Кратко удисање севофлурана може смањити формирање глијалног ожиљка након хипоксично-исхемичне повреде мозга код новорођених пацова, део 2

ПЦР у реалном времену

Укупна РНК је екстрахована из хипокампалног ткива штенаца 12, 24 и 48 сати након операције коришћењем ТРИзолреагенса (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА). Комплементарна ДНК је синтетизована коришћењем напредног комплета Суперсцрипт ИИ РТ-ПЦР (Инвитроген).

Хипоксично-исхемијска повреда се односи на патолошко стање узроковано церебралном исхемијом, хипоксијом, метаболичким поремећајем и оштећењем нервних ћелија услед поремећаја кардиоваскуларног и цереброваскуларног система. Са друштвеним напретком и променом начина живота, хипоксично-исхемијске повреде постају све чешће. Ово стање може проузроковати много штете људском здрављу, укључујући утицај на нечију интелигенцију и памћење.

Иако хипоксија и исхемија могу изазвати пад функције мозга, то не значи да ће памћење бити негативно погођено. Напротив, можемо побољшати памћење и повећати ефикасност мозга помоћу правих метода. Ево неколико начина да побољшате своје памћење:

1. Здрава исхрана: Утицај исхране на памћење је веома важан. Храна богата протеинима, витаминима и минералима може помоћи у одржавању здравог нервног система и функције размишљања.

2. Вежбајте више: Физичке вежбе могу унапредити циркулацију крви, повећати проток кисеоника, побољшати имунитет тела и смањити ризик од болести. Вежбањем можете побољшати своју способност памћења.

3. Ојачајте самопоуздање: Самопоуздање је важан фактор у памћењу особе. Ако верујете да можете да извршите одређени задатак, лако ћете постићи жељене резултате, а можете и ефикасно да побољшате своје памћење.

Може се видети да хипоксично-исхемична повреда није стање које ће неизбежно повредити људско памћење. Све док владамо исправним методама и добро бринемо о свом мозгу, можемо прихватити здраву будућност са позитивним ставом. Види се да морамо побољшати памћење, а Цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење, јер Цистанцхе десертицола има антиоксидативна, антиинфламаторна и анти-агинг ефекта, што може помоћи у смањењу оксидације и инфламаторних реакција у мозгу, чиме се штити здравље нервног система. Поред тога, Цистанцхе десертицола такође може да подстакне раст и поправку нервних ћелија, чиме се побољшава повезаност и функција неуронских мрежа. Ови ефекти могу помоћи у побољшању памћења, учења и брзине размишљања, а такође могу спречити развој когнитивне дисфункције и неуродегенеративних болести.

Кликните на сазнајте начине за побољшање функције мозга

Флуоресцентна СИБР Греен И боја (СИБР Греен ПЦРМастер Мик, Апплиед Биосистемс, Фостер Цити, Калифорнија, САД) и 1 μЛ реверзно транскрибоване комплементарне ДНК коришћени су за детекцију синтезе ДНК ПЦР-ом у реалном времену са ХИФ-1 -специфичним прајмерима.

У систему за амплификацију ДНК гена ротора у реалном времену (Цорбетт Ресеарцх, Сиднеј, Аустралија), ПЦР је изведен са следећим циклусима: денатурација на 95 степени у трајању од 15 минута; 40 циклуса од 95 степени (20 секунди), жарење на 58 степени у трајању од 25 секунди , и повлачење на 72 степена у трајању од 35 секунди. Праћење флуоресцентног производа је вршено дуже време на 72 степена.

Софтвер за анализу гена ротора (Цорбетт Ресеарцх) је коришћен за стандардизацију ГАПДХ гена за одржавање и квантификацију релативне експресије гена. Све секвенце прајмера су приказане у табели 1.

Ниссл бојење
Мозгови пацова су припремљени у резове 28 дана након операције као што је горе описано за имунохистохемију. Сваки мозак је подељен узастопно, а три слична дела мозга су одабрана за Нисслово бојење.

Користећи Никон Ц1 дигиталну микроскопску камеру (Никон Цорпоратион, Токио, Јапан), снимљене су типичне микрофотографије хипокампалних ЦА1, ЦА3 и ДГ подручја. Неколико ћелија избројаних у свакој од три секције изведено је на слеп начин коришћењем софтвера ИмагеЈ.

Тестови понашања

Пацови су одбачени са 3 недеље, подељени у три до пет група и држани у кавезима према групи. Тестови понашања су спроведени на П28–П33 (тј. 21–26 дана након операције) пацовима, као што је претходно описано (Ванг ет ал., 2019а ) али са малом изменом. Да би се искључио утицај еструсног циклуса на понашање глодара, тестирани су само мужјаци пацова.

Моррис водени лавиринт

Тестирање Моррисовог воденог лавиринта је коришћено за процену способности просторног учења и памћења пацова П28–П33 (Ванг ет ал., 2019а).

Тестирање се састојало од две фазе укључујући секцију обуке и тест просторног претраживања. Током 5 узастопних дана, четири секције обуке су реализоване сваког дана почевши од 8:00х. За тестирање детекције платформе, 10 пацова из сваке групе појединачно је стављено у воду на различитим локацијама, стохастично, окренути према зиду базена.

Ако је пацов успешно открио платформу у року од 90 секунди, био је приморан да остане на платформи 20 секунди, а време потребно да детектује платформу је забележено као латенција за бекство. Сваки круг тестирања је трајао 90 секунди, а латенција бекства је мерена као време од стављања пацова у воду до успешног укрцавања на платформу.

Ако пацов није успео да пронађе платформу у року од 90 секунди, снимање је заустављено и извршено је учење и усмеравање памћења (експериментатор је користио дугачку шипку да води пацова до платформе и дозволио им да остану на платформи 20 секунди да би научили). Током теста, латенција бекства пацова који нису успели да уђу на сцену забележена је као 90 секунди.

У тесту просторне сонде спроведеном шестог дана тестирања, платформа је уклоњена и пацов је постављен у супротни квадрант и остављен је да плива 90 секунди. Брзина пливања, кашњење у бекству и број пута када су прешли место где се платформа раније налазила забележени су системом за видео праћење (Схангхаи МобилеДатум Лтд., Шангај, Кина).

Тест суспензије

Тест суспензије је изведен на пацовима П28–П32 да би се проценила њихова моторичка функција, почевши од 15 часова сваког дана. Ахоризонтални пластични конопац пречника 0.5 цм постављен је на удаљености од 45 цм од земље, а пацови су вођени да држе пластични конопац са оба горња уда, при чему је време до пада пацова мерено као латенција суспензије. Тест је завршен ако: (и) пацов падне; (ии) суспензија је била већа од 60 секунди; или (иии) је конопац захваћен задњим удовима.

Тест на отвореном терену

Тестирање на отвореном терену је спроведено на П28 пацовима користећи опрему на отвореном која се састоји од кутије од плексигласа (100 цм × 100 цм; Борј Санат, Техеран, Иран) окружене зидом високим 45- цм, са подом подељеним на 16 квадрата. Централна област је била површина од 50 цм × 50 цм у центру арене. Сваки пацов је појединачно стављен у центар арене и дозвољено му је да истражује без ограничења 10 минута.

Систем видео праћења (Борј Санат) је коришћен за снимање и анализу тоталитинерара (као индикатор активности вежбања) и времена проведеног у централном делу (као индикатор анксиозног понашања) (Зхаи ет ал., 2019).

Голгијево бојење

Након завршетка тестирања понашања (тј. 26 дана након операције), пет пацова је насумично одабрано из сваке групе. Голгијево бојење је изведено на 150- μм дебљине замрзнутих пресека мозга коришћењем ФД Рапид Голги Стаин Кит (ФДНеуроТецхнологиес, ​​Цолумбиа, МД, САД) у складу са протоколом произвођача.

ИмагеЈ софтвер је коришћен за анализу густине кичме (број кичме на 10 μм) сваког неурона. Бодље су избројане на два или три сегмента секундарног дендрита.

Статистичка анализа

СПСС 17.0 за Виндовс (СПСС Инц., Чикаго, ИЛ, САД) је коришћен за анализу података, који су приказани као средња вредност ± стандардна грешка средње вредности (СЕМ). Схапиро-Вилков тест је коришћен за тестирање претпоставке нормалности међу свим континуираним варијаблама. Поред тога, једносмерној анализи варијансе праћеној Тукијевим пост хоц тестовима вишеструког поређења приступило се у низу експеримената.

Ако подаци нису испунили претпоставку нормалности, Крускал-Валлис Х тест или Манн-Вхитнеи Утест су завршени одвојено. Латенција избегавања је анализирана на основу двосмерне анализе варијансе за итеративна мерења. П вредности < 0.05 сматране су статистички значајним.

Резултати

СПЦ побољшава губитак неуронских ћелија хипокампуса

Хипокампус, укључујући три испитивана региона, повезан је са учењем и памћењем (Јунг ет ал., 2020). Након тестирања понашања, извршено је Ниссл бојење да би се испитала архитектура хипокампуса.

У ХИ групи, витална неуроналгустина је смањена у поређењу са лажном групом. Међутим, број неурона је повећан код животиња изложених СПЦ; овај ефекат је поништио ИЦ-1, што је смањило густину неурона (слика 1А). Овај феномен је примећен у ЦА1, ЦА3 и ДГ регионима хипокампуса (П< 0.05; Figure 1B–D).

СПЦ побољшава и смањује дендритичну густину кичме у области ЦА1 хипокампуса

Голгијево бојење је коришћено за откривање ЦА1 пирамидалне неуроналдендритске густине кичме (Слика 2А). Пошто су величине бодљи веома различите (нпр. разгранати дендрити, танки или печурки), утврдили смо само да је густина дендритских бодљи значајно повећана у ХИС групи у поређењу са ХИ групом (П < 0.{{6 }}5), док је густина дендритских бодљи смањена у ХИС + ИЦ-1 групи у поређењу са ХИС групом (П < 0,01; Слика 2Б).
СПЦ побољшава експресију ПСД95 и ГАП43 у хипокампусу

Процењивали смо експресију протеина ГАП43 и ПСД95 повезаних са синапсом да бисмо утврдили да ли су они инхибирани глијалним ожиљцима. ХИ је значајно смањио експресију протеина ПСД95 (П < 0.01) и ГАП43 (П < 0,05) у поређењу са лажном групом (Слика 2Ц–Е). У поређењу са ХИС групом, нивои експресије ПСД95 и ГАП43 су значајно смањени након ИЦ{12}}ињекције.

Формирање астроглиозе и глијалних ожиљака оштећује архитектуру хипокампуса након ХИ

Затим смо покушали да проверимо да ли севофлуран побољшава учење и функцију памћења тако што штити архитектуру хипокампала и ублажава астроглиозу. Неонатална ХИЕ индукована неуронска апоптоза у хипокампусу, као и реактивна астроглиоза у пределу инфаркта која се касније развија у глијални ожиљак (Роллс ет ал., 2009).

У ХИ групи, пирамидални слојеви ЦА1 и ЦА3 и ДГ регион показали су очигледно смањење неурона (П < 0.01, П < 0.001; слике 3Е и 4Ц), као и повећан број астроцита са јасним морфолошким променама (П <0,001; слике 3Ц и 4Б). Процењивали смо експресију ГФАП и НеуН у три области левог хипокампуса коришћењем имунохистохемије и Вестерн блоттинг анализе.

Наши резултати су показали да су у поређењу са лажном групом, астроцити активирани у ХИ групи, уметнути у пирамидални слој ЦА1 (Слика 4А) и ЦА3 (Слика 3А) и окружени неурони у ДГ (Слика 3Б). Прекомерна астроглиоза је резултирала даљим ширењем глијалних процеса ка нормалним неуронским структурама, формирајући аберантну астроцитну мрежу налик зиду (Слике 3А, Б и 4А).

Штавише, ГФАП имунореактивност (Слике 3Ц, Д и 4Б, Е) и нивои протеина су повећани (П < 0.01; Слика 4Е), док је имунореактивност НеуН смањена (П < {{7} }.01 или П < 0,001. Да бисмо даље верификовали формирање глијалног ожиљка, проценили смо нивое експресије неуроканпротеина и имунореактивност у хипокампусу (Слике 5А, Б и 6А);

Резултати имунофлуоресценције са двоструким обележавањем открили су значајне разлике у интензитету флуоресценције неурокан+/ГФАП+ имунолошког бојења између ХИ и лажних група (П < 0.001, П < 0,05, П < 0,01; Слике 5Г, Х и 6Д), у складу са резултатима Вестерн блота (П< 0.01; Figure 6F).

СПЦ ублажава астроглиозу и формирање глијалних ожиљака у хипокампусу

Затим, наша студија је истраживала да ли је СПЦ ублажио глијалне ожиљке. У поређењу са ХИ групом, имунореактивност ГФАП-а (Слике 5Ц, Д и 6Ц) и неурокана (Слике 5Е, Ф и 6Б) у ХИС групи је била значајно смањена у хипокампусу (П < 0.{{6} }1 или П < 0,001).

Насупрот томе, експресија ГФАП и неурокана у ХИС + ИЦ-1 групи је била значајно повећана у поређењу са ХИС групом и није се разликовала од ХИС + ИЦ-1 и ХИ група (П > 0.05; Слика 6Е и Ф).

Поред тога, НеуН имунопозитивност је повећана и структуре су изгледале уређеније у ХИС групи у поређењу са ХИ групом, што је ИЦ-1 поништио (слике 3Е, Ф и 4Ц).

For more information:1950477648nn@gmail.com