Јачање антиканцерогене активности таксола Аспергиллус Фавус "ендофит јојобе" преко коњугације са златним наночестицама посредованим зрачењем
May 30, 2023
Такол Алтернативе Цхинесе Хербс Цистанцхе
Кључне речи:Аспергиллус фавус · Јојоба · Ендофитне гљиве · Златне наночестице · Таксол · -Зрачење · Оптимизација исхране
Увод
Таксол је један од најкомерцијалнијих широког спектралекови против рака[1]. Активност таксола произилази из његове јединствене специфичности за везивање са хетеродимером ћелијске подјединице тубулина, промовишући полимеризацију тубулина, чиме се нарушава митотичка деоба туморских ћелија [2]. Таксол је показао снажну активност против рака дојке, плућа, главе и врата, рака материце и напредних облика Капосијевог саркома [3]. Таксол је прво произведен од коре стабала тисе Такус бревифолиа „породица Такацеае“ [4, 5]; међутим, нижи принос таксола то биће<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as астма,упала, ирак[32]. Стога је главни циљ овог рада био да се истражи нови изолат гљивица из биљке јојобе са јединственом метаболичком стабилношћу за производњу таксола, да се процене различити приступи за максимизирање њиховог приноса таксола, као и да се побољша антипролиферативна активност екстрахованих једињења таксола. преко коњугације са златним наночестицама, посредованом гама зрачењем.
Материјал и методе
Изолација и култивисање ендофитних гљива
Различити делови јојобе (Симмондсиа цхиненсис) као листови, кора, гранчице и пупољци сакупљени су са Пољопривредног факултета Универзитета у Каиру и коришћени као извор за ендофитске гљиве. Делови биљке су сакупљени и испрани под текућом водом из славине, површина стерилизована 70% етанолом у трајању од 1 мин, а затим испрана стерилном водом [28]. Површински стерилисани делови биљке су исечени на мале комаде у стерилним условима и стављени на плоче са медијумом од кромпир-декстрозног агара (ПДА), Цзапек'с-Док и агар медијума са екстрактом слада [33–36], а плоче су инкубиране на 30 степени. 10 дана. Ефикасност површинске стерилизације делова биљке је процењена центрифугирањем воде за испирање, затим је талогу додато 500 ул стерилне воде и постављено у ПДА медијум [37]. Пречишћени изолати ендофитних гљивица су инокулисани на ПДА коси током 7 дана и чувани на 4 степена
Скрининг, екстракција и квантификација таксола из ендофитних гљива
Опорављене ендофитне гљиве које настањују јојобу су тестиране на производњу таксола узгајањем на чорби кромпирове декстрозе (ПДБ) [38]. По један чеп сваког од 7 дана старих изолата гљивица инокулиран је у 100 мл ПДБ/250 мл Ерленмајер задатака, инкубиран 15 дана на 30±1 степен, под условима мућкања (120 рпм). После инкубације, културе су филтриране, а филтрат је допуњен са 0,2 процента натријум бикарбоната да би се исталожиле масне киселине. Таксол је екстрахован дихлорометаном, а органска фаза је сакупљена и упарена до сува, а остаци су поново растворени у метанолу [17, 39]. Таксол је одвојен и идентификован ТЛЦ коришћењем Мерцк 1 мм (20×20 цм) претходно обложених плоча од силика гела (ТЛЦ Силица гел 60 Ф254, Дармстадт, Немачка), детектован УВ осветљењем на 254 нм [39]. Претпостављене тачке таксола су остругане са плоча ТЛЦ силика гела и растворене у метанолу, снажно вортексиране 10 мин и центрифугиране на 1000 рпм током 5 мин. Преципитиране честице силицијум диоксида су уклоњене, а супернатант је узет за квантификацију таксола и проверу чистоће помоћу ХПЛЦ (ИОУНГ Ин, Цхромасс, 9110 плус Куатернари Пумп, Кореја) колоне Ц18 реверзне фазе (Ецлипсе Плус Ц18 4).6 ×150 мм, 3,5 μм, кат. бр. 959,963–902). Коришћена је мобилна фаза метанол/ацетонитрил/вода (25:35:40, в/в/в) брзином од 1,0 мл/мин током 20 мин [40], а фракције таксола су мерене на 227 нм, а њихова хемијски идентитет и концентрације потврђени су из времена задржавања и површине апсорпционог максимума у поређењу са аутентичним узорком.
Морфолошка и молекуларна идентификација обновљених ендофитских гљива
Изолати ендофитних гљивица идентификовани су до нивоа њихове врсте на основу њихових макро и микро-морфолошких карактеристика гајењем на ПДА, Цзапек'с-Док и медијуму екстракта слада према референтним кључевима [33–36]. Идентитет најјачих гљивичних изолата који производе таксол додатно је молекуларно потврђен на основу секвенце унутрашњег транскрибованог размакнице (ИТС) [41, 42]. Гљивична геномска ДНК (гДНК) је екстрахована уситњавањем мицелија (~0.2 г) у течном азоту, затим дозирањем у 1 мл ЦТАБ пуфера за екстракцију (2 процента ЦТАБ, 2 процента ПВП40, { {21}}.2 процента 2-меркаптоетанола, 20 мМ ЕДТА, 1,4 М НаЦл у 100 мМ Трис-ХЦл, пХ 8,0). ПЦР сетови прајмера били су ИТС4 5′-ГГААГТААААГТЦГТ ААЦААГГ-3′ и ИТС5 5′-ТЦЦТЦЦГЦТТАТТГАТАТГЦ-3′. ПЦР реакција садржи 10 ул 2×ПЦР мастер смеше (и-Так™, кат. бр. 25027), 2 ул гДНК, 1 ул сваког прајмера (10 пмол/ул) и допуњена до 20 ул стерилном дестилованом вода. ПЦР је програмиран на почетну денатурацију на 94 степена у трајању од 2 минута, денатурацију на 94 степена током 30 с, жарење на 55 степени током 10 с, продужавање на 72 степена за 30 с током 35 циклуса и коначно продужење на 72 степена током 2 мин. ПЦР ампликони су анализирани са 1,5 процентним агарозним гелом у 1×ТБЕ пуферу (Амбион Цат# АМ9864), коришћењем 1 кб ДНК лествице (кат. # ПГ010-55ДИ) и визуелизовани помоћу система за документацију гела. Ампликони су пречишћени и секвенционирани помоћу Апплиед Биосистемс Секуенцер, ХиСКВ Басес, верзија 6.0 са истим сетовима прајмера. Добијене секвенце су БЛАСТ претраживане без редундантности у бази података НЦБИ, увезене у софтвер МЕГА 6.0 и усклађене са алгоритмом мишића Цлустал В [43], а филогенетско стабло је конструисано методом спајања суседа МЕГА 6.0 [44].
Хемијска структура екстрахованог таксола
Претпостављене тачке таксола су састругане са ТЛЦ плоча од силика гела и пречишћене, а чистоћа и концентрација су одређене УВ-Вис анализама на λ 227 нм (РИГОЛ, Ултра-3000 серија) у поређењу са аутентичним таксолом [39]. Празни медијуми под истим условима коришћени су као негативна база за спектрофотометријске анализе. ФТ-ИР спектар пречишћених узорака таксола анализиран је спектрофотометром ЈАСЦО ФТ-ИР 3600. Узорак таксола је млевен са КБр гранулама, утиснут у дискове под вакуумом, а апсорпција је мерена у подручју од 400 до 4000 цм−1 [3] у поређењу са аутентичним. Хемијска структура екстрахованог таксола је потврђена из ХНМР спектроскопије (ЈЕОЛ, ЕЦА-500ИИ, 500 МХз НМР) у поређењу са аутентичним таксолом. Узорци су растворени у ЦДЦл3, хемијски помаци су дати у ппм (δ-скала), а константе купловања изражене у херцима (Хз).
Утицај различитих врста медија на производњу таксола
Два агар чепа (9 мм) из 7 дана старих култура сваког изолата гљивице инокулисана су у три примерка у 100 мл медијума/250 мл Ерленмајер боце кромпирове декстрозе (ПДБ), Цзапекс-Док (ЦЗД), М1Д и екстракта слада (МЕ ) бујон медијум. Као негативна контрола коришћене су ненокулисане контроле из сваке средине без спора гљивица, инкубиране на 30 степени 15 дана под истим условима. После инкубације, културе гљива су филтриране, а таксол је екстрахован и одређен као што је горе поменуто.
Биопроцесна оптимизација нутритивних услова за максимизирање приноса таксола
Оптимизација састава медијума за максимизирање приноса таксола снажним изолатом гљивица спроведена је методологијом површине одговора коришћењем Плацкет-Бурман дизајна праћеног централним композитним дизајном [17–20, 45]. Из дизајна РСМ-а, позитивне и значајне варијабле које утичу на производњу таксола од стране моћног изолата гљивице процењене су коришћењем статистичког софтверског пакета Десигн-Екперт 7.0 (Стат Еасе Инц., Минеаполис, САД). Сваки експеримент је изведен у три биолошка понављања и узете су у обзир средње вредности. После инкубације у жељеним условима, биомаса гљива је филтрирана, а таксол је екстрахован и квантификован помоћу ТЛЦ и ХПЛЦ као што је горе описано.
Плацкет-Бурман дизајн
Плацкет-Бурман дизајн се често користио за оптимизацију компоненте медија за раст гљивица и производњу биоактивних секундарних метаболита, процењујући значајне варијабле које утичу на производњу таксола [18, 20, 46]. Избор фактора је био заснован на медијуму који се користи у квалитативном и квантитативном скринингу. Укључено је једанаест фактора; Екстракт слада, пептон, сахароза, сојтон, глутамин, екстракт говедине и вредности и фактори температуре, пХ, времена инкубације и брзине мућкања варирали су на два нивоа, а изабрани су распони минималног и максималног нивоа. Статистички Десигн-Екперт 7.0 је коришћен за генерисање скупа од 12 експеримената. За сваки експеримент, производња таксола је одређена у три биолошка понављања и узет је у обзир просек приноса таксола.
Регресиона анализа података је спроведена коришћењем статистичког софтвера. Ефекат сваке варијабле је израчунат (Биометрика, 2020), користећи следећу једначину:
где је Е ефекат променљиве за тестирање, М плус и М− су концентрација таксола у испитивањима при којој је параметар био на вишем и нижем нивоу, респективно, а Н је број експеримената који су спроведени. Утицај сваке варијабле на производњу одређен је израчунавањем њихових одговарајућих Е-вредности.
Где је Тот хигх укупан број одговора на високом нивоу, Тот лов је укупан број одговора на ниском нивоу, а Не је број испитивања.
Централни композитни дизајн и интеракције између фактора који утичу на производњу таксола
Најзначајнији позитивни фактори који утичу на производњу таксола одабраним изолатом гљивице оптимизовани су коришћењем експерименталног дизајна ЦЦД модела површине одговора [47]. Коришћењем ЦЦД-а оптимизоване су концентрације компоненти медијума, а њихове проучаване интеракције су коришћене за генерисање укупно 20 експеримената за три варијабле. Да би се одредили оптимални нивои варијабли за производњу таксола из снажног изолата гљивице, уцртане су тродимензионалне (3Д) површинске криве одговора да би се проучавала интеракција између различитих фактора и да би се одредило променљиво стање сваког фактора који утиче на производњу таксола. 3Д графикони су изведени тако што су константе три фактора држане на идеалном нивоу и графиком добијени одговор приноса таксола за различите нивое друга два фактора.
Ефекат гама зрачења на принос таксола
Снажни ендофитски изолати који производе таксол били су изложени -зрачењу са 60извором кобалта (гама ћелија 4000-А-Индија) при различитим дозама гама зрачења (0.25–3.0 кГи) у поређењу на контролу неозрачене културе; брзина дозе 1,2 кГи/х у време експеримената. Оптимизовани медијуми су инокулисани озраченом културом у стандардним условима културе, у поређењу са инокулумом неозрачених спора као контролом. Културе су инкубиране на 30±2 степена током 15 дана на ротационој мешалици (120 рпм). После инкубације, културе су филтриране и таксол је екстрахован, пречишћен и квантификован помоћу ТЛЦ и ХПЛЦ као што је горе описано.
Синтеза и карактеризација наночестица злата (АуНПс); Коњугација са таксолом
Антиканцерогена активност таксола
Активност пречишћених коњугата таксола и таксол-ПВП-АуНП против карцинома јетре (ХПГ2) и карцинома дојке (МЦФ7) одређена је помоћу 3- (4,5-диметилтиазол- 2-ил) -2,5- тест дифенил тетразолијум бромида (МТТ) [48]. 96-Плоча за бунар је засејана са 103 ћелије по бунарчићу и инкубирана преко ноћи на 37 степени, затим су додане различите концентрације лека и плоче су поново инкубиране 48 х. Додат је МТТ реагенс (25 ул) и инкубиран 2 х, а љубичаста боја развијеног формазанског комплекса је измерена на λ570 нм. Вредност ИЦ50 је изражена количином лека која је смањила раст од 50 процената почетног броја туморских ћелија које су се нормализовали у позитивну контролу.
Антимикробна активност таксола и коњугата таксол-АуНПс
Антимикробна активност таксола и таксол-АуНПс коњугата је процењена против различитих бактеријских изолата; Бациллус субтилис АТЦЦ 6633 и Стапхилоцоццус епидермидис, Псеудомонас аеругиноса, Есцхерицхиа цоли и Ентеробацтер аггломеранс, поред Цандида албицанс. Тестиране бактеријске ћелије су суспендоване у стерилној пептонској води да би се добио стандардни инокулум од ~0.5 МцФарланд (1–1,5)× 1{{10}}8 ЦФУ/мл на λ6{{18 }}0 нм. Инхибиција раста (мм) раста микробних патогена је процењена методом дифузије диска агар. Као позитивне контроле коришћени су стерилни стандардни антибиотски дискови пречника 6,0 мм. Стерилни дискови антибиотика (6,0 мм) су напуњени са 20 ул метанола и амоксицилин-клавуланске киселине (АМЦ) као негативна и позитивна контрола. Дискови су напуњени истом концентрацијом таксола, таксол-ПВП-АуНПс и АуНПс (1,0 уг/мл). Припремљене су три биолошке реплике. Плоче су инкубиране на 37 степени током 24 х и мерене су зоне инхибиције. Амоксицилин клавуланска киселина (АМЦ) и нистатин су коришћени за нормализацију антимикробне активности таксола. Зона инхибиције раста одређена је калипером (мм).
Статистичке анализе
Фисхерова најмање значајна разлика пост хоц теста.
Таложење гљивица
Резултати
Изолација ендофитних гљива из јојобе; Скрининг за производњу таксола
Из коре, гранчица, листова и пупољака јојобе добијена су 24 изолата ендофитних гљивица на ПДА, ЦЗД и МЕ медијуму. Ови изолати гљивица су добијени из коре (6 изолата), гранчица (7 изолата), листова (4 изолата) и пупољака (7 изолата) као што је забележено у Табели 1. Ови изолати гљивица су првобитно идентификовани на нивоу њихове врсте на основу њиховог морфолошког карактеристике према универзалним кључевима, који припадају три рода, а то су Аспергиллус, Пенициллиум и Фусариум. Међу овим изолатима пријављена је преваленца рода Аспергиллус (83,4 одсто), док су Фусариум и Пенициллиум заступљени са 8,3 одсто. Род Аспергиллус је био заступљен са пет врста и то А. фавус (3 изолата), Аспергиллус оризае (5 изолата), А. нигер (5 изолата), А. фумигатус (4 изолата) и А. терреус (3 изолата). Продуктивност таксола од добијених изолата гљивица је процењена гајењем на ПДБ, инкубацијом у стандардним условима, екстракцијом и квантификацијом таксола помоћу ТЛЦ и ХПЛЦ (слика 1). Из резултата, максималну продуктивност таксола је забележила А. фавус Бд1 (88,65 µг/л), затим П. полонијум Бр1 (54,42 µг/л), А. нигер Лв1 (43,95 µг/л), А. оризае Бд1 (38,87 µг/л), Ф. окиспорум Тв1 (26,80 µг/л), А. нигер Лв2 (23.01 µг/л) и А. фумигатус Бд2 (17,62 µг/ л). Структурни хемијски идентитет таксола од највећих произвођача гљивица откривен је из њихових УВ-Вис спектра, у поређењу са хемијским спектром аутентичног таксола. Поред тога, хемијска структура таксола екстрахованог из четири најмоћнија изолата гљивица је потврђена ФТ-ИР анализама (слика 1). Занимљиво, екстраховани таксол из моћних изолата гљивица показао је исту спектралну парадигму аутентичног таксола. Пик на 3393,3 цм-1 је додељен за хидроксил (ОХ). Док су пикови на 2923,5 приписани алифатском ЦХ истезању, пикови на 1661.0 цм−1 одговарају Ц=О фреквенцији истезања. Уочени пик на 1452,0–1404,0 цм−1 настао је због фреквенције НХ истезања. Фреквенција истезања карбонилне групе-кисеоник примећена је на 1109 цм−1. Уочени пикови у опсегу 1020–979,7 цм−1 настали су због присуства ароматичних Ц и Х кривина. Из хроматографске и спектралне анализе може се закључити да је екстраховани таксол идентичан аутентичном. Очигледно, метаболичка активност исте врсте гљивица је била у великој мери флуктуирана са различитим биљкама, обезбеђујући јединствену биолошку интеракцију и ослобађање специфичних сигнала из биљног дела да би се покренула експресија машинског система биосинтезе таксола. Занимљиво је да флуктуација у метаболичком систему не зависи само од делова биљке већ и од интеракције изолат-изолат, на пример, принос таксола изолата А. нигер који насељавају листове јојобе био је 43,9 µг/л, док је принос Таксол је био нула за изолат А. нигер добијен из коре биљке.
Морфолошка и молекуларна идентификација моћних произвођача таксола
Морфолошке карактеристике снажног гљивичног изолата који производи таксол испитане су према макроскопском и микроскопском описном кључу, као што је описано у материјалима и методама, и откривена је његова морфолошка близина са А. фавус (слика 2). Изолат гљивице је узгајан на ПДА на 30 степени током 10 дана, а макроскопске и микроскопске карактеристике су откриле његов идентитет као што су конидијалне главе, начин гранања, идентитет стигме и конидијална онтологија и формирање плодних тела, према универзалним морфолошки кључеви [33], а утврђено је да су идентични Аспергиллус фавус. Потентни изолат А. фавус који производи таксол је даље идентификован на основу њихових ИТС секвенци, користећи гДНК као шаблон. ПЦР ампликони (~550 бп) А. фавус су раздвојени, пречишћени и секвенционирани (слика 2). ИТС секвенца А. фавус није сувишна претражена у бази података НЦБИ, показујући 99 процената сличности са А. фавус, са нула Е. вредности и 95 процената покривености упитима. Тако је из микроскопских и молекуларних анализа циљни изолат потврђен као А. фавус и депонован на ГенБанк са приступним бројем МВ485934.1, као и изолат је депонован у Миколошком центру Универзитета Асјут (АУМЦ), Египат са број депозита АУМЦ13892. Садашњи изолат је имао 99 посто сличности са изолатима А. фавус МВ485934, МТ446145, КЈ863514, МВ522551,
Слика 1 Морфолошки приказ биљке јојобе. Б Плочасте културе моћних ендофитских гљива које производе таксол; А. фавус Бд1 (13), А. нигер Лв1 (21), Пенициллиум полониум (23) и А. оризае Бд (25) на ПДА после 8 дана инкубације на 30 степени. Гљивични изолати су узгајани на ПДБ и инкубирани у стандардним условима, а таксол је екстрахован и проверен ТЛЦ (Ц). Д ХПЛЦ хроматограм таксола из потентних изолата гљивица. Е Принос таксола квантификован из ХПЛЦ. Ф, УВ-Вис спектрална анализа екстрахованог таксола из изолата гљивица. Г ФТ-ИР анализа екстрахованог таксола у поређењу са аутентичном
Слика 2 А Макроморфолошке карактеристике А. фавус ендофита јојобе после 3, 5 и 8 дана раста на ПДА. Микроморфолошке карактеристике, конидијална глава А. фавус са увећањем од 400к. Ц ПЦР ампликон А. фавус ИТС региона од 500 бп, нормализован на лествици од 1 кб (кат. бр. СМ0312). Д Филогенетска анализа ИТС А. фавус методом максималне вероватноће [44]
Тражи више:
Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com вхатсапп: плус 86 15292862950
