Биомониторинг микотоксина у плазми пацијената са Алцхајмеровом и Паркинсоновом болешћуⅡ

2. Резултати и дискусија

2.1. ЛЦ-МС/МС анализа

Због својих различитих физичко-хемијских карактеристика, микотоксини су подељени за хроматографско раздвајање у две групе (видети одељак о материјалима и методама). На следећим сликама (Слике 1–4) приказани су суперпонирани екстраховани хроматограми микотоксина у калибраторима и узорак плазме (кодификован као узорци 1–4), пре и после ензимског третмана. Као што се може видети, ОТА се појављује у узорцима пре и после ензимског третмана (Слика 1; Слика 3); док се СТЕР појављује тек након ензимског третмана (слика 3). Ниједан од других анализираних микотоксина није откривен у узорцима плазме.

Свака од калибрационих кривуља коришћених у квантификацији микотоксина је испунила критеријуме претходно дефинисане током валидације методе. Примери добијених калибрационих кривуља за сваки микотоксин приказани су у табелама С1 и С2. Идентитет једињења је такође процењен: квалификациони (к) и квантификациони (К) прелази за сваки откривени микотоксин су уочени код сваке од појединаца и позитивних узорака, а добијена релативна грешка (РЕ) између вредности к/К односа за сваки микотоксин у калибраторима и узорцима био је мањи од 20 процента [32]. Поред тога, времена задржавања се нису разликовала у узорцима и калибраторима за више од 2,5 процената [33] (1,3 процената за ОТА пре и 1,6 процената после ензимског третмана; 0,3 процената за ОТБ и 1,8 процената за СТЕР).

2.2. Узорци плазме

Укупно 93 испитаника, укључујући 25 здравих контрола (ЦНТ) и 68 пацијената, регрутовано је из неуролошке службе у болници Сан Педро у Ла Риохи (Шпанија). Контролни донатори су били неповезани сапутници пацијената без очигледних или дијагностикованих неуролошких болести. Пацијенти су подељени по патологијама: 44 болесника са ПД и 24 са АД.

Цлицк то цистанцхе тубулоса капсуле за Алцхајмерову болест и Паркинсонову болест

Дијагнозу и прогресију болести регрутованих пацијената спровели су стручњаци неуролози према Хоехн и Иахр (ХИ) скали за ПД (Табела С3) и Глобалној скали погоршања (ГДС) за АД (Табела С4). Сви пацијенти са АД већ су показали клиничке знаке благог когнитивног опадања или деменције (од 3 до 7, ГДС скала). Пацијенти са ПД су подељени у две групе пошто је прогресија болести била различита међу пацијентима са појединцима који нису показивали поремећене постуралне рефлексе (1 и 2, ХИ скала) и други који су већ показивали поремећене постуралне рефлексе (од 2,5 до 3, ХИ скала).

Међутим, због малог броја узорака, статистичка анализа пацијената са ПД је спроведена као једна група. Број субјеката уписаних за сваку групу и подгрупу је приказан, заједно са полом, старосним опсегом и прогресијом болести, у Табели 1. Комплетне појединачне информације о субјектима ангажованим за студију дате су у допунским материјалима (Табеле С5 и С6).

2.3. Присуство микотоксина

Од 19 процењених микотоксина, у узорцима су откривени само ОТА, ОТБ и СТЕР. ОТА је био присутан пре и после третмана смешом глукуронидаза/арилсулфатаза, док је ОТБ био детектован само пре, а СТЕР се појавио тек после ензимског третмана. Треба напоменути да је због ограничене запремине неких узорака, евалуација након ензимског третмана била могућа само за 74 од 93 прикупљена узорка.

Аналитички резултати добијени за ОТА, ОТБ и СТЕР сумирани су у табели 2. Због потврде критеријума идентификације (к и К прелаза треба да буду присутни и упоређени са калибраторима РЕ за оба, к/К однос и време задржавања, које треба да бити < 20 процената или 2,5 процената, респективно), узорци са вредностима већим или једнаким ЛОД-у коришћени су за анализу руковања подацима. Због тога су прорачуни обављени применом методе замене доње границе [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>ЛОД) у узорцима обрађеним пре ензимског третмана. Што се тиче присуства ОТА, узорци испод ЛОД су пронађени у свим групама. Максимални ниво ОТА (8,81 нг/мЛ) одговарао је жени старој 66 година у контролној групи. Што се тиче контролне популације, ОТА и ОТБ су били присутни у 92% и 24% узорака.

Ови резултати су у сагласности са недавном студијом спроведеном у Навари, суседном региону у Шпанији. У тој студији, ОТА је била присутна у 97,3 процента, а ОТБ у 10 процената узорака (н=438) [35] мерених истом методом као и она примењена у тренутној студији [36]. У овој студији, средњи нивои ОТА (2,15 нг/мЛ) су нешто испод оних измерених у Навари (2,87 нг/мЛ). Нивои ОТА су се кретали од ЛОД до 8,81 нг/мЛ, док се у узорцима из Наваре концентрација ОТА кретала између ЛОД и 19,9 нг/мЛ (са узорком који је достигао 45,7 нг/мЛ код 66-годишње жене).

Што се тиче пола, а такође у складу са Наварра студијом [35], могло се приметити да су средње вредности ОТА пре ензимског третмана биле веће код мушкараца него код жена у свим групама. Иако је проценат ОТА позитивних узорака у складу са претходним студијама спроведеним у Шпанији, средњи и максимални нивои ОТА у ЦНТ популацији ове студије и недавне студије Наваре [35] су већи од оних у претходним студијама из Шпаније .

Како су ове информације добијене пре 2011. године, наши подаци подржавају потребу да се настави са биомониторингом нивоа микотоксина у општој популацији. Као што је раније примећено [35], ОТБ је био присутан у неколико узорака и увек се јавља заједно са ОТА (осим једног ЦНТ човека). Изненађујуће, ОТБ није откривен у АД групи. ОТБ је дехлоровани аналог ОТА и није мерен у до сада спроведеним студијама биомониторинга на људима.

ОТБ може бити присутан у људским узорцима јер је познато да је присутан у неким матрицама хране, као што је вино [37], али може бити и људски метаболит ОТА [38]. Нажалост, у овој студији, немогуће је направити разлику између могућих извора ОТБ-а или знати да ли би одсуство ОТБ-а у АД групи могло бити последица другачијег обрасца конзумирања хране код пацијената или различитог метаболизма због болести, или ако је то због малог броја анализираних узорака. Анализа података након ензимског третмана показала је да је ОТА и даље детектован (89 одсто узорака).

Штавише, као што је раније примећено код здравих донатора из Наваре [35], СТЕР се појавио у већини узорака (88 процената), док ОТБ више није детектован. Када се пореди присуство ОТА пре и после ензимског третмана, проценат позитивних узорака пре ензимског третмана у ЦНТ је био већи него код пацијената; док је након ензимског третмана присуство ОТА смањено за ЦНТ док се повећало код пацијената са АД и ПД. Неки аутори подржавају хипотезу да се ОТА коњугати могу формирати током људског метаболизма [39–41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>ЛОД) у 88 одсто анализираних узорака. Ови подаци подржавају хипотезу да се СТЕР-глукурониди формирају током метаболизма људи [35,42].

2.4. Статистичка анализа

Према аналитичким резултатима, статистички прорачуни су рађени само за ОТА и СТЕР. ОТБ није укључен у статистичку анализу јер је само 12 узорака (13 процената) било веће или једнако ЛОД. Хипотеза дистрибуције нормалности (Схапиро–Вилков тест) је одбијена, па су за статистички третман коришћени непараметарски тестови који не подразумевају никакву претпоставку дистрибуције. СТЕР је откривен тек након ензимског третмана, па је статистичка анализа за СТЕР извршена на 74 доступна резултата добијена након ензимске дигестије. С друге стране, за ОТА су била доступна два скупа података, један који је добио податке обраде пре ензимског третмана и онај добијен после ензимског третмана (тј. ОТА пре и после).

Због непотпуности ОТА након скупа података (74 записа), одлучено је да се изврше статистички прорачуни узимајући у обзир само ОТА пре скупа података (93 записа). Да би се потврдила одлука да се искључи ОТА након скупа података, спроведен је Вилцоконов тест подударних парова потписаних рангова да би се истражиле могуће разлике између упарених резултата ОТА пре и после скупова података.

Тест није истакао никакву значајну разлику када се примени на вредности ОТАпре и ОТА после укупне групе становништва (н=74, з=−1,438, п-вредност=0,1503), што потврђује да комплетан скуп података ОТАбефоре одговара статистичким проценама. Као што је раније поменуто, нису доступне претходне студије које прате микотоксине у узорцима плазме пацијената са ПД или АД. Стога, да би се обухватиле све могуће разлике и асоцијације нивоа концентрације ОТА и СТЕР између група и подгрупа, спроведен је Вилцокон тест збира ранга или Крускал-Валлисов тест за поређење са више варијабли.

Поред тога, могуће разлике са статистичком значајношћу истражене су поделом група по полу и болести (пацијенти са ПД и АД), такође узимајући у обзир стадијум болести (ХИ или ГДС скала). Резиме свих разлика, које су биле статистички значајне (п-вредност < 0.050) када се упореде ОТА или СТЕР дистрибуције међу групама, између ЦНТ и групе пацијената (у целини и као ПД и АД групе), између полова и међу групама у сваком полу и пол варијабли, приказани су у табели 3.

Утврђено је да су разлике између нивоа дистрибуције ОТА статистички значајне када се упореде ЦНТ групе, ПД и АД, али ова разлика (п-вредност=0.0447) је вођена поређењем ПД/АД (п- вредност=0.0114), што је ПД група пацијената коју карактеришу веће вредности. Приликом разматрања стадијума болести, упоређујући дистрибуције ПД подгрупе 1 и ПД подгрупе 2, није уочена разлика, што указује да у групи ПД стадијум болести не утиче на разлику у дистрибуцији. У поређењу полова, упоређени нивои ОТА мушкараца и жена дали су статистичке разлике било код свих испитаника или у групи пацијената (ПД плус АД), при чему су мушкарци увек показивали више нивое од жена.

Дакле, дистрибуције ОТА се не разликују у поређењу са ЦНТ и групама пацијената, али се чини да пол може деловати као покретач разлика у дистрибуцијама нивоа ОТА више него дијагноза болести. Осим тога, у испитивању разлика у ОТА дистрибуцијама за мушкарце и жене одвојено, међу групама (ЦНТ, ПД, АД) тест није показао никакву разлику.

Статистичка анализа нивоа СТЕР између ЦНТ и групе пацијената је показала статистички различите дистрибуције (п-вредност < 0.0001), при чему су вредности ЦНТ биле ниже. ЦНТ/ПД/АД група је показала статистички различите дистрибуције (п-вредност=0.0001), а разлика је такође потврђена упоређивањем ЦНТ/ПД и ЦНТ/АД (п-вредност < 0,0001 у оба случаја), са медијана ниже вредности у АД групи.

Због тога је у СТЕР нивоима дистрибуција ЦНТ групе увек била различита у поређењу са пацијентима и групама болести. Приликом поређења родне дистрибуције, између мушкараца и жена, истакнута је било каква статистичка разлика, нивои СТЕР код мушкараца и жена појединачних група су били различити у свим поређењима (ЦНТ/ПД/АД, ЦНТ/група пацијената, ЦНТ/ПД, ЦНТ/АД), а мушкарци и жене у ЦНТ групи су увек били нижи него у групама пацијената.

Ово сугерише да дијагноза болести може утицати на дистрибуцију нивоа СТЕР. Разлике између нивоа концентрације ОТА и СТЕР су такође истражене поређењем дистрибуције две групе пацијената (ПД и АД) у сваком полу (код мушкараца и жена) и поређењем скале болести, ГДС у групи пацијената са АД и ХИ скале у група пацијената са АД, и није било статистичке разлике. Ни ОТА ни СТЕР дистрибуција нису показале никакву разлику у поређењу са ХИ скалом као бинарном променљивом ХИ_д=0 (ПД подгрупа 1, ХИ скала у опсегу 1–2) и ХИ{{6 }}д=1 (ПД подгрупа 2, ХИ скала у опсегу 2,5–3).

Дакле, упоређујући понашање дистрибуције ОТА и СТЕР, прецизирано је да су ОТА разлике унутар пола (са М > В) и унутар група пацијената (ПД > АД), а у свим поређењима је уочена значајна статистичка разлика. Што се тиче СТЕР-а, разлике у дистрибуцијама се региструју ради поређења ЦНТ и групе пацијената (група пацијената > ЦНТ), а све процене су увек тестирале статистичку разлику. С друге стране, два испитана микотоксина нису нагласила никакву разлику кроз истраживање унутар подгрупа пацијената и/или стадијума болести.

Колико нам је познато, ниједна друга студија није доступна за упоређивање нивоа микотоксина код пацијената са неуродегенеративним обољењима. Међутим, неки аутори су сугерисали потребу да се даље процени улога микотоксина у погоршању клиничких манифестација поремећаја из аутистичног спектра [43,44].

Заиста, аутори су истакли статистички значајне разлике у поређењу микотоксина (ДОН, ДОМ-1 у урину и АФМ1, ОТА и ФБ1 у плазми) између аутистичне и контролне групе деце. Резултати ове студије су такође у складу са новијом студијом наше групе [45], у којој је утврђено да су инциденција ОТА и концентрације у плазми веће код деце контролне групе него код деце са аутистичним спектром или поремећајима хиперактивности дефицита пажње.

Што се тиче утицаја пола, а према резултатима ове студије, у већини објављених студија, нивои ОТА у плазми мушкараца су били виши него код жена [46]; иако Варенсјо и др. (2020) код шведских адолесцената [47], и Цоронел ет ал. (2011) [48] нису пронашли разлике у нивоима ОТА у плазми између мушкараца и жена. Коначно, да би се проценио однос између нивоа ОТА и СТЕР у плазми и варијабле старости, израчунат је Спеарманов коефицијент корелације ранга (рхо).

Сви рхо са статистичком значајношћу (п-вредности < 0.050) сумирани су у табели 4. Генерално, нађене су слабе негативне и позитивне корелације: ОТА и СТЕР слабо корелирају са годинама. Конкретно, нивои ОТА опадају са годинама (негативна корелација, рхо < 0), а вредност рхо расте када се изабере ПД група или група мушкараца; осим тога, вредност рхо је још већа када се изаберу вредности мушкараца у групи ПД. Насупрот томе, СТЕР корелације су позитивне и статистички су значајне када је одабрана женска група.

Да би се приказале уочене корелације, дијаграми распршености ОТА/мушкарци у групи пацијената са ПД и СТЕР/жене код свих субјеката приказани су на слици 5. Они приказују дијаграм распршења са две варијабле за токсине и старост, а постављена линија помаже да се визуелизује корелација.

Механизам Цистанцхеовог лечења Паркинсонове болести и Алцхајмерове болести

Цистанцхе је традиционална кинеска биљка која се годинама користи због својих потенцијалних здравствених користи. У недавним студијама је откривено да Цистанцхе може имати неуропротективне ефекте и може бити ефикасан у лечењу Алцхајмерове болести (АД) и Паркинсонове болести (ПД).

Механизам Цистанцхеа у ефикасном лечењу АД и ПД приписује се његовим активним компонентама, као што су ехинакозид, актеозид и цистанозиди. Верује се да ова једињења имају антиоксидативна и антиинфламаторна својства која могу смањити оксидативни стрес и упалу у мозгу, који су повезани са развојем и напредовањем неуродегенеративних болести.

Цистанцхе такође може подстаћи раст нервних ћелија и побољшати когнитивне функције повећањем нивоа неуротрофног фактора који потиче из мозга (БДНФ), протеина који игра кључну улогу у расту и одржавању неурона. Поред тога, показало се да Цистанцхе смањује -амилоидне плакове, који су обележја Алцхајмерове болести, и смањује акумулацију -синуклеина у мозгу, што је повезано са Паркинсоновом болешћу.

Све у свему, потенцијалне терапијске предности Цистанцхеа у лечењу АД и ПД су обећавајуће, али су потребне даље студије да би се разјаснили његови тачни механизми деловања и потврдила ефикасност и безбедност у клиничким условима.

наставиће се...

Беатриз Арце-Лопез 1 , Лидија Алварез-Ервити 2 , Барбара Де Сантис 3 , Марија Изко 2 , Силвија Лопез-Калво 4 , Марија Еугенија Марзо-Сола 4 , Франческа Дебегнах 3 , Елена Лизарага Лопез 15, 6 Елена Гонзалез-Пенас 1,† и Ариане Веттораззи 5,6,* ,†

1 Департман за фармацеутску технологију и хемију, Истраживачка група МИТОКС, Факултет за фармацију и исхрану, Универсидад де Наварра, 31008 Памплона, Шпанија; barce@alumni.unav.es (БА-Л.); elizarraga@unav.es (ЕЛ); mgpenas@unav.es (ЕГ-П.)

2 Лабораторија за молекуларну неуробиологију, Центар за биомедицинска истраживања Ла Риохе (ЦИБИР), Пикуерас 98, 3. спрат, 26006 Логроно, Шпанија; laerviti@riojasalud.es (ЛА-Е.); mizco@riojasalud.es (МИ)

3 Национална референтна лабораторија за микотоксине и биљне токсине, Иституто Супериоре ди Санита, 00161 Рома, Италија; barbara.desantis@iss.it (БДС); francesca.debegnach@iss.it (ФД)

4 Сервицио де Неурологиа, Хоспитал Сан Педро, Пикуерас 98, 26006 Логроно, Шпанија; slcalvo@riojasalud.es (СЛ-Ц.); memarzo@riojasalud.es (МЕМ-С.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain