Повољни ефекти укупне фракције фенилетаноидног гликозида изоловане из Цистанцхе Десертицола на микроструктуру костију код пацова са јајницима

Линглинг Ианг, Схукин Динг, Бо Зханг, Јингјинг Лиу, Ианхонг Донг, Кивен Танг, Пингпинг Ианг и Ксуекин Ма

1 Одељење за фармацеутску анализу, Фармацеутски факултет, Нингкиа Медицал Университи, 1160 Схенли Стреет, Иинцхуан 750004, Кина

2 Факултет клиничке медицине, Нингкиа Медицал Университи, 692 Схенли Стреет, Иинцхуан 750004, Кина

3 Кључна лабораторија за модернизацију етничке медицине Хуи, Министарство образовања, Нингкиа Медицал Университи, 1160 Схенли Стреет, Иинцхуан 750004, Кина

Ово је чланак отвореног приступа који се дистрибуира под лиценцом Цреативе Цоммонс Аттрибутион Лиценсе, која дозвољава неограничену употребу, дистрибуцију и репродукцију у било ком медију под условом да је оригинално дело правилно цитирано.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Апстрактан

Ова студија је дизајнирана да процени антиостеопоротичку активност укупне фракције фенилетаноид гликозида изоловане изЦистанцхедесертицола(ЦДП) на пацовима индукованим овариектомијом (ОВКС) као и сродним механизмима. Након 3 месеца оралне примене, смањена минерална густина костију, серум Ца и П код ОВКС пацова је опорављена, а погоршана микроархитектура трабекуларне кости је делимично побољшана интервенцијом Цистанцхе десертицола (60, 120 и 240 мг/кг), активности маркера ресорпције костију су смањени, а биоактивност индекса формирања костију је повећана; у међувремену, садржај МДА је смањен, а ГСХ је повећан ЦДП третманом. Композиционо је идентификовано 8 једињења фенилетаноидних гликозидаЦистанцхедесертицола(ЦДП), са укупним садржајем квантификованим као 50,3 процената коришћењем ХПЛЦ методе. механички,Цистанцхедесертицола(ЦДП) снизио нивое ТРАФ6, РАНКЛ и РАНК, потискујући тако РАНКЛ/РАНК/ТРАФ6-индуковану активацију низводних НФ-κБ и ПИ3К/АКТ сигналних путева и на крају спречавајући активности кључних остеокластогених протеина НФАТ2 и ц -Фос. Сви горе наведени подаци имплицирају да је ЦДП показао благотворне ефекте на микроструктуру костију код пацова са овариектомијом, а ови ефекти могу бити повезани са НФ-κБ и ПИ3К/АКТ сигналним путевима који су покренути везивањем РАНКЛ, РАНК и ТРАФ6.

Цистанцхе тубулосаима много ефеката, кликните овде да бисте сазнали више

1. Представљање

Постменопаузална остеопороза, од које пати 1 од 3 жене старије од 50 година, постаје главни здравствени ризик који погађа више од 200 милиона жена широм света [1]. У менопаузи, нагли пад нивоа естрогена обично доводи до прекомерне ресорпције костију узроковане појачаном остеокластогенезом; затим је поремећена равнотежа између формирања кости изазване остеобластом и ресорпције кости изазване остеокластима, а убрзана ресорпција кости је коначно изазвала остеопорозу, па чак и прелом кука или кичме [2]. Веровало се да је диференцијација остеокласта покренута када је рецепторски активатор нуклеарног фактора капа Б (РАНК) везан за РАНКЛ, лиганд РАНК. Међутим, комбинација РАНК до РАНКЛ се не може активирати осим ако се у њој не придружи фактор 6 повезан са фактором 6 фактора некрозе тумора тумора (ТРАФ6) [3], након чега следи стимулација низводних сигналних путева укључујући ПИ3К/АКТ и НФ-κБ. И на крају, експресије нуклеарног фактора активираних Т ћелија ц2 (НФАТ2) и ц-Фос су регулисане [4] да би се модулирала диференцијација остеокласта као и ресорпција кости. Стога се веровало да су фактори и регулатори који су директно или индиректно повезани са активацијом и диференцијацијом остеокласта кључни циљеви за спречавање губитка коштане масе.

Заиста постоје неки клинички и синтетички лекови за терапију замене хормона као што је естрадиол валерат који су ефикасни у лечењу постменопаузалне остеопорозе. Нажалост, неки од њих су повећали ризик од озбиљних карцинома укључујући карцином дојке и ендометријума [5], што је ограничило њихову клиничку примену. Због тога је неопходно одабрати друге алтернативе са ефикасношћу и минималним нежељеним ефектима. Традиционални кинески лекови (ТЦМ), као и изолована биоактивна једињења и фракције [6–9], показали су се ефикасним код различитих обољења укључујући остеопорозу у постменопаузи. Међу овим биоактивним компонентама и фракцијама, једињења фенилетаноидних гликозида (ПхГ) са потенцијалном ефикасношћу верована су као обећавајући агенси за лечење остеопорозе [10–12]. Структуре ПхГ се састоје од агликона циметне киселине, хидроксил фенил етил групе која је комбинована са -глукопиранозом, апиозом, галактозом, рамнозом или ксилозом преко гликозидне везе. Широко постоје у лековитим врстама родаЦистанцхе[13]. ЦистанцхедесертицолаИЦ Ма је званични ТЦМ који је забележен у кинеској фармакопеји, а осим што је важан ТЦМ [14], Ц десертицола је такође тоник биљка против старења са неколико нежељених ефеката која је развијена у лековито пиће и хранљиву течност коју је одобрила државна храна. и Управа за лекове. На основу записа кинеске фармакопеје, староседеоци су традиционално користили Ц. десертицола за решавање проблема са недостатком есенције бубрега као што су слабост мишића и лумбална слабост, а једињења фенилетаноидних гликозида укључујући ехинакозид и актеозид су главни биоактивни састојци ове биљке. Према ТЦМ теорији „бубрег-управља-кост“, коштаним системом управља суштина бубрега [15], а проблеми у вези са костима попут остеопорозе могу се излечити помоћу биљака или једињења која поседују активност исхране есенције бубрега. Стога смо претпоставили да је укупна фракција фенилетаноидног гликозида изолована из Ц. десертицола, барем делимично, била корисна у лечењу остеопорозе. Садашњи експеримент је стога осмишљен да потврди нашу хипотезу коришћењем модела пацова са овариектомијом (ОВКС); поред маркера ресорпције и формирања костију који се морају проценити, индекс антиоксидације као и РАНКЛ/РАНК/ТРАФ6- индуковани ПИ3К/АКТ и НФ-κБ сигнални путеви су такође коришћени да би се истражили главни механизми антиостеопоротске биоактивности .

2. Материјали и метода

2.1. Биљни материјали и припрема.

Укупно 30 кг стабљикаЦистанцхедесертицолаY.C. Ма су прикупљени из округа Ионгнинг у септембру 2015 са координатама 106.026597 и 38,262816, провинција Нингкиа, Кина. Биљку је идентификовао др Лин Донг (Одељење за фармакогнозију, Медицински универзитет Нингсија) и одговарајући примерак (#201509{{40}}1) је сачуван у Одељењу за фармацеутску анализу. Прво, 30.0 кг Ц. десертицола у праху је екстраховано методом рефлукса са 70% етанола као растварача; однос материјала према растварачу је постављен на 1:10, а време рефлукса је 2 х 3 пута. Затим су сви филтрати спојени и кондензовани под сниженим притиском на 60 степени Ц. Друго, колоне АБ-8 макропорозне смоле су коришћене за прелиминарну сепарацију, а различити односи етанола у води (0 процената, 20 процената, 30 процената, 40 процената, 50 процената и 60 процената, сваки по 60 Л) је употребљено за елуирање. Треће, 40% и 50% елуенси су комбиновани и даље пречишћени коришћењем поновљених колона АБ{24}} макропорозне смоле са елуентима од 0 процената, 20 процената, 30 процената, 40 процената и 50 процената етанола у води, и сваки елуент је био 12 Л. Коначно, фракција од 40 процената је сакупљена и кондензована под сниженим притиском да би се добило 150 г бледо жутог седимента фенилетаноидног гликозида фракције Ц. десертицола (ЦДП, принос је био 0,5 процената). За ин виво експерименте, 0,5 процената ЦМЦ-На растварача је коришћен за растварање ЦДП; орална примена животињама је одређена као 1 мЛ/100 г телесне тежине; за ин витро Вестерн блот анализу, ЦДП је растворен са ДМСО и затим разблажен са ДМЕМ да би се добиле коначне концентрације од 0,1 мг/мЛ, 0,01 мг/мл и 0,001 мг/мЛ.

2.2. Хемикалије и растварачи.

Естрадиол валерат (ЕВ) је из Делпхарм Лилле САС, Француска; алкална фосфатаза (АЛП), коштани гла-протеин (БГП), кисела фосфатаза отпорна на тартарат (ТРАП) и деоксипиридинолин (ДПД) унакрсна ЕЛИСА комплета из Ксиниу Биологицал Енгинееринг Цо. Лтд., Шангај, Кина, 201605; малондиалдехид (МДА, 20181221), супер оксид дисмутаза (СОД, 20121218) и комплети реагенса за глутатион (ГСХ, 20181221) са Института за биолошки инжењеринг Нањинг Јианцхенг, Нањинг, Кина; Интактни паратхормон (л-ПТХ, НЕВАСХЕ7УЗ), калцитонин (2Л9ИСН7АИУ) и рецептор алфа повезан са естрогеном (ЕРР, И3АИ8КЕВБ3) ЕЛИСА комплети за умрежавање из Елабсциенце Биотецхнологи Цо. Лтд., Вухан, Кина; цатхепсин К ЕЛИСА комплет реагенса из БиоВисион, Америка, 1л300141; примарна антитела РАНКЛ (ГР3193842-5), РАНК (АА02113656), ТРАФ6 (2), ц-Фос (АГ12059411), НФАТ2 (АО11015648), НФ-κБ п65 (АХ04138226), ПИ3 алфаза (п69) , АКТ 1 (АФ05173234), -актин (17АВ0411) и секундарна антитела козјег анти зечјег ИгГ коњугованог пероксидазом рена из ЗСГБ-БИО, Кина, 136080; комплет за анализу укупног БЦА протеина и комерцијални комплет за детекцију формирања окласта осте и феталног говеђег серума и Дулбеццо-ов модификовани Еаглеов медијум (ДМЕМ) из ХиЦлоне, Логан, УТ, САД; поливинилиден флуорид (ПВДФ) мембрана из Миллипоре Лифе Сциенцес, Биллерица, МА, САД; пеницилин и стрептомицин из Гибцо, Роцквилле, МД, САД. Сви остали коришћени хемијски агенси били су АР класе.

2.3. ХПЛЦ квантификација Цистанцхе Десертицола П.

Агилент 1220 ХПЛЦ инструмент је коришћен за идентификацију и квантификацију састава ЦДП. Услови хроматографије су били следећи: Ц18 колона (ТСК-ГЕЛ, 4 6 И д × 250 мм, 5 μм); Градијент елуције је садржао раствараче А (ацетонитрил) и Б (вода која садржи 0,5 процената сирћетне киселине) (0-10 мин: 17-20 проценат А; 10-30 мин: 20-25 проценат А; и 30-40 мин: 25-30 проценат А); таласна дужина детекције била је 333 нм; температура околине; брзина протока је била 1,0 мЛ/мин; запремина убризгавања узорка била је 5 μЛ. Идентификовано је осам ПхГ једињења, односно цистанозид Ф, ехинакозид,6′-ацетилактеозид, цистанозид Ц, цистанозид А, актеозид, 2′-ацетилактеозид и изоактеозид; коришћењем одговарајућих референтних супстанци и екстерне стандардне методе, садржај горњих 8 ПхГ је квантификован ХПЛЦ анализом (Слика 1).

2.4. Протокол експеримента на животињама.

Укупно 60 одраслих женки Спрагуе-Давлеи пацова старости 3 месеца је одређено из центра за тестирање на животињама Медицинског универзитета Нингкиа, са просечном почетном телесном тежином од око 234 ± 25 г. Пацови су смештени у стандардном окружењу без патогена да би се аклиматизирали 1 недељу. Затим су сви пацови анестезирани (хлорал хидрат, 100 мг/кг, ип) само или лажна овариектомија (СХАМ), или су два јајника оба уклоњена, а затим насумично подељена у 5 подгрупа: орално третиране вехикулом (0,5 процената ЦМЦ-а). На) је постављена као модел група (ОВКС), естрадиол валерат (1 мг/кг/дан) као позитивна група (ЕВ), а 60, 120 и 240 мг/кг/дан ЦДП као низак (ЦДПЛ), умерене (ЦДПМ) и високе (ЦДПХ) групе дозе, респективно. Сви пацови су давани орално дневно и трајали су 3 месеца са прилагођавањем дозе сваке 2 недеље, што је зависило од промене укупне телесне тежине. Последњег дана експеримента на животињама, 24-сатни урин је добијен коришћењем метаболичких кавеза; серум је сакупљен из феморалне артерије анестезираних пацова; десна фемора, тибија и сви органи су сецирани и ускладиштени на -80 степени Ц ради даље анализе. Експерименте на животињама које смо спровели одобрио је Институционални комитет за негу и употребу животиња Медицинског универзитета Нингсија.

2.5. Одређивање минералне густине костију и микро-ЦТ анализа.

Прво, машина за апсорпциометрију рендгенских зрака са двоструком енергијом (Лунар, САД) је коришћена за процену укупне минералне густине костију десне бутне кости сваког пацова; друго, иста бутна кост је коришћена за процену 3Д слике микроархитектуре трабекуларне кости коришћењем микро-ЦТ скенера (ГЕ, Америка). Изотропна резолуција је постављена на 14 μм да би се добила идеална 3Д слика; регион од интереса (РОИ) је изабран постављањем истих координата у плочу раста бутне кости сваког узорка; и морфометријске параметре костију укључујући трабекуларну сепарацију (Тб. Сп), трабекуларни број (Тб. Н), дебљину трабекуле (Тб. Тх), садржај минерала костију (БМЦ), минералну густину ткива (ТМД) и садржај минерала у ткиву (ТМЦ ) добијени су анализом РОИ.

2.6. Биохемијски тест серума и урина.

Активности серумског катепсина К, ТРАП, СОД и ГСХ, као и садржај серумског ПТХ, калцитонина, ЕРР , МДА, БГП и ДПД у урину, одређивани су применом одговарајућих комплета реагенаса према упутству произвођача и ниво алкалне фосфатазе (АЛП) и садржај калцијума у ​​серуму и урину (Ца) и фосфора (П) процењени су применом аутоматске машине (Циба-Цорнинг 550 Диагностицс Цорп., Оберлин, ОХ, САД).

2.7. Вестерн блот анализа.

Остеокласти су индуковани коришћењем ћелија РАВ 264.7 са додатком фактора стимулације колоније макрофага (МЦСФ) и РАНКЛ. Укратко, 1 × 107 РАВ 264.7 ћелија је култивисано у 6-плочи са бунарима у присуству 30 нг/мЛ МЦСФ-а и 25 нг/мЛ РАНКЛ-а. После 6 дана индукције, зреле ћелије остеокласта су идентификоване коришћењем методе обојене ТРАП-ом са одговарајућим комплетом, затим третиране ЦДП (0.1, 0.01 и 0.001 мг/мЛ 24 х; затим су ћелије лизиране пуфером за лизу који садржи 0,5 ммол фенилметилсулфонил флуорида, протеазе и инхибиторе фосфатазе. Лизат је затим одвојен коришћењем 10 процената СДС-ПАГЕ и пребачен на ПВДФ мембрану, која је испитана са АКТ1, НФ-κБ-п65, РАНКЛ, ПИ3К-п85, РАНК, НФАТ2, ТРАФ6, ц-Фос и -актином (1:400) након блокирања са 5% немасног млека током 2 х. Исте мембране су скинуте и поново испитане са горњих 9 одговарајућих антитела, респективно, а затим су откривене од стране софтвера Имаге Лаб на крају. Експерименти су поновљени три пута.

2.8. Статистичка анализа.

Сви подаци добијени из ин виво и ин витро експеримената, описани као средња вредност ± СД, анализирани су коришћењем једносмерне АНОВА праћене Дунеттовим тестом (СПСС 22.0 софтвер, СПСС, САД); п < 0="" 05="" је="" био="" статистички="">

Резултати

3.1. Хемијски састав Цистанцхе Десертицола П.

Коришћењем ХПЛЦ методе, осамфенилетаноидни гликозидједињења су пронађена у овој фракцији, као што је приказано на слици 1. Коришћењем стандардних референци и екстерне стандардне методе, једињења и њихов садржај су идентификовани и квантификовани на следећи начин: (1) актеозид Ф (3,6 процената), (2) ехинакозид (8,8 процената), (3) цистанозид А (5.{101} {9}} процената), (4) актеозид (13,3 процента), (5) изоактеозид (3,3 процента), (6) актеозид Ц (3,6 процената), (7) 2′-ацетилактеозид (9,9 процената) и (8 ) 6′-ацетилактеозид (3,2 процента). Укупан садржај ових осам компоненти квантификован је као 50,7 процената.

3.2. Ефекти Цистанцхе Десертицола П на минералну густину костију и микроархитектуру трабекуле.

Укупна минерална густина костију пацова у различитим подгрупама приказана је на слици 2. Уочен је тренд смањења садржаја минералне густине костију код пацова групе ОВКС модела, који се смањио за скоро 12.0 процената након 12 недеља операције у поређењу са пацовима СХАМ групе (п < 0="" 001).="" сви="" пацови="" третирани="" цдп-ом="" су="" показали="" значајно="" повећану="" минералну="" густину="" костију="" за="" 11,2%,="" 120="" процената="" и="" 10,7="" процената="" (п="">< 0="" 01),="" респективно,="" у="" поређењу="" са="" пацовима="" овкс="" модела="" група.="" штавише,="" у="" складу="" са="" подацима="" о="" укупној="" минералној="" густини="" костију,="" микро-цт="" реконструкција="" као="" и="" хистоморфометријско="" одређивање="" бутне="" кости="" су="" показали="" да="" су="" пацови="" у="" групи="" овкс="" показали="" очигледно="" погоршање="" трабекуларне="" архитектуре="" о="" чему="" сведочи="" значајно="" смањен="" број="" и="" површина="" трабекуле.="" као="" значајно="" повећан="" тб.="" сп="" у="" поређењу="" са="" пацовима="" схам="" групе.="" третман="" са="" цдп="" спречио="" је="" овкс-индуковано="" погоршање="" трабекуларне="" архитектуре;="" као="" што="" приказује="" слика="" 3,="" бмц,="" тмц="" и="" тб.="" н="" вредности="" су="" значајно="" повећане="" и="" површина="" тб.="" сп="" је="" значајно="" смањен,="" док="" су="" вредности="" тмд="" и="" тб.="" чинило="" се="" да="" на="" њих="" није="" значајно="" утицала="" овкс="" операција="" и="" наша="" цдп="">

3.3. Ефекти Цистанцхе Десертицола П на биохемијске параметре урина и серума.

Као што показује Слика 4, откривени су значајни трендови смањења нивоа П у урину и садржаја калцитонина у серуму код пацова групе ОВКС модела, што је било скоро 30 процената и 60 процената мање од СХАМ пацова (п < 0="" 001="" ),="" док="" између="" овкс="" и="" схам="" група="" нису="" примећени="" очигледни="" трендови="" повећања="" или="" смањења="" нивоа="" ца="" и="" ца="" у="" серуму,="" као="" ни="" птх="" у="" серуму="" и="" птх="" у="" серуму.="" третман="" цдп-ом="" значајно="" је="" спречио="" губитак="" серумских="" п="" и="" ца="" код="" овкс="" пацова,="" о="" чему="" сведоче="" нивои="" п="" и="" ца="" у="" серуму="" који="" су="" значајно="" повећани="" (п="">< 0="" 05)="" у="" поређењу="" са="" пацовима="" из="" групе="" овкс="" модела.="" поред="" тога,="" уочени="" су="" повећани,="" али="" нестатистички="" значајни="" трендови="" калцитонина="" иу="" групи="" са="" ниским="" и="" високим="" дозама="" цдп-а="" у="" поређењу="" са="" групом="" модела="">

3.4. Ефекти Цистанцхе Десертицола П на формирање костију и маркере ресорпције кости.

Повољни ефекти ЦДП-а на индекс формирања кости, као и инхибицијски утицаји на маркере ресорпције кости, описани су на слици 5. Што се тиче маркера формирања кости, нивои серумског БГП-а скоро да нису били под утицајем операције овариектомије о којој сведоче не- значајне промене примећене у свим третираним групама, док су статистички значајна побољшања АЛП у серуму постигнута и при ниским (60 мг/кг) и умереним (120 мг/кг) дозама ЦДП интервентних група када у поређењу са пацовима СХАМ групе (п < 0="" 01).="" што="" се="" тиче="" индекса="" ресорпције="" костију,="" нивои="" серумског="" катепсина="" к="" и="" дпд,="" као="" и="" трап="" код="" пацова="" групе="" овкс="" модела,="" значајно="" су="" повећани="" за="" око="" 75,0="" процената,="" 41,4="" процената="" и="" 21,0="" процената,="" респективно,="" у="" поређењу="" са="" пацовима="" схам.="" ,="" а="" када="" се="" лечи="" са="" цдп,="" посебно="" ниском="" дозом="" од="" 60="" мг/кг,="" својства="" катепсина="" к="" и="" дпд="" као="" и="" трап="" у="" групи="" овкс="" модела="" су="" значајно="" инхибирана="" за="" 67,3="" одсто,="" 41,4="" одсто="" и="" 25,9="" одсто,="" респективно,="" као="" у="" поређењу="" са="" пацовима="" у="" групи="" модела="">

3.5. Ефекти Цистанцхе Десертицола П на вагину и материцу, као и на тежину целог тела.

Незначајне разлике у почетној целој телесној тежини пацова примећене су пре третмана у шест група (Слика 6). Међутим, операција овариектомије довела је до значајног повећања коначне телесне тежине пацова у групи модела ОВКС која износи скоро 36.0 процената, док су влажне тежине материце и вагине драстично смањене за скоро 9{{4 }}.0 процената и 60,0 процената, респективно, у поређењу са СХАМ пацовима (п < 0="" 001).="" иако="" садржај="" ерр="" није="" показао="" значајну="" разлику="" између="" овкс="" и="" схам="" група,="" све="" третиране="" групе="" укључујући="" цдп="" и="" ев="" значајно="" су="" повећале="" ниво="" ерр.="" штавише,="" када="" се="" лечи="" са="" ев,="" горе="" наведени="" добитак="" целе="" телесне="" тежине,="" као="" и="" губитак="" тежине="" вагине="" и="" материце="" овкс="" пацова,="" делимично="" су="" поништени="" (п="">< 0="" 001),="" али="" на="" њих="" није="" утицала="" цдп="">

3.6. Ефекти Цистанцхе ДесертицолаП на нивое МДА, СОД и ГСХ у серуму.

Није било статистички значајне разлике у својствима серумских СОД и ГСХ између група СХАМ и ОВКС модела; као што је приказано на слици 7, може се уочити тренд повећања ГСХ између горње две групе. Поред тога, ниво серумске МДА је нагло повећан за скоро 50 процената код пацова групе ОВКС модела у поређењу са СХАМ пацовима. На активност СОД није утицао третман ЦДП, док је својство ГСХ значајно побољшано интервенцијом ЦДП, а ЦДП је значајно смањио ниво МДА за 33,9 процената и 42,4 процената при дозама од 60 и 240 мг/кг, респективно ( п < 0="">

3.7. Ефекти Цистанцхе десертицола П на нивое експресије протеина.

Наши подаци, приказани на слици 8, ​​сугеришу да третман ЦДП-ом значајно смањује нивое протеина ТРАФ6, РАНК и РАНКЛ у поређењу са контролом. Низводни сигнални путеви укључујући НФ-κБ су потиснути, а ПИ3К/АКТ је стимулисан ЦДП интервенцијом, о чему сведочи експресија ниже регулације НФ-κБ-п65, док су ПИ3К-п85 и АКТ1 били појачано регулисани. Сходно томе, експресија НФАТ2 је значајно смањена, а ц-Фос је повећан после третмана са ЦДП у концентрацији од 0.001-0.1 мг/мЛ. Предложени механизам је описан на слици 9, где је ЦДП смањио нивое РАНКЛ и РАНК, што је довело до смањења количине везивања овог лиганда са његовим рецептором, а веза РАНКЛ са РАНК је додатно смањена смањењем регулације ТРАФ6, праћено супресијом низводних путева укључујући НФ-κБ пут, док је ПИ3К/АКТ сигнални пут стимулисан, што је коначно довело до смањења експресије НФАТ2 и повећања нивоа ц-Фос.

4. Дискусија

Фенилетаноидни гликозиди су природне компоненте растворљиве у води које широко постоје у царству лековитих биљака [11]. До сада су једињења фенилетаноидних гликозида привлачила све више истраживача због њихове евидентне улоге у лечењу различитих људских обољења и абнормалности [13]. Број антиостеопоротичних биоактивних фракција и једињења, укључујући полифенол и фенилетаноидне гликозиде, идентификован је и изолован из десетина природних лековитих биљака [5, 10, 12, 16, 17]. Ц. десертицола је добро позната као „пустињски женшен“ што је имплицирало безбедносни профил овог јестивог ТЦМ [18, 19]. Као опште тоник и природна здрава храна која се дуго користи у азијским земљама, Ц. десертицола је показала благотворну функцију за јачање снаге бубрега. Утврђено је да се ТЦМ, који се традиционално користи за оснаживање и чување есенције бубрега, обично користи за лечење остеопорозе, како ин витро тако и ин виво објављени подаци су доказали антиостеопоротичку активност Ц. десертицола [20–23], и састојака фенилетаноидног гликозида, укључујући ехинакозид и актеозид су главне биоактивне компоненте које постоје у овој јестивој лековитој биљци; све то указује на то да се не само ехинакозид и актеозид, већ и друге компоненте фенилетаноидног гликозида садржане у Ц. десертицола сматрају одговорним за антиостеопоротичко својство ове биљке. У нашој садашњој студији, коришћена је повољна безбедносна макропорозна смола за изоловање и обогаћивање фракције фенилетаноид гликозида из Ц. десертицола, а коришћењем ХПЛЦ методе осам главних компоненти фенилетаноид гликозида, односно, актеозид Ф, ехинакозид, цистанозид А, актеозид, изоактеозид, актеозид Ц, 2′-ацетилактеозид и 6′-ацетилактеозид, пронађени су у изолованој фракцији фенилетаноид гликозида, а садржај је био 3,6 одсто, 8,8 одсто, 5,0 одсто, 13,3 одсто, 3,3 одсто. и 3,2 одсто, респективно. Доказано је да ехинакозид, једно од главних активних једињења забележених у Ц. десертицола [14], поседује антиостеопоротичку активност; међутим, доза од 270 мг/кг била је толико висока да је ограничила њену даљу клиничку примену [24]. У тренутним експериментима, укупна фракција фенилетаноидног гликозида са нижом дозом од 60-240 мг/кг телесне тежине/-дан је коришћена на ОВКС пацовима, а садржај идентификованих састојака био је скоро 50 процената чист у овој фракцији коришћењем ХПЛЦ методом.

Било је добро познато да ОВКС може изазвати остеопорозу, а веровало се да је ОВКС пацов класичан и погодан модел за симулацију постменопаузалне остеопорозе код људи. Истовремено, значајно смањење минералне густине костију, микроархитектуре трабекуларне кости, влажне тежине материце и вагине и нивоа естрогена, као и очигледно побољшање ресорпције костију и телесне тежине, примећено је након операције овариектомије, од којих су у део због губитка естрогена [25]. Наши подаци, до сада, јасно су показали да ОВКС заиста изазива постменопаузалну остеопорозу и да је увек праћен наглим падом квалитета костију, микроархитектуре костију и тежине материце и вагине. Како је ЕВ генерално средство за замену хормона које се користи у клиничкој пракси, коришћено је као позитивна контрола у нашем ин виво експерименту, а добијена је телесна тежина и атрофија материце, као и смањена минерална густина костију и микроархитектура трабекуларне кости. , очекивано су поништени суплементацијом ЕВ. За разлику од позитивне контроле, смањена тежина вагине и материце, као и укупна телесна тежина пацова у групи ОВКС модела, нису били под утицајем ЦДП третмана, што је имплицирало да ЦДП може побољшати формирање кости без изазивања нежељених ефеката. на телу и органским ткивима материце. Иако су нивои ЕРР значајно повећани ЦДП третманом, није примећен никакав нежељени ефекат на органска ткива материце и вагине као ефекат фитоестрогена. Поред тога, третман ЦДП је значајно ојачао квалитет кости код ОВКС пацова који су били погоршани операцијом овариектомије.

Поред тога, нивои П и Ца у урину и серуму ОВКС пацова су такође коришћени да одражавају антиостеопоротски ефекат, а концентрације Ца и неорганског П обично су зависиле од нивоа калцитонина и ПТХ [26]. У овој студији, иако нису добијени значајни трендови опадања или повећања нивоа излучивања Ца, серумског П, серумског Ца и ПТХ код пацова групе ОВКС модела, значајни нивои П и калцитонина у урину (п < {="" {1}}).="" у="" складу="" са="" објављеним="" подацима="" да="" је="" недостатак="" естрогена="" изазван="" операцијом="" овариектомије="" увек="" доводио="" до="" сниженог="" нивоа="" калцитонина="" у="" крви,="" овај="" смањени="" серумски="" калцитонин="" је="" коначно="" довео="" до="" повећања="" нивоа="" птх,="" где="" се="" веровало="" да="" је="" ца="" главни="" регулатор="" секреције="" птх.="" пошто="" концентрација="" птх="" није="" показала="" значајну="" разлику="" између="" овкс="" и="" схам="" група="" у="" овој="" студији,="" ниво="" ца="" у="" серуму="" и="" урину="" такође="" није="" показао="" очигледне="" промене="" између="" горње="" две="" групе.="" међутим,="" добијена="" је="" тенденција="" значајног="" опадања="" нивоа="" калцитонина="" између="" овкс="" и="" схам="" група,="" па="" је="" последично="" садржај="" п="" у="" урину="" овкс="" снажно="" смањен.="" веровали="" смо="" да="" горњи="" подаци="" могу="" да="" објасне="" контрадикторни="" феномен="" зашто="" излучивање="" ца="" у="" урину="" код="" овкс="" пацова="" није="" показало="" очигледну="" промену="" у="" поређењу="" са="" схам="" пацовима,="" а="" овај="" феномен="" може="" бити="" повезан="" и="" са="" повећаном="" стопом="" коштаног="" обрта="" [27]="" .="" након="" третмана="" са="" цдп,="" нивои="" п="" и="" ца="" у="" серуму="" су="" значајно="" повећани,="" а="" садржај="" п="" у="" урину="" је="" смањен="" код="" овкс="" пацова,="" што="" је="" одражавало="" да="" цдп="" не="" само="" да="" може="" да="" спречи="" излучивање="" минералних="" елемената="" из="" костију,="" већ="" и="" да="" повећа="" садржај="" серума="" оних="" елемената,="" чиме="" се="" индиректно="" потискује="" губитак="" коштане="">

Штавише, маркери формирања и ресорпције костију, као и антиоксидативни ензими укључујући СОД и ГСХ, такође су коришћени да би се објаснили основни антиостеопоротски механизми ЦДП. Слично објављеним подацима, ниво АЛП код пацова групе ОВКС модела показао је нестатистички значајан тренд повећања који указује на убрзану стопу коштаног обрта у постменопаузалној остеопорози [10]. Међутим, након третмана са ЦДП-ом (60, 120 и 240 мг/кг/дан), својство АЛП је значајно побољшано. Било је добро познато да је ОВКС изазвао нагли пад нивоа естрогена који обично доводи до прекомерне ресорпције костију и оксидативног стреса [28], о чему сведоче нивои ТРАП, катепсина К и ДПД, као и МДА који су значајно повећани код пацова Група модела ОВКС. Међутим, та погоршања су делимично побољшана интервенцијом ЦДП-а. Поред тога, третман ОВКС пацова са ЦДП (60 и 240 мг/кг) показао је значајно повећање активности ГСХ (п < 0="" 05).="" горе="" наведени="" резултати="" имплицирају="" да="" је="" цдп="" показао="" терапеутски="" ефекат="" на="" остеопорозу="" изазвану="" овкс-ом,="" а="" ови="" ефекти="" су="" били="" повећањем="" формирања="" костију="" и="" сузбијањем="" ресорпције="" костију,="" као="" и="" побољшањем="" антиоксидативног="" система="">

Активација РАНК његовим лигандом РАНКЛ стимулисала је експресију НФАТ2 и ц-Фос преко ПИ3К/АКТ и НФ-κБ сигнализације [29]. Показало се да је НФ-κБ неопходан за остеокластогенезу јер би поремећај НФ-κБ могао довести до ослабљене диференцијације остеокласта са остеопоротским фенотипом, а НФ-κБ је повећао ц-Фос и смањио експресију НФАТ2 током остеокластогенезе изазване РАНКЛ/РАНК/ТРАФ. Да би се проценио повољан утицај ЦДП на остеокластогенезу посредовану НФАТ2 и ц-Фос, анализирани су нивои експресије РАНКЛ и РАНК. Очекивано, ЦДП је значајно инхибирао НФАТ2 и стимулисао нивое ц-Фос тако што је смањио експресију РАНКЛ и РАНК. У међувремену, самом РАНК-у је недостајало интринзично својство киназе осим ако му се не придружи ТРАФ6 да би покренуо низводну сигнализацију [3]. ЦДП је такође смањио експресију ТРАФ6, што је довело до значајног смањења везујућих количина РАНКЛ и РАНК. Претпостављени антиостеопоротски механизам ЦДП-а на ОВКС пацовима покривао је горње сигналне путеве, а регулатори су описани на слици 9. Укратко, ЦДП је смањио нивое ТРАФ6, РАНКЛ и РАНК, потискујући тако низводне сигналне путеве укључујући ПИ3К/АКТ и НФ-κБ који активирају РАНКЛ/РАНК и коначно смањују експресију и активности кључних остеокластогених протеина НФАТ2 и ц-Фос. Стога, вишеструки трагови података имплицирају благотворан ефекат ЦДП-а на метаболизам костију ОВКС пацова углавном преко РАНКЛ/РАНК/ТРАФ6-посредованих ПИ3К/АКТ и НФ-κБ путева.

5. Закључак

Укратко, укупни фенилетаноидни гликозиди, изоловани из Ц. десертицола, показали су значајне корисне ефекте на постменопаузалну остеопорозу ОВКС пацова, а терапеутски потенцијал у сузбијању губитка коштане масе углавном је био кроз стимулацију формирања кости и инхибицију ресорпције кости, као и антиоксиданс који побољшава кости систем; механизми могу бити повезани са РАНКЛ/РАНК/ТРАФ6-индукованом активацијом НФ-κБ и инактивацијом ПИ3К/АКТ, као и ц-Фос стимулацијом и супресијом НФАТ2, и коначно, диференцијација остеокласта је инхибирана.

Скраћенице

АКТ: Протеин киназа Б

АЛП: Алкална фосфатаза

БГП: ГЛА протеин из костију

БМЦ: минерални садржај костију

ЦДП: Фенилетаноид гликозидна фракција Ц. десертицола

ЦК: Катепсин К

ЦТ: калцитонин

ДПД: Деоксипиридинолин

ЕРР : рецептор алфа повезан са естрогеном

ЕВ: Естрадиол валерат

ГСХ: Глутатион л-ПТХ: нетакнути паратхормон

МЦСФ: фактор који стимулише колоније макрофага

МДА: Малондиалдехид

НФАТ2: Нуклеарни фактор активираних Т ћелија ц2

НФ-κБ: Нуклеарни фактор-капа Б

ОПГ: Остеопротегерин

ОВКС: Овариектомија

ПхГс: фенилетаноидни гликозиди

ПИ3К: Фосфоинозитид 3-киназа

РАНГ: активатор рецептора нуклеарног фактора-капа Б

РАНКЛ: Рецепторски активатор нуклеарног фактора-капа

РОИ Б лиганда: Регион од интереса

СОД: Супероксид дисмутаза

Тб. Н: Трабекуларни број

Тб.Сп: Трабекуларна сепарација

Тб.Тх: Трабекуларна дебљина

ТЦМ: Традиционална кинеска медицина

ТМЦ: Садржај минерала у ткиву

ТМД: Минерална густина ткива

ТНФ: Фактор некрозе тумора

ТРАФ6: фактор 6 повезан са рецептором фактора некрозе тумора

ЗАМКА: кисела фосфатаза отпорна на тартрате.

Доступност података

Подаци који се користе као подршка налазима ове студије доступни су од одговарајућег аутора на захтев.

Сукоби интереса

Аутори нису имали сукоб интереса.

Прилози аутора

КСМ је дизајнирао и надгледао експерименте; СД и ЛИ су извели већину експеримената и израдили рукопис; БЗ и ЈЛ извршили су Вестерн блот анализу и учествовали у експериментима на животињама; ИД је анализирао податке; КТ и ПИ су ревидирали рукопис. Сви аутори су прегледали рукопис. Линглинг Ианг и Схукин Динг су подједнако допринели рукопису.

Признања

Овај рад је подржан грантовима Фондације за научну технологију високог образовања Нингкиа (НГИ2017090), Националне фондације за природне науке Кине (бр. 81560684), Кључног истраживачког и развојног програма Нингкиа (2018БХФ2001), Нингкиа Кеи Ресеарцх и Инвентион Програм оф Сциенце анд Тецхнологи Цооператион оф тхе Еаст анд Вест (бр. 2017БИ084 и 2017БИ079), и Вест Лигхт Фоундатион Кинеске академије наука-Иоунг Сциентистс оф Вест 2017.

Референце

[1] Љ Мелтон ИИИ, ЕА Цхрисцхиллес, Ц. Цоопер, АВ Лане и БЛ Риггс, "Перспектива. Колико жена има остеопорозу?", Јоурнал оф Боне анд Минерал Ресеарцх, вол. 7, бр. 9, стр. 1005–1010, 1992.

[2] С. Сцхнелл, СМ Фриедман, ДА Менделсон, КВ Бингхам и СЛ Катес, "1- година морталитета пацијената лечених у програму прелома кука за старије особе," Гериатриц Ортхопедиц Сургери & Рехабилитатион, вол. 1, бр. 1, стр. 6–14, 2010.

[3] ЕМ Тан, Л. Ли, ИР Индран, Н. Цхев и ЕЛ Ионг, "ТРАФ6 посредује у супресији остеокластогенезе и превенцији губитка кости изазваног овариектомијом новим пренилфлавоноидом," Јоурнал оф Боне анд Минерал Ресеарцх, вол. 32, бр. 4, стр. 846–860, 2017.

[4] ЈХ Ким и Н. Ким, "Регулација НФАТц1 у диференцијацији остеокласта", Јоурнал оф Боне Метаболисм, вол. 21, бр. 4, стр. 233–241, 2014.

[5] К. Ие, КСК Ма, ЦЛ Ху ет ал., "Антиостеопоротичка активност и састојци Подоцарпиум подоцарпус," Пхитомедицине, вол. 22, бр. 1, стр. 94–102, 2015.

[6] СА Јанг, ХС Сонг, ЈЕ Квон, ет ал., "Протокатехуинска киселина ублажава губитак трабекуларне кости код мишева са овариектомијом," Оксидативна медицина и ћелијска дуговечност, вол. 2018, ИД чланка 7280342, 11 стр., 2018.

[7] АБ Абдел-Наим, АА Алгхамди, ММ Алгандаби, ет ал., "Рутин изолован из Цхрозопхора тинцториа појачава пролиферацију коштаних ћелија и маркере окоштавања," Оксидативна медицина и ћелијска дуговечност, вол. 2018, ИД чланка 5106469, 10 стр., 2018.

[8] Ј. Ваттанатхорн, Ц. Тхипкаев, В. Тхукхам-мее, С. Муцхимапура, П. Ваннанон и Т. Тонг-ун, „Екстракт листа Мориндацитрифолиа Л. штити од церебралне исхемије и остеопорозе у ин виво експерименталном моделу менопаузе“, Оксидативна медицина и ћелијска дуговечност, вол. 2018, ИД чланка 1039364, 13 стр., 2018.

[9] С. Сунгкаманее, Ј. Ваттанатхорн, С. Муцхимапура и В. Тхукхам-мее, "Антиостеопоротски ефекат комбинованог екстракта Морус алба и Полигонум одоратум," Оксидативна медицина и ћелијска дуговечност, вол. 2014, ИД чланка 579305, 9 стр., 2014.

[10] Ј. Лиу, З. Зханг, К. Гуо, И. Донг, К. Зхао и Кс. Ма, „Сирингин спречава губитак кости код мишева са овариектомијом преко ТРАФ6 посредоване инхибиције НФ-κБ и стимулације ПИ3К/АКТ , "Фитомедицина, вол. 42, стр. 43–50, 2018.

[11] ЦВ Лу, СК Хуанг, ТИ Лин и СЈ Ванг, "Ехинакозид, активни састојак Херба Цистанцхе, потискује епилептиформну активност у хипокампалним ЦА3 пирамидалним неуронима", Тхе Кореан Јоурнал оф Пхисиологи & Пхармацологи, вол. 22, бр. 3, стр. 249–255, 2018.

[12] Кс. Ксу, З. Зханг, В. Ванг, Х. Иао, и Кс. Ма, "Терапеутски ефекат цистанозида А на метаболизам костију мишева са овариектомијом", Молецулес, вол. 22, бр. 2, стр. 197, 2017.

[13] К. Алипиева, Л. Коркина, ИЕ Орхан и МИ Георгиев, "Вербаскозид – преглед његове појаве, (био)синтеза и фармаколошки значај", Биотецхнологи Адванцес, вол. 32, бр. 6, стр. 1065–1076, 2014.

[14] Уреднички комитет Кинеске фармакопеје, Фармакопеја Народне Републике Кине, Цхина Медицал Сциенце анд Тецхнологи Пресс, Пекинг, Кина, 10. издање, 2015.

[15] Х. Зханг, ВВ Ксинг, ИС Ли ет ал., "Ефекти традиционалног кинеског биљног препарата на остеобласте и остеокласте," Матуритас, вол. 61, бр. 4, стр. 334–339, 2008.

[16] Кс. Ма, Ј. Лиу, Л. Ианг, Б. Зханг, И. Донг и К. Зхао, „Циномориум сонгарицум спречава ресорпцију костију код пацова са овариектомијом путем РАНКЛ/РАНК/ТРАФ6 посредоване супресије ПИ3К/АКТ и НФ-κБ путеви", Лифе Сциенцес, вол. 209, стр. 140–148, 2018.

[17] КСК Ма, Т. Хан, Кс. Зханг, ет ал., "Каемпферитрин спречава губитак кости код пацова са овариектомијом," Пхитомедицине, вол. 22, бр. 13, стр. 1159–1162, 2015.

[18] ПЛ Лиао, ЦХ Ли, ЛС Тсе, ЈЈ Канг и ИВ Цхенг, „Процена безбедности производа здраве хране Цистанцхе тубулоса Меморегаин®: генотоксичност и 28-дневни тест токсичности поновљених доза,” Фоод анд Цхемицал Токицологи , вол. 118, стр. 581–588, 2018.

[19] ЦЦ Вонг, ХБ Ли, КВ Цхенг и Ф. Цхен, "Систематско истраживање антиоксидативне активности 30 кинеских лековитих биљака коришћењем теста антиоксидативне снаге редукције гвожђа", Фоод Цхемистри, вол. 97, бр. 4, стр. 705–711, 2006.

[20] Д. Сонг, З. Цао, З. Лиу, ет ал., "Цистанцхе десертицола полисахарид ослабљује остеокластогенезу и ресорпцију костију преко инхибиције РАНКЛ сигнализације и производње реактивних врста кисеоника," Јоурнал оф Целлулар Пхисиологи, вол. 233, бр. 12, стр. 9674–9684, 2018.

[21] ХД Лианг, Ф. Иу, ЗХ Тонг, ХК Зханг, и В. Лианг, "Цистанцхес Херба водени екстракт који утиче на серумски БГП и ТРАП и Смад1 мРНА, Смад5 мРНА, ТГФ- 1 мРНА и ТИЕГ1 Нивои експресије мРНА у болести остеопорозе", Молецулар Биологи Репортс, вол. 40, бр. 2, стр. 757–763, 2013.

[22] ТМ Ли, ХЦ Хуанг, ЦМ Су ет ал., "Екстракт Цистанцхе десертицола повећава формирање костију у остеобластима," Јоурнал оф Пхармаци анд Пхармацологи, вол. 64, бр. 6, стр. 897–907, 2012.

[23] Х. Лианг, Ф. Иу, З. Тонг, и З. Хуанг, "Ефекат воденог екстракта Цистанцхес Херба на губитак костију код пацова са овариектомијом," Интернатионал Јоурнал оф Молецулар Сциенцес, вол. 12, бр. 8, стр. 5060–5069, 2011.

[24] Ф. Ли, Кс. Ианг, И. Ианг, ет ал., "Антиостеопоротична активност ехинакозида код пацова са овариектомијом," Пхитомедицине, вол. 20, бр. 6, стр. 549–557, 2013.

[25] Х. Ниан, МХ Ма, СС Ниан и ЛЛ Ксу, "Антиостеопоротичка активност икариина код пацова са овариектомијом", Пхитомедицине, вол. 16, бр. 4, стр. 320–326, 2009.

[26] СР Фахми, АМ Солиман, АА Саиед и М. Марзоук, "Могући антиостеопоротски механизам екстракта Цицер ариетинум код пацова са овариектомијом", Међународни часопис за клиничку и експерименталну патологију, вол. 8, бр. 4, стр. 3477–3490, 2015.

[27] Р. Сваминатхан, "Биохемијски маркери коштаног обрта", Цлиница Цхимица Ацта, вол. 313, бр. 1-2, стр. 95–105, 2001.

[28] С. Мутхусами, И. Рамацхандран, Б. Мутхусами, ет ал., "Овариектомија индукује оксидативни стрес и нарушава антиоксидативни систем костију код одраслих пацова," Цлиница Цхимица Ацта, вол. 360, бр. 1-2, стр. 81–{4}}, 2005.

[29] ВЈ Боиле, ВС Симонет и ДЛ Лацеи, "Диференцијација и активација остеокласта", Натуре, вол. 423, бр. 6937, стр. 337–342, 2003.