, (9), 537–552.

Давидссон, П., Броберг, М., Кариола, Т., Сипари, Н., Пирхонен, М., & Палва, ЕТ (2017). Кратки олигогалактурониди индукују експресију гена повезану са отпорношћу на патогене у Арабидопсис тхалиана. БМЦ Плант Биологи, 1–17.

Деатхерагеа, БЛ, & Цооксон, БТ (2012). Ослобађање мембранских везикула код бактерија, еукариота и археја: очуван, али недовољно цењен аспект живота микроба. Инфекција и имунитет, 1948–1957.

Деноук, Ц., Галлетти, Р., Маммарелла, Н., Гопалан, С., Верцк, Д., Де Лорензо, Г., Феррари, С., Аусубел, ФМ, & Девднеи, Ј. (2008). Активација путева одбрамбеног одговора помоћу ОГ и Флг22 елицитора у садницама Арабидопсис. Молекуларна биљка, 423–445.

Дов, М., Невман, М.-А., & вон Роепенак, Е. (2000). Индукција и модулација одбрамбених одговора биљака бактеријским липополисахаридима. Годишњи прегледи фитопатологије, 241–261.

Ду, З., Зхоу, Кс., Линг, И., Зханг, З., и Су, З. (2010). агриГО: ГО анализа алата за пољопривредну заједницу. Истраживање нуклеинских киселина, В64–В70.

Еллис, ТН, & Куехн, МЈ (2010). Вируленција и имуномодулаторне улоге везикула спољашње мембране бактерија. Мицробиологи анд Молецулар Биологи Ревиевс,81–94.

Еллис, ТН, Леиман, СА и Куехн, МЈ (2010). Природно произведене везикуле спољашње мембране из Псеудомонас аеругиноса изазивају снажан урођени имуни одговор комбинованим сенсингом и липополисахаридних и протеинских компоненти. Инфекција и имунитет, 3822–3831.

Ербс, Г., Силипо, А., Аслам, С., де Цастро, Ц., Липароти, В., Флагиелло, А., Пуцци, П., Ланзетта, Р., Паррилли, М., Молинаро, А. , Невман, М.-А., & Цоопер, РМ (2008). Пептидогликан и муропептиди из патогена Агробацтериум и Ксантхомонас изазивају урођени имунитет биљака: структура и активност. Хемија и биологија, 438–448.

Фелик, Г., Дуран, ЈД, Волко, С., & Боллер, Т. (1999). Биљке имају осетљив систем перцепције за најконзервиранији домен бактеријског флагелина. Плант Јоурнал, 265–276.

Фесел, ПХ, и Зуццаро, А. (2016). -глукан: Кључна компонента ћелијског зида гљивица и неухватљиви МАМП у биљкама. Генетика и биологија гљива, 53–60

Фулсундар, С., Хармс, К., Флатен, ГЕ, Јохнсен, ПЈ, Цхопаде, БА, & Ниелсен, КМ (2014). Потенцијал преноса гена везикула спољашње мембране Ацинетобацтер баилии и ефекти стреса на везикулацију. Апплиед анд Енвиронментал Мицробиологи, 3469–3483.

Гомез-Гомез, Л., & Боллер, Т. (2000). ФЛС2: киназа слична ЛРР рецептору укључена у перцепцију флагелина бактеријског елицитора у Арабидопсису. Молецулар Целл, 1003–1011.

Густ, АА, Бисвас, Р., Ленз, ХД, Раухут, Т., Ранф, С., Кеммерлинг, Б., Готз, Ф., Глависцхниг, Е., Лее, Ј., Фелик, Г., & Нурнбергер , Т. (2007). Пептогликани добијени од бактерија чине молекуларне обрасце повезане са патогеном који покрећу урођени имунитет код Арабидопсис. Јоурнал оф Биологицал Цхемистри, 32338–32348.

Ионесцу, М., Заини, ПА, Баццари, Ц., Тран, С., да Силва, АМ, & Линдов, СЕ (2014). Везикуле спољашње мембране Ксилелла фастидиоса модулирају колонизацију биљака блокирањем везивања за површине. Процеедингс оф тхе Натионал Ацадеми оф Сциенцес оф тхе Унитед Статес оф Америца, Е3910–Е3918.

Јанда, М., Лудвиг, Ц., Рибак, К., Менг, Ц., Стиглиано, Е., Ботзенхардт, Л., Сзулц, Б., Скленар, Ј., Менке, ФЛХ, Малоне, ЈГ, Брацхманн, А., Клингл, А., и Робатзек, С. (2021). Биофизичке и протеомске анализе указују на функцију екстрацелуларних везикула Псеудомонас сирингае пв парадајза ДЦ3000 у расту бактерија током инфекције биљака. биоРкив, 2021.02.08.430144.