Калпастатин спречава повреду подоцита посредовану ангиотензином ИИ кроз одржавање аутофагије

за више информација:ali.ma@wecistanche.com

Имане Бенсаада^1,3, Блаисе Робин^1,3, Јое¨лле Перез², Ианн Салемкоур¹, Анна Цхипонт¹, Марине Цамус¹,Матхилде Лемоине¹, Леа Гуионнет¹, Хе´ле`не Лазаретх¹, Еммануел Летаверниер², Цароле Хе´никуе¹,Пиерре-Лоуис Тхараук¹и Оливија Леноар¹

¹Университе де Парис, ПАРЦЦ, Инсерм, Париз, Француска; и²Университе Парис Десцартес, Сорбонне Парис Ците, Париз, Француска

Чврсто је утврђена снажна предиктивна вредност протеинурије код хроничних гломеруларних патологија, као и патогена улога ангиотензина ИИ који промовише прогресију гломеруларне болести са измењеном гломеруларном фи-филтрационом баријером, повредом подоцита и ожиљцима гломерула. Овде смо открили да је хронична хипертензија изазвана ангиотензином ИИ инхибиранааутофагијаизлив у гломеруле миша. Брисање Атг5 (гена који кодира протеин који укључује аутофагију), посебно у подоциту, резултирало је убрзаном подоцитопатијом изазваном дангио тензином ИИ, наглашеном албуминуријом и гломерулосклерозом. Ово указује да је аутофагија кључни заштитни механизам у подоциту у овом стању. Ангиотензин-ИИ индукована активност калпаина у подоцитима инхибирааутофагијаефлукс. Подоцити мишева са трансгеном експресијом ендогеног инхибитора калпаинакалпастатинприказани виши подоцитиаутофагијана почетку који је био отпоран на инхибицију зависну од ангиотензина ИИ. Такође, трајна аутофагија сакалпастатинограничено оштећење подоцита и албуминурија. Ови налази сугеришу да хипертензија има патогене ефекте на гломеруларну структуру и функцију, делом кроз активацију калпаина што доводи до блокаде аутофагије подоцита. Ови налази откривају оригинални механизам у коме хипертензија посредована ангиотензином ИИ инхибира аутофагију путем калцијумом индукованог регрутовања калпаина са патогеним последицама у случају неравнотеже од странекалпастатинактивност. Дакле, спречавање калпаином посредованог смањењааутофагијаможе бити обећавајућа нова терапијска стратегија за нефропатије повезане са високом активношћу система ренин-ангиотензин.

КЉУЧНЕ РЕЧИ: ангиотензин ИИ;аутофагија; калпастатин; хипертензија; подоцит

Транслатионал Статемент

С обзиром на пресудну улогу аутофагије у развојубубрегаболести, фармаколошка модулација одаутофагијаможе бити обећавајућа стратегија за превенцију и лечење неколикобубрегаболести. Паралелно, откривено је да прекомерна активација активности калпаина у подоцитима има штетне ефекте на функцију подоцита, док његови штетни механизми деловања нису идентификовани. Овде пружамо доказе да калпаин повезује штетно дејство ангиотензина ИИ са штетном блокадомаутофагијау подоцитима и сугеришу да би инхибиција калпаина могла бити обећавајући терапеутски циљ за болести подоцита, делимично кроз одржавање аутофагије подоцита.

Кликните да бистеЦистанцхе десертицола ма за хроничну болест бубрега

Хипертензија је друга после дијабетеса као водећи узрок прогресивне хроничне болестибубрегаболест 1–3, па чак и умерено повишење крвног притиска је независни фактор ризика за завршну фазу болести бубрега.4 Све већи број експерименталних студија наглашава важност подоцита у развојубубрегаповреда. Прогресивни губитак подоцита и микроваскуларне алтерације се јављају рано са падом функције бубрега код експерименталне хипертензивне нефропатије.5 Код пацијената се показало да је излучивање одрживих подоцита у урину осетљив и специфичан маркер за прееклампсију,6,7, а пацијенти са нефросклерозом су имали значајан мања густина гломеруларних подоцита него што је то билобубрегадонори.8,9 Штавише, патогена улога ангиотензина ИИ (АнгИИ) у прогресији гломеруларне болести је добро утврђена, не само код хипертензивних стања већ и код неколико гломеруларних болести.10–21

Гломеруларна хипертензија доводи до истезања капилара гломерула, оштећења ендотела и повишене филтрације гломеруларних протеина што узрокује колапс гломерула и гломерулосклерозу. Такође има директну акцију на гломеруларне структуре, изазивајући сигналне регулаторне одговоре чији је циљ компензација. Активирани системски и локални систем ренин-ангиотензин-алдостерон (РААС) подстиче мезангијалну хиперплазију и синтезу фактора васкуларне пермеабилности. Истовремено, подоцити показују сигнализацију калцијума22,23 и модификују свој облик стимулацијом зависном од АнгИИ типа 1 рецептора (АТ1).24–28 Ови адаптивни механизми дугорочно постају неприлагођени, што коначно доводи до гломерулосклерозе. АТ1 посредује у значајном учешћу РААС-а за крвни притисак и хомеостазу соли и воде. Инхибитори ензима који конвертује ангиотензин и блокатори АТ1 се клинички користе за лечење хипертензије и срчане инсуфицијенције код пацијената. Занимљиво је да оба блокатора такође показују заштитни ефекат набубрегафункција.

Показало се да је аутофагија неопходна за одржавање ћелијске хомеостазе, посебно у постмитотским ћелијама29,30 и посебно у подоцитима.31-34Аутофагијаје систем деградације који је повезан са лизозомима за дугоживе цитоплазматске протеине и дисфункционалне органеле35,36 и укључује секвестрацију протеина и органела у аутофагозомима. Формирање аутофагозома зависи од индукције неколико гена укључујући Мап1лц3а/б, Бецлин 1 и Тагс. 37 Све је више доказа да је дисрегулација аутофагног пута умешана у патогенезу старења бубрега и неколикобубрегаболести као што су акутна повреда бубрега, полицистична болест бубрега, старење и дијабетичка нефропатија.31,32,38–41

Регулатива оаутофагијау подоцитима, физиолошки и, пре свега, у патолошком контексту, није добро познат. Недавно смо показали да је аутофагија подоцита независна од механичке мете регулације рапамицина (мТОР) у физиолошким условима, што овај тип ћелије чини изузетком.42 Активација АТ1 стимулише синтезу протеина и промет протеина у ћелијама. Стога смо закључили да активација РААС-а такође може утицати на стимулацију промета протеина и протеостазу.

У овој студији, фокусирали смо се на улогу АнгИИ сигнализације у подоцитуаутофагијарегулација. Идентификовали смо протеазе активиране калцијумом калпаине које посредују у хроничном блокирајућем ефекту АнгИИ на подоцитеаутофагија. Даље, открили смо да је ендогени инхибитор калпаинакалпастатинбио у стању да спречи АнгИИ зависну инхибицију аутофагије и повреду подоцита током хипертензије.

Ови налази откривају оригинални механизам којим хипертензија посредована АнгИИ инхибирааутофагијапреко калцијумом индукованог регрутовања калпаина са патогеним последицама у случају неравнотеже активности калпастатина.

МЕТОДЕ

Животиње

Цалпастатиндр Е. Летаверниер је љубазно обезбедио трансгене (ЦСТТг) мишеве.43 Мишеви са поремећајем Атг5 гена специфичним за подоците (Нпхс2.цре Атг5лок/лок) настали су као што је претходно описано31 укрштањем Нпхс2.цре мишева44 са Атг5лок/лок мице45 на позадини Ц57БЛ6/Ј. Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишеви и контролни мужјаци легла, старости од 10 до 12 недеља, коришћени су у овој студији. Хипертензивни модел је индукован сц инфузијом АнгИИ (Сигма-Алдрицх, А9525) у дози од 1 мг/кг/мин током 4 до 6 недеља преко осмотских мини пумпи (Алзет Цорп, модел 2006). Пумпе су уграђене сц на леђима између лопатица и кукова. Мишеви су добијали суплементацију соли (3 процента НаЦл) у храни. Атг5лок/лок (дивљи тип [ВТ]) мишеви су коришћени као контроле у ​​свим студијама. За со деоксикортикостерон ацетата (ДОЦА) са моделом редукције нефрона, одрасли мужјаци мишева подвргнути су једностраној левој нефректомији. Две недеље након нефректомије, примили су ДОЦ пелете са 21-дневним ослобађањем (Инновативе Ресеарцх оф Америца) имплантираним сц. Друга пелета је имплантирана 3 недеље након првог импланта. Сви мишеви су примили 0,9 процената НаЦл у води за пиће ад либитум и убијени су након 6 недеља примене ДОЦ.46 Експерименти су спроведени у складу са француским ветеринарским смерницама и онима које је формулисала Европска заједница за експерименталну употребу на животињама (Л358-86/ 609ЕЕЦ) и одобрени су од стране француског Министарства за истраживање и етичког комитета локалног универзитета (АПАФИС-7646 и -22373).

Експеримент са примарном културом подоцита

Диференцирани примарни подоцити су култивисани као што је претходно описано.47,48 Укратко, свеже изоловани кортекс бубрега је помешан и дигестиран помоћу колагеназе И (Гибцо, 17100-017) у Росвелл Парк Мемориал Институте 1640 (Лифе Тецхнологиес, 61870-044). Ткива су затим пропуштена кроз ћелијске цедиљке од 70 мм и 40 мм (БД Фалцон, 352340 и 352350). Гломерули, који су приањали на цедиљку од 40 мм, уклоњени су физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС; Лифе Тецхнологиес, ​​10010023) þ 0,5 процената говеђег серумског албумина (Еуробио, ХАЛАЛБ07-65) који је убризган два пута под притиском, а затим је убризган у ПБС. Свеже изоловани гломерули су стављени у 6- посуде у Меморијалном институту Росвел Парк 1640 (Гибцо, 61870036) са додатком 10 процената феталног телећег серума и 1 процента пеницилина/стрептомицина (Лифе Тецхнологиес, ​​151422) да би се дозволило подогломеру од 1514012 и расти. Обогаћивање подоцита је верификовано Вестерн блот анализом као што је претходно описано31, 48, 49 (додатна слика С1). Подоцити су култивисани у одсуству или присуству бафиломицина А1 (100 нмол/л, Сигма-Алдрицх, Б1793) током 4 сата. За експерименте имунофлуоресценције, примарни подоцити су стављени на налепнице на 4 посуде (Дутцхер, 055071). Подоцити су затим фиксирани у параформалдехиду 4 процента током 10 минута и обрађени за имунофлуоресценцију.

Анализа активности калпаина

Интрацелуларна активност калпаина је одређена у примарним подоцитима, као што је претходно описано.50–52 Укупно 100,000 ћелија је култивисано у 24- посудама за културу ткива у Розвел Парк Меморијалном институту 1640 са додатком 10% феталних телећи серум и 1 проценат пеницилина/стрептомицина. Након назначеног периода културе, медијум је замењен Кребс-Рингер ХЕПЕС раствором бикарбоната (КРХ) (пХ 7,4) који садржи 4 мМ ЦаЦл2, са или без 10 мМ инхибитора калпаина-1, и инкубиран 10 минута пре додавања од 50 мМ калпаин супстрата Н-сукцинил-Леу-Леу-Вал-Тир-7-амино-4-метил кумарина (Сигма-Алдрицх, С6510). После 90-минутног периода инкубације, активност калпаина је одређена као разлика између ФЛ флуоресценције (мерене при 360 нм ексцитације и 430 нм емисије) са и без инхибитора калпаина-1.

Вестерн блот

Примарни подоцити су изгребани са 80 мл пуфера за испитивање радиоимунопреципитације који садржи фосфатазу и инхибитор протеазе. Концентрација протеина је мерена помоћу БЦА Протеин Ассаи Кит (Мерцк Биоцхемистри, 71285). Двадесет микрограма протеина је подвргнуто електрофорези на Цритерион КСТ префабрикованом гелу (12 процената Бис-Трис, Био-Рад, 3450124). Протеини су пребачени на поливинилиден дифлуоридну мембрану (Тхермо Фисцхер Сциентифиц, 88518). Након блокирања у 5% млека у Трис пуфер физиолошком раствору 0,1% Твеен (ТБС-Т), мембране су инкубиране са зечјим поликлоналним анти-ЛЦ3 (1:1000, Целл Сигналинг Тецхнологи, 2575), зечјим поликлоналним анти-АТГ5 (1:2000, Технологија ћелијске сигнализације, 2630), поликлонални анти-Секвестозом 1 (СКСТМ1)/П62 (1:10,000, ПРОГЕН, ГП62), поликлонални анти-калпаин 1 домен зеца ИВ (1:1000, аб39, Абцам) ), зец поликлонални анти-калпаин 2 амино-терминални крај домена И (1:1000, Абцам, аб39165), мишји моноклонални ИгГ1 анти-калпаин 4 (1:1000, Санта Цруз Биотецхнологи, сц-32325), зец анти подоцин (1:1000, Абцам, аб50339), анти-нефрин заморца (1:500, ПРОГЕН, ГП-Н2) и моноклонско анти-тубулинско антитело пацова (1:5000, Абцам,аб6160). После прања, мембране су инкубиране са антителом везаним за пероксидазу рена (1:2000, Целл Сигналинг Тецхнологи, 7074, 7076, 7077). Детекција специфичних сигнала је извршена коришћењем ЕЦЛ хемилуминисцентног комплета (Био-Рад, 170-5070) на ЛАС 4000 уређају (Фуји). За квантификацију је коришћена дензитометријска анализа са софтвером ИмагеЈ (Национални институти за здравље).

Мерење крвног притиска и физиолошке процене

Систолни крвни притисак мишева је забележен применом методе репне манжетне (Виситецх Системс Инц., БП-2000). Од сваког миша је узето десет мерења, а затим је одређена средња вредност. Систолни крвни притисак је мерен на почетку (12 недеља старости), а затим једном недељно до краја периода лечења. Сви мишеви су смештени у метаболичке кавезе са слободним приступом води на 6-сатну колекцију урина. Концентрације креатинина у урину и урее у плазми анализиране су спектрофотометријски колориметријском методом (Олимпус, АУ400). Излучивање албумина у урину је мерено коришћењем специфичног ензимског имуносорбентног теста за квантитативно одређивање албумина у урину миша (Цристал Цхем, 80630).

Хистологија

Бубрезисакупљени су и фиксирани у формалину пуферираном са 4 процента ПБС. Секције уграђене у парафин (3- мм дебљине) су обојене Массон'стрихромом да би се проценила морфологија бубрега. Абнормалности у бубрезима су оцењене на основу присуства и тежине абнормалности компоненти, укључујући гломерулосклерозу, мезангијалну експанзију, тубуларну атрофију или гипсе и фиброзу. Удео склеротичних гломерула је процењен слепим прегледом од најмање 50 гломерула побубрегаодељак.

Имунофлуоресцентно бојење пресека бубрега и примарних подоцита

Фиксни примарни подоцити су блокирани у ТБС-Т 3 процента говеђег серумског албумина и инкубирани преко ноћи на 4 степена са примарним антителима заморца анти-СКСТМ1/П62 (1:1000, ПРОГЕН, ГП-62Ц) и зечјим анти -зелени ФЛ флуоресцентни протеин (ГФП; 1:500, Абцам, аб290). Након испирања ТБС-Т, ФЛ секундарна антитела коњугована са флуорофором коњугована антитела магарећег анти-заморца ИгГ АФ594-(ЈацксонИммуноРесеарцх, 706-585-148) и магарећег анти-зечјег ИгГ АФ488-коњугованог антитела Примењен је Инвитроген, А21206). Слике су снимљене коришћењем Зеисс 2 фт флуоресцентног микроскопа, АкиоЦам ХРццамера и Акиовисион 4.3 софтвера.

За парафин фиксиран формалином (ФФПЕ)бубрези, пресеци (3 мм) су депарафинизовани и хидратисани и узимање антигена је извршено у загрејаном цитратном пуферу (пХ 6). Секције су затим пермеабилизоване са Тритон 0.1 проценат (Еуромедек) и блокиране у ТБС-Т 3 процента говеђег серумског албумина пре инкубације антитела преко ноћи на 4 Ц. Користили смо козји анти-нефрин (1:100, ПРОГЕН, ГП -Н2), заморац анти-СКСТМ1/П62 (1:1000, ПРОГЕН, ГП-62Ц), зец анти-ГФП(1:1000, Абцам, аб290), козји анти-подокаликсин (ПОДКСЛ; 1: 1000, Био-Тецхне, АФ-1556), и антитело зеца против Вилмовог тумора 1 (ВТ1;1:100, Абцам, аб192). Секундарна антитела су била Алека488– и Алека 568–коњугована антитела из Инвитрогена. Језгра су обојена у плаво помоћу Хоецхста. Слајдови су монтирани помоћу флуоресцентног медија за монтажу (Дако, С3023). Микрофотографије су направљене Зеисс Акиопхот фотомикроскопом и софтвером Акиовисион. Полуаутоматске квантификације на Фиџију коришћене су за квантификацију нефрин-позитивних и ПОДКСЛþ подручја по гломеруларном пресеку на најмање 30 гломерула по мишу. Број подоцита је пребројан као број ВТ1 језгара по гломеруларном делу на најмање 30 гломерула по мишу.

Поступак трансмисионе електронске микроскопије

Мали делови кортекса бубрега (1 мм3) су фиксирани у 3% глутаралдехида (Елецтрон Мицросцопи Сциенцес) током 1 до 30 дана и испрани три пута у ПБС. Узорци су накнадно фиксирани у 1 проценту осмијум тетроксида 0.1 М (Елецтрон Мицросцопи Сциенце) у 0,1 М ПБС (пХ 7,4) и испрани у води. Узорци су дехидрирани у алкохолу и 100 посто пропилен оксида (Елецтрон Мицросцопи Сциенце). Инфилтрација смолом је изведена на следећи начин: мешати Епикоте 812 и пропилен оксид у односу 1:1 током 30 минута, а затим мешати Епикоте 812 и пропилен оксид у односу 1:2 на собној температури преко ноћи. Узорци су уграђени у желатинске капсуле од 4 мм у 100 посто Епикоте 812 и полимеризовани у пећници загрејаној на 60 Ц. Ултратанке секције су исечене ултрамикротомом УФЦ7 (Леица МицросцосистемсГмбХ) и нанесене на Гилдер Гридс 200 Мицропи Сциенце (Елецтрон) мрежице. Они су обојени уранил ацетатом 7 процената (ЛФГ Дистрибутион) и Реинолдовим оловним цитратом (ЛФГ). Узорци су испитивани у трансмисионом електронском микроскопу ЈЕМ1011 (ЈЕОЛ) са Ориус СЦ1000 ЦЦД камером (Гатан), са софтвером Дигитал Мицрограпх (Гатан) за аквизицију.

Цистанцхе-болест бубрега

Квантитативни низ ланчане реакције полимеразе

Свеже изоловани гломерули су замрзнути у КИАзол Лисис реагенсу (Киаген) на -80 степену. Екстракција укупне РНК методом на бази фенола обрађена је према препорукама произвођача. цДНК су синтетизоване коришћењем РТ2 Фирст Странд Кит (Киаген, 330401), а ланчана реакција полимеразе у реалном времену (ПЦР) је изведена коришћењем Цустом РТ2 Профилер ПЦР Арраи (Киаген, ЦЛАМ36771Ц) са РТ2 СИБР Греен кПЦР Мастермик333050 (Киаген, Киаген) . Квантитативне ПЦР плоче су рађене на Апплиед Биосистемс СтепОнеПлус циклусу. Сваки низ садржи контролу квалитета за ефикасност реверзне транскрипције и контаминацију геномске ДНК. Квантитативна ПЦР анализа је извршена помоћу 2-ДДЦТ методе уз помоћ ГенеГлобе Дата Аналисис Центер (ввв. Киаген. цом/схоп/генес-анд-патхваис/дата-аналисис-центер-овервиев-паге) и изражена као Лог2 пута промена у експресији гена.

Ин силицо протеомска анализа

Ин силицо предвиђање места цепања калпаина је урађено помоћу ДеепЦалпаина (хттп://деепцалпаин.цанцербио.инфо/хелп.пхп), ГПС-ЦЦД (хттп://ццд.биоцуцкоо.орг) и ЦаМПДБ (хттп:// цалпаин.орг/) онлајн алати. Аминокиселинска секвенца мишјег протеина добијена је од Унипрота (хттпс://ввв.унипрот.орг). Резултати су настављени у додатним табелама С1 и С2.

статистичке анализе

Сви графикони представљају појединачне вредности и средње вредности±СЕМ. Статистичке анализе су обављене коришћењем софтвера ГрапхПад Присм, верзија 9. Поређење између 2 групе је извршено помоћу параметарског Студентовог т-теста када су узорци прошли Андерсон-Дарлинг и Д'Агостино тест нормалности и Ф тест за једнакост варијансе. У супротном, коришћен је непараметарски Манн-Вхитнеи тест. Поређење између више група је извршено коришћењем 1-начин или 2-анализе варијансе праћеног тестом вишеструког поређења са Симак-овом корекцијом. Вредности П < 0.05="" су="" сматране="" значајним.*п="">< 0.05,="" **п="">< 0,01,="" ***п=""><>

Слика 1|Хипертензија изазвана ангиотензином ИИ (АнгИИ) Д дијетом са високим садржајем соли (ХСД) инхибира гломеруларнеаутофагија. (а–ц) Имунофлуоресценција подокаликсина (ПОДКСЛ; црвено) и П62 (зелено) у гломерулима (а,а0) код мишева дивљег типа (ВТ), (б,б0) од ВТ мишеви након 6 недеља АнгИИ þ ХСД, и (ц,ц0) од Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева који показују акумулацију П62 у подоцитима током хипертензије и у АТГ специфичном за подоците{{1{{12 }}}}дефицитарни мишеви. Врхови стрелица показују П62þ тачке у ВТ у (а0). Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Подделови слике са основним бројем означавају веће увећање. Шипке=50 мм. (д) Повезана квантификација површине П62þ изражена као проценат гломеруларне површине. н=4 ВТ мишеви и н=5 ВТ са АнгИИ þ ХСД, и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишеви. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Манн-Вхитнеи тест: *П=0.0159. Да бисте оптимизовали гледање ове слике, погледајте онлајн верзију овог чланка на ввв.бубрега-интернатионал.орг.

РЕЗУЛТАТИ

Хипертензија изазвана дијетом са високим садржајем соли АнгИИ Д инхибирала је аутофагију подоцита

Подоцити представљају висок нивоаутофагијаин виво, као што је приказано снажном експресијом ГФП-а код трансгених мишева са ГФП фузијом са ЛЦ3 (ГФП-ЛЦ3 мишеви), кључним маркером аутофагије (додатна слика С2А). Аутофагија је динамичан процес са сталним формирањем аутофагозома и деградацијом аутофаголизозома. Блокирање аутофагозомске деградације хлорокином резултирало је акумулацијом ГФПþ тачака, што указује на висок аутофагични ефлукс у подоцитима (додатне слике С2А и Б). Потврда да су ГФПþ тачке аутофагозоми приказана је двоструком имуно-ФЛ флуоресценцијом за ГФП и СКСТМ1/П62, шаперонски протеин деградиран одаутофагија(Допунска слика С2Ц и Д). Опет, третман хлорокином је индуковао акумулацију ГФПþ П62þ тачака, показујући важан аутофагни ефлукс у подоцитима. Коначно, висок аутофагични ефлукс је конзервиран ин витро као што је приказано експресијом ГФП и П62 у примарним подоцитима изолованим од ГФП-ЛЦ3 мишева и снажном акумулацијом ГФПþ и П62þ тачака под третманом бафиломицином А1, још једним блокатором аутофагозомалне деградације (додатна слика С2Е-Х) .

Капацитет хипертензије да модулира аутофагичне одговоре подоцита је затим процењен код мишева којима је даван АнгИИ са исхраном са високим садржајем соли (ХСД) током 6 недеља и код нехипертензивних контрола. Као што је приказано на слици 1, АнгИИ þ ХСД је индуковао акумулацију П62 у гломерулима са снажном акумулацијом у подоцитима, што сугерише да је АнгИИ þ ХСД одговоран за подоците.аутофагијаблокада (слика 1а–д). Занимљиво је да је акумулација П62 у подоцитима била слична оној уоченој код мишева са недостатком аутофагије подоцита (Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишеви). У другом моделу хипертензије, моделу ДОЦ-соли, такође смо приметили прогресивну акумулацију П62 у подоцитима током временског тока болести (додатна слика С3).

Брисање Атг5 посебно у подоцитима доводи до повећане албуминурије, губитка подоцита и повреде гломерула у АнгИИ Д ХСД моделу

Затим смо испитали да лиаутофагијаблокада само код подоцита (Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишеви) утиче на повреду гломерула у АнгИИ þ ХСД моделу. Прво смо потврдили да је Нпхс2. цре Атг5лок/лок мишеви су имали нормалан крвни притисак, нормаланбубрегафункција, и без гломеруларних хистолошких лезија до 10 месеци старости, као што је раније објављено (додатна слика С4).32 Затим, Атг5лок/лок (ВТ) и Нпхс2. цре Атг5лок/лок мишеви су инфундирани са АнгИИ са ХСД током 6 недеља. Важно је да је систолни крвни притисак био сличан у 2 групе након инфузије АнгИИ током студије (Слика 2а), иако метода репне манжетне која се користи за мерење крвног притиска можда неће имати способност да разреши мале разлике у крвном притиску. Инфузија АнгИИ са ХСД значајно је повећала однос албумина и креатинина у урину код ВТ мишева, а овај ефекат је даље значајно повећан код Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева (Слика 2б). Хипертензивни Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишеви су такође показали значајно повећану гломеруларну склерозу у поређењу са ВТ леглом (Слика 2ц–е). У складу са измереном протеинуријом, протеински изливи и тубуларна дилатација били су значајно чешћи код мишева са недостатком подоцита у АТГ5 (Слика 2ф-х).

Слика 2|Брисање Атг5 специфично у подоцитима доводи до значајног повећања албуминурије,бубрегаповреда и губитак подоцита након 6 недеља инфузије ангиотензина ИИ (АнгИИ) Д дијете са високим садржајем соли (ХСД). (а) Систолни крвни притисак код Атг5лок/лок и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева током 36 дана АнгИИ þ ХСД. н=9 мишева по генотипу. Вредности су представљене као средња вредност±СЕМ. Двосмерна анализа варијансе (АНОВА): нс. У (б–м), н=10 мишева по генотипу. У (б,г,х,к), вредности су представљене као појединачни дијаграми и средња вредност±СЕМ. (б) АнгИИ þ ХСД (наставак)

Слика 2|(наставак) резултирало је драматичним повећањем албуминурије у Нпхс2. цре Атг5лок/лок мишеви у поређењу са Атг5лок/лок контролним мишевима. Двосмерна АНОВА: генотип, П=0.013; време, П=0.0018. (ц-ф) Репрезентативне слике Массонових трихром-обојених делова гломерула из Атг5лок/лок контроле и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева након 6 недеља АнгИИ þ ХСД. Шипке=50 мм у (ц,д). Шипке=100 мм ин (е,ф). (г,х) Поређење (г) пропорције склеротичних гломерула и (х) броја тубуларних излива по микроскопском пољу. Манн-Вхитнеи тест: **П=0.0026 ин (х), ***П=0.0003 ин (г). (и, ј) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије Вилмовог тумора 1 (ВТ1; црвено) и подокаликсина (ПОДКСЛ; зелено) у гломерулима из Атг5лок/лок контроле и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева након АнгИИ þ ХСД током 6 недеља. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Шипке=50 мм. (к) Квантификација броја ћелија ВТ1 по гломеруларном делу. Манн-Вхитнеи тест: **П=0.0029 ин (л,м). Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије ЦД44 (зелено) у гломерулима из Атг5лок/лок контроле и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева након АнгИИ þ ХСД током 6 недеља. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Шипке=50 мм. (н,о) Репрезентативне трансмисионе електронске микроскопске фотомикрографије делова гломерула из Атг5лок/лок контроле и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева након АнгИИ þ ХСД током 6 недеља, показујући брисање процеса стопала подоцита (врхове стрелица) код хипертензивног Нпхс2. цре Атг5лок/лок мишеви. Шипке=1 мм. н=3 мишева по генотипу. Да бисте оптимизовали гледање ове слике, погледајте онлајн верзију овог чланка на ввв.киднеи-интернатионал.орг.

Слика 3|Експресија и активност калпаина у подоцитима. (а) Вестерн блот анализа експресије калпаина-1, калпаина-2 и калпаина-4 у примарним подоцитима. Експресија тубулина служи као нормализација. (б) Активност калпаина је мерена на примарним подоцитима који су третирани или нису третирани ангиотензином ИИ (АнгИИ; 100 нМ) током 24 сата са или без калпептина (10 мМ). н=5 независних експеримената. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Једносмерна анализа варијансе (АНОВА): третман, П=0.0035. Сидаков тест вишеструког поређења: *П=0.0128 за АнгИИ наспрам основне линије, ##П=0.0056 за АнгИИ þ калпептин наспрам АнгИИ. (ц) Активност калпаина је мерена на примарним подоцитима из дивљег типа (ВТ) иликалпастатинтрансгени (ЦСТТг) мишеви третирани или не третирани АнгИИ (100 нМ) током 24 сата. н=7 независних експеримената. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Двосмерна АНОВА упарена за лечење: генотип, П=0.0483. Сидаков тест вишеструког поређења: ***П=0.0009 за ВТ АнгИИ наспрам основне линије, *П=0.0420 за ЦСТТг АнгИИ наспрам основне линије, #П=0.0424 за ВТ наспрам ЦСТТг АнгИИ. Да бисте оптимизовали гледање ове слике, погледајте онлајн верзију овог чланка на ввв.бубрега-интернатионал.орг.

Број подоцита по гломерулу је значајно смањен у Нпхс2. цре Атг5лок/лок мишеви третирани АнгИИ þ ХСД (Слика 2и-к). Повреда подоцита код мишева Нпхс2.цре Атг5лок/лок са инфузијом АнгИИ þ ХСД је чак напредовала до фокалне и сегментне гломерулосклерозе као што је приказано експресијом маркера активације паријеталних епителних ћелија (ПЕЦ) ЦД44 у гломерулима (Слика 2л и м). Анализа електронском микроскопијом је идентификовала значајне промене повезане са недостатком АТГ5 након хроничне инфузије АнгИИ са ХСД, укључујући уклањање процеса стопала код хипертензивног Нпхс2. цре Атг5лок/лок мишеви. Насупрот томе, неколико ултраструктурних дефеката је пронађено у подоцитима од ВТ мишева чак и након 10 недеља инфузије АнгИИ са ХСД (Слика 2н и о), што указује да је аутофагна активност подоцита потребна за њихову отпорност на оштећења изазвана АнгИИ þ ХСД. Све у свему, наши резултати су показали да у АнгИИ þ ХСД моделу,аутофагијаинхибиција погоршава повреду и губитак подоцита и изазива накнадну фокалну и сегментну гломерулосклерозу.

АнгИИ Д ХСД активира активност калпаина у подоцитима што доприноси блокади аутофагије

Како је утврђено да активност калпаина (и) активира АнгИИ у неколико типова ћелија и (ии) да цепа неколикоаутофагија-сродни протеини,53 питали смо се да ли се блокада аутофагије посредована АнгИИ þ ХСД може приписати повећаној активности калпаина изазване АнгИИ. Прво смо открили да примарни подоцити изражавају 3 свеприсутна облика калпаина (слика 3а). Затим смо показали да АнгИИ стимулише активност калпаина у примарним подоцитима. Овај пораст активности калпаина блокиран је селективним инхибитором калпаина (слика 3б). Користили смо укуцани миш са додатнимкалпастатинекспресија трансгена (што доводи до смањене активности калпаина)43 да би се проценила улога калпаина у АнгИИ þ ХСД-посредованојбубрегаповреда и блокада аутофагије. Примарни подоцити из ЦСТТг мишева показали су смањену активност калпаина као одговор на АнгИИ у поређењу са подоцитима контролних мишева (Слика 3ц). Тако,калпастатинпрекомерна експресија у подоцитима је смањила АнгИИ посредовану активацију калпаина.

Затим смо проценилиаутофагијанивои у подоцитима ЦСТТг мишева. Генерисали смо ЦСТТг мишеве са ГФП-ЛЦ3 трансгеном. ЛЦ3-ГФП репортер је дозволио бројање аутофагозома као ГФПþ/П62þ тачака. П62 ће се акумулирати у агрегатима у ћелијама када је блокиран аутофагни ефлукс. У базалном стању, избројали смо мање ГФПþ П62þ тачака (слика 4а, б и е) и мање акумулације П62 (слика 4ц, д и ф) у подоцитима ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева него у подоцитима нормалних ГФП-ЛЦ3 мишева , што сугерише повећан аутофагични ефлукс у подоцитима мишева са великом количином калпастатина.

Слика 4|Процена аутофагног ефлукса у подоцитимакалпастатинтрансгени (ЦСТТг) мишеви. (а,б) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије зеленог ФЛ флуоресцентног протеина (ГФП) (зелено) и П62 (црвено) у гломерулима од 12-недељних ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева. Врхови стрелица указују на ГФПþ П62þ аутофагозоме. (ц,д) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије П62 (зелено) и подокаликсина (ПОДКСЛ; црвено) у гломерулима од 12-недељних ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева. Подделови слике са основним бројем означавају веће увећање. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Шипке=50 мм. (е) Квантификација броја ЛЦ3 þ П62 þ тачака по подоциту. Манн-Вхитнеи тест: **П= 0.0065. (ф) Квантификација површине П62 по гломеруларном делу. Манн-Вхитнеи тест: *П=0.0420. У (е,ф), н=5 ГФП-ЛЦ3 мишева и н=8 ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Да бисте оптимизовали гледање ове слике, погледајте онлајн верзију овог чланка на ввв.бубрега-интернатионал.орг.

Аутофагични ефлукс се може пратити мерењем конверзије цитоплазматског облика ЛЦ3, ЛЦ3-И, у аутофагозомски цепани и фосфатидилетаноламин-спарирани облик ЛЦ3, ЛЦ3-ИИ, на Вестерн блот-у . Подоцити ЦСТТг мишева су показали повећану конверзију ЛЦ3-И у ЛЦ3-ИИ и смањену експресију П62, како у присуству тако иу одсуству бафиломицина А1 (Слике 5а и б), што указује на повећан аутофагични ефлукс у подоцити са прекомерном експресијом калпастатина. Коначно, акумулација ГФПþ П62þ тачака у подоцитима након примене хлорокина била је важнија код ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева него код ГФП-ЛЦ3 мишева, чиме је потврђено дакалпастатинпрекомерна експресија изазива аутофагични ефлукс у подоцитима ин виво (Слика 5ц-е). Све у свему, наши подаци сугеришу да АнгИИ стимулише активност калпаина у подоцитима, тјаутофагијаје инхибиран калпаином у подоцитима, и да је инхибиција ендогене активности калпаина прекомерном експресијом калпастатина довољна да стимулише аутофагични ефлукс у подоцитима.

ЦСТТг мишеви су заштићени од АнгИИ Д ХСД-индуковане повреде подоцита

ЦСТТг мишеви нису показали ништабубрегапромена до најмање 12 месеци старости (допунска слика С5). Анализирали смо повреду подоцита код ЦСТТг мишева током третмана АнгИИ þ ХСД. Иако су ВТ мишеви развили благу гломерулосклерозу и повреду подоцита након 4 недеље хипертензије, као што је приказано абнормалном експресијом подокаликсина и нефрина, ЦСТТг мишеви су имали мање склеротичних гломеруларних лезија (слика 6а и б) и очувана експресија подокаликсина и нефрина (слика 6ц) . Такве разлике у фенотипу подоцита уочене су у фази у којој се густина језгара подоцита није разликовала између ВТ и хипертензивних ЦСТТг мишева (Слика 6и-к).

Слика 5|Блокирање аутофагозомалне деградације потврдило је повећан аутофагични ефлукс подоцита укалпастатинтрансгени (ЦСТТг) мишеви. (а) Вестерн блот анализа експресије ЛЦ3, секвестозома 1 (СКСТМ1)/П62 и АТГ5 у примарним подоцитима дивљих (ВТ) или ЦСТТг мишева. Експресија тубулина служи као нормализација. Подоцити су третирани или нису третирани бафиломицином А1 (БафА1; 100 нМ) 4 сата пре заустављања културе. (б) Квантификација односа ЛЦ{{10}}ИИ/тубулин и П62/тубулин. н=10 ВТ мишева и н=8 ЦСТТг мишева. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Двосмерна анализа варијансе упарене за третман: за ЛЦ3-ИИ/тубулин: генотип, П=0.{{30}}008; третман, П < 0,0001;="" за="" п62/тубулин:="" генотип,="" п="0.0884;" третман,="" п="">< 0,0001.="" сидаков="" тест="" вишеструког="" поређења:="" за="" лц3-ии/тубулин:="" ***п="">< 0,0001="" за="" вт="" плус="" бафа1="" наспрам="" вт="" þ="" бафа1,="" ***п="">< 0,0001="" за="" цсттг="" плус="" бафа1="" наспрам="" цсттг="" þ="" бафа1,="" ##п{="" {34}}.0028="" за="" вт="" þ="" бафа1="" наспрам="" цсттг="" þ="" бафа1;="" за="" п62/тубулин:="" ***п="">< 0,0001="" за="" вт="" плус="" бафа1="" наспрам="" вт="" þ="" бафа1,="" ***п="">< 0,0001="" за="" цсттг="" плус="" бафа1="" наспрам="" цсттг="" þ="" бафа1.="" (ц,д)="" репрезентативне="" имунофлуоресцентне="" слике="" експресије="" зеленог="" фл="" флуоресцентног="" протеина="" (гфп;="" зелено)="" и="" п62="" (црвено)="" у="" гломерулима="" од="" 12-="" недељних="" гфп-лц3="" и="" цсттг="" гфп-лц3="" мишева.="" подделови="" слике="" са="" основним="" бројем="" означавају="" веће="" увећање.="" језгра="" су="" обојена="" хоецхстом="" (плаво).="" шипке="50" мм.="" мишеви="" су="" третирани="" хлорокином="" (цк;="" 80="" мг/кг)="" 4="" сата="" пре="" убијања.="" врхови="" стрелица="" указују="" на="" гфпþ="" п62þ="" аутофагозоме.="" (е)="" квантификација="" броја="" лц3="" þ="" п62="" þ="" тачака="" по="" подоциту.="" н="5" мишева="" по="" генотипу.="" вредности="" су="" представљене="" као="" појединачне="" дијаграме="" и="" средње="">±СЕМ. Неупарени т-тест са једнаким СД: *П=0.0302. Да бисте оптимизовали гледање ове слике, погледајте онлајн верзију овог чланка на ввв.бубрега-интернатионал.орг.

Слика 6 |Цалпастатинпрекомерна експресија спречава повреду подоцита посредовану дијетом са високим садржајем соли (ХСД) ангиотензином ИИ (АнгИИ) Д. (а, б) Репрезентативне слике Массонових трихром обојених делова гломерула од дивљег типа (ВТ) и калпастатин трансгених (ЦСТТг) мишева након 6 недеља АнгИИ þ ХСД. Шипке=50 мм. (ц,д,ф,г) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије (ц,д) подокаликсина (ПОДКСЛ) и (ф,г) нефрина (НПХС1) код ВТ и ЦСТТг мишева након 6 недеља АнгИИ þ ХСД и (е ,х) повезане квантификације. Шипке =50 мм. (и, ј) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије Вилмовог тумора 1 (ВТ1; зелено) и ПОДКСЛ (црвено) у гломерулима ВТ и ЦСТТг мишева након 6 недеља АнгИИ þ ХСД и (к) повезана квантификација броја ВТ1 þ ћелије по гломеруларном делу. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Шипке=50 мм. У (е,х,к), вредности су представљене као појединачни дијаграми и средња вредност±СЕМ. н=9 ВТ мишева и н=7 ЦСТТг мишева. Неупарени т-тест са једнаким СД: **П=0.0095 ин (е), *П=0.0249 ин (х), П=0.7891 ин (к). Да бисте оптимизовали гледање ове слике, погледајте онлајн верзију овог чланка на ввв.бубрега-интернатионал.орг.

Слично, након 6 недеља хипертензије, ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишеви су имали повреду подоцита, али су лезије биле израженије код ГФП-ЛЦ3 мишева (Слика 7). Однос албумина и креатинина у урину био је већи код ГФП-ЛЦ3 мишева након 4 недеље АнгИИ þ ХСД (Слика 7а). Број подоцита се није разликовао између 2 генотипа, али је експресија нефрина била значајно смањена код ГФП-ЛЦ3 (контролних) мишева (Слика 7б-е). У корелацији сакалпастатин-посредованом заштитом, ултраструктурна анализа је показала благо и фокално брисање наставка стопала подоцита код ГФП-ЛЦ3 мишева третираних АнгИИ þ ХСД са бољим очувањем брисања наставка стопала код ЦСТТг мишева, иако је глобална квантификација броја процеса стопала по гломеруларној бази дужина мембране (ГБМ) није била статистички различита, највероватније зато што је повреда подоцита фокална и сегментална у нашем моделу (Слика 7ф-х). Треба напоменути да су макрофаги и инфилтрација Т-лимфоцита убубрезинису се разликовале између група (додатна слика С6). Узети заједно, ови резултати су то показаликалпастатинспречио АнгИИ þ ХСД-индуковану повреду подоцита.

Прекомерна експресија калпастатина обнавља аутофагични ефлукс у подоцитима мишева након третмана АнгИИ Д ХСД

Коначно смо се запитали да ликалпастатин- посредована гломеруларна заштита у АнгИИ þ ХСД моделу имплицира одржавање аутофагије у подоцитима. Занимљиво је да је АнгИИ þ ХСД-индукована акумулација П62 у подоцитима спречена код ЦСТТг и ГФП-ЛЦ3 ЦСТТг мишева (слика 8а-д), што указује да је калпастатин спречио блокаду подоцитааутофагија. Треба напоменути да је број ГФПþ П62þ тачака обележавања аутофагозома био сличан у подоцитима хипертензивних ГФП-ЛЦ3 и ГФП-ЛЦ3 ЦСТТг мишева, што сугерише да АнгИИ þ ХСД изазива успоравање аутофагног ефлукса подоцита, а не потпуно заустављање (Слика 8е- г).

Ин силицо предвиђање места цепања калпаина у протеинима подоцита

Користили смо неколико ин силицо алата за предвиђање потенцијалних циљева калпаина у подоцитима (додатне табеле С1 и С2). Упоређене су три онлајн базе података: ГПС-ЦЦД,54 ЦаМПДБ,55 и ДеепЦалпаин.56 Ин силико анализа је идентификовала неколико подоцитних протеина, међу њима нефрин и подоцин, које би калпаини могли да раздвоје. Тако,калпастатин-посредована гломеруларна заштита може бити повезана са смањењем ензимске активности калпаина, што доводи до смањене деградације неких протеина подоцита.

Штавише, најмање 3аутофагија-сродни протеини су директне мете калпаина. АТГ5 цепају калпаини, што доводи до поремећаја у формирању комплекса АТГ12-АТГ5.57,58 Примена инхибитора калпаина ин виво такође је спречила цепање протеина аутофагије Бецлин-1.59 Ин силицо анализа претпостављено место цепања на протеинима повезаним са аутофагијом подржава хипотезу да би калпаин могао да регулише аутофагију кроз ензимско цепање протеина аутофагије.

Цистанцхе-функција бубрега

експресија мРНА ендоплазматског ретикулума (ЕР) и маркера оксидативног стреса у гломерулима код мишева третираних са АнгИИ плус ХСД

Процењивали смо стрес ендоплазматског ретикулума (ЕР) и оксидативни стрес квантитативним ПЦР у гломерулима током третмана АнгИИ þ ХСД (Табела 1). На почетку, нисмо приметили никакву промену у експресији мРНА анализираних гена у гломерулима од ВТ и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева (додатна слика С7). После 6 недеља хипертензије, гломерули из Нпхс2. цре Атг5лок/лок мишеви су показали различите мРНА профиле гена ЕР стреса и путева оксидативног стреса са повећаном експресијом Сод1, Прдк1, Атф4, Гпк1 и Хсп90б1 у поређењу са ВТ гломерулима, што сугерише дааутофагијасмањење у подоцитима фаворизује АнгИИ þ ХСД-индуковани ЕР стрес и оксидативни стрес. Супротно томе, гломерули из ЦСТТг мишева су показали смањење регулације неколико гена ЕР стреса и путева оксидативног стреса, као и смањену експресију неких про-апоптотичких гена (Слика 9).

Узети заједно, ови резултати указују на токалпастатинпрекомерна експресија би могла да спречи повреду гломерула смањењем АнгИИ þ ХСД-индукованог ЕР и оксидативног стреса.

ДИСКУСИЈА

У овој студији, показали смо да је код АнгИИ þ ХСД-индуковане хипертензије, аутофагија подоцита значајно смањена. Штавише, мишеви са подоцит-специфичном делецијом Атг5 били су склонији гломерулосклерози изазваној АнгИИ þ ХСД и губитку подоцита, што је показало дааутофагијау подоцитима спречава развој хипертензивне нефропатије, наглашавајући критичну улогу аутофагије у АнгИИ þ ХСД-индукованој повреди подоцита. Мало се зна о екстрацелуларним стимулансима који регулишу ћелијску аутофагију, а ови резултати бацају светло на патофизиолошку регулацију аутофагије подоцита помоћу АнгИИ.

У већини људских гломерулопатија, брисање процеса стопала подоцита је обележје гломеруларне повреде која доводи до протеинурије. Аутофагија ће вероватно играти кључну улогу у одржавању функције подоцита јер ове терминално диференциране ћелије показују високу стопуаутофагијачак и у одсуству стреса. Претходна студија је показала да АнгИИ промовише аутофагију кроз стварање реактивних врста кисеоника у условно бесмртној ћелијској линији мишјих подоцита.60 Производња реактивних врста кисеоника је заиста општи индуктор аутофагије у многим типовима ћелија, а разлози за такво неслагање са нашим налазима су нејасно. За разлику од ове последње студије, користили смо мишје примарно култивисане подоците који задржавају експресију подоцина и нефрина и ин виво приступе, а не мишје ћелијске линије. Потврђујемо претходне извештаје да постмитотични подоцити показују необично висок ниво конститутивностиаутофагија. Мерење повећане количине ЛЦ3-ИИ после стимулације АнгИИ у присуству или одсуству инхибитора лизозома је неопходно да би се утврдило да ли је аутофагични ефлукс повећан или блокиран. Досадашња истраживања су занемарила овај феномен.60

Слика 7 |Цалпастатинпрекомерна експресија спречава повреду подоцита посредовану дијетом са високим садржајем соли (ХСД) ангиотензином ИИ (АнгИИ) Д код мишева зеленог ФЛ флуоресцентног протеина (ГФП) – ЛЦ3. (а) АнгИИ þ ХСД је резултирао драматичним повећањем албуминурије код ГФП-ЛЦ3 мишева у поређењу са ЦСТТг (калпастатин трансгеничним) ГФП-ЛЦ3 мишевима. н=8 до 13 мишева по генотипу. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Двосмерна анализа варијансе: генотип, П=0.0429; време, П=0.0165. Сидаков тест вишеструког поређења: *П=0.0453 за ГФП-ЛЦ3 у односу на ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишеве на дан 28. (б,ц) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије Вилмовог тумора 1 (ВТ1; зелено) и нефрина (НПХС1) (црвено) у гломерулима од 18-недељних ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева после 6 недеља инфузије АнгИИ þ ХСД. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Шипке=50 мм. Квантификација (д) површине НПХС1 по гломеруларном делу и (е) броја ВТ1 ћелија по гломеруларном делу код 18-недељних ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева после 6 недеља инфузије АнгИИ þ ХСД. н=19 ГФП-ЛЦ3 мишева и н=25 ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Неупарени т-тест са једнаким СД: **П=0.0010 у (д), П= 0.1158 у (е). (ф, г) Трансмисионе електронске микроскопске слике гломерула из ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева након 6 недеља АнгИИ þ ХСД. Врхови стрелица указују на брисање процеса стопала. Шипке=1 мм. (х) Квантификација броја стопала по микрометру базалне мембране гломерула (ГБМ). н=3 мишева по генотипу. Вредности су представљене као појединачне дијаграме и средње вредности СЕМ. Сваки графикон представља средњи број подоцита по микрометру ГБМ на 1 континуираној дужини ГБМ. Неупарени т-тест са једнаким СД: П=0.7512. Да бисте оптимизовали гледање ове слике, погледајте онлајн верзију овог чланка на ввв.бубрега-интернатионал.орг.

Овде смо користили хипертензивни модел заснован на АнгИИ перфузији и ХСД-у. Подоцити показују АТ1 рецепторе и изложени су слободно филтрираним пептидима као што је АнгИИ.13,16,26,61–65 Претпоставља се да би уочени ренопротективни ефекти инхибиције РААС могли бити – барем делимично – због блокаде овог подоцита. специфични РААС. Слично, ин виво студије су потврдиле ефекат АнгИИ на повреду подоцита, а циљање гена АТ1 специфично за подоците показало је да је активација АТ1 рецептора у гломерулу код експерименталног лупус нефритиса довољна да убрзабубрегаповреда у одсуству хипертензије.66,67 Калпаин-посредованоаутофагијадисрегулација у нашем моделу може бити повезана са директном сигнализацијом АнгИИ-АТ1 на подоцитима или да буде последица хипертензије. Можемо дати рани одговор на ово питање. Заиста, у моделу ДОЦ-соли, такође смо пронашли акумулацију П62 у подоцитима хипертензивних мишева (додатна слика С3). Ово сугерише да се блокада аутофагије јавља у подоцитима у овом моделу, за који се претпоставља да је независан од АнгИИ.68 Даље студије које процењују повреду подоцита која се односи на активност калпаина и аутофагични ефлукс код мишева са недостатком АТ1 у подоцитима би селективно била потребна да би се разграничила таква регулација. аутофагије подоцита зависи од директних или индиректних ефеката АнгИИ.

Слика 8 |Цалпастатинпрекомерна експресија спречава ангиотензин ИИ (АнгИИ) Д дијету са високим садржајем соли (ХСД) изазвануаутофагијасмањење регулације у подоцитима. (а, б) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије П62 (зелено) и подокаликсина (ПОДКСЛ; црвено) у гломерулима из зеленог ФЛ флуоресцентног протеина (ГФП) – ЛЦ3 и ЦСТТг (калпастатинтрансгени) ГФП-ЛЦ3 мишеви након 6 недеља АнгИИ þ ХСД. Подделови слике са основним бројем означавају веће увећање. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Шипке=50 мм. (ц,д) Квантификација површине П62þ по гломеруларном пресеку. н=9 мишева дивљег типа (ВТ) и н=7 ЦСТТг мишева у (ц), и н=16 ГФП-ЛЦ3 мишева и н=16 ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева у (д). Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Манн-Вхитнеи тест: **П=0.0033 у (ц), **П=0.0011 у (д). (е, ф) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије ГФП (зелено) и П62 (црвено) у гломерулима од ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева након 6 недеља АнгИИ þ ХСД. Подделови слике са основним бројем означавају веће увећање. Врхови стрелица указују на ГФПþ П62þ аутофагозоме. (г) Квантификација броја ЛЦ3 þ П62 þ тачака по подоциту. н=11 ГФП-ЛЦ3 мишева и н=16 ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и средња вредност±СЕМ. Неупарени т-тест са једнаким СД: П=0.1014. Да бисте оптимизовали гледање ове слике, погледајте онлајн верзију овог чланка на ввв.бубрега-интернатионал.орг.

Табела 1|Прилагођени РТ2 Профилер ПЦР низ

Калпаин-1 и калпаин{1}} су свеприсутне проинфламаторне протеазе, чију активност контролишукалпастатин, њихов специфични инхибитор. Заиста, калпастатин селективно инхибира калпаине и ниједну другу протеазу до данас. Активација калпаина је недавно повезана сабубрегаповреда у неколико патолошких контекста.69,70 Утврђено је да пролазни потенцијални потенцијални потенцијални рецептор за преносник калцијумских канала канал Ц6 активира калпаин-1 у подоцитима преко Ца2þ/калцинеурина активације. Бубрези пацијената са фокалном и сегментном гломерулосклерозом имали су повећану експресију Ц6 канала потенцијалног пролазног рецептора, повећану активност калпаина и калцинеурина и смањену експресију циљног талина калпаина-1, што је критично за стабилност цитоскелета подоцита.71 Канал потенцијалног пролазног рецептора Ц6 се такође директно везује за калпаин-1 и калпаин-2. Ова интеракција је кључна за регулацију цепања талина{11}} и контролу покретљивости подоцита.72

Прекомерна експресија трансгених мишевакалпастатинзаштићени су од васкуларног ремоделирања и АнгИИ зависне инфламације73; против запаљења код модела гломерулонефритиса,43 сепсе,74 или одбацивања алографта75; и против инфламације повезане са старењем.76 Повреда подоцита код ових мишева није истражена. Пелтиер ет ал. показао да претерано изражавањекалпастатинспречио АнгИИ зависну периваскуларну инфламацију у бубрезима.43 Дакле, заштита бубрега код ЦСТТг мишева може бити посредована, барем делимично, антиинфламаторним механизмом. Процењивали смо инфилтрацију макрофага и лимфоцита у нашем моделу и нисмо нашли значајну разлику убубрегазапаљење између ЦСТТг и контролних мишева када се анализира глобалнобубрегаинфилтрација леукоцита (додатна слика С6).

Калпаин је недавно био укључен у регулацију аутофагије (рецензирано недавно у Вебер ет ал.53) са занимљивим и биопротективним својствима инхибиције калпаина у дијабетичком контексту кроз рестаурацијуаутофагија.77 Овде смо известили да је инхибиција калпаина прекокалпастатинпрекомерна експресија (и) спречила је повреду подоцита током хипертензије и (ии) обновила аутофагију у подоцитима, наглашавајући тако нову штетну улогу активације калпаина током хипертензије кроз инхибицијуаутофагија.

Показало се да су скоро сви АТГ протеини цепани калпаинима ин витро. 78 Овде смо то постулиралиаутофагијаодржавање код хипертензивних ЦСТТг мишева је посредовано инхибицијом калпаина. Да бисмо подржали нашу хипотезу, показали смо да подоцити из ЦСТТг имају смањену активност калпаина када су изазвани АнгИИ ин витро (Слика 3ц). Открили смо повећан ниво протеина АТГ5 у подоцитима ЦСТТг мишева, што сугерише да је прекомерна експресија калпастатина спречила цепање АТГ5 посредовано калпаином у овом контексту (Слика 5а). Насупрот томе, показало се дакалпастатин-посредована инхибиција калпаина могла би бити независна од инхибиције њихове протеазне активности79; према томе, нисмо могли искључити регулацију аутофагије калпастатином независно од ензимске активности калпаина.

Укратко, ови налази су открили раније непрепознату улогукалпастатину регулацији подоцитааутофагијаи пружио је вођство за истраживање нових терапијских стратегија за побољшање преживљавања подоцита током хипертензивних нефропатија.

ОТКРИВАЊЕ

Сви аутори су се изјаснили да нема супротстављених интереса.

ЗАХВАЛНИЦЕ

Овај рад су подржали Институт Натионал де ла Санте Ет де ла рецхерцхе Медицале (Инсерм) и Университе де Парис. ИБ је подржала дипломирана стипендија Министарства националног образовања, де ла Рецхерцхе ет де ла Тецхнологие. ОЛ је финансиран кроз награду Европске фондације за проучавање дијабетеса (ЕФСД) коју подржава ЕФСД/Ново Нордиск програм за истраживање дијабетеса у Европи и грант од Социете Францопхоне дуДиабете (СФД). БР и ЦХ су финансирани почетним грантом 107037 од Европског истраживачког савета и Европске уније (П-ЛТ). ИС је подржала дипломирана стипендија Фондације де Франс.

Захваљујемо се Елизабетх Хуц, Ницоласу Перезу, Цорини Сулдац и тиму ЕРИУ970 (Университе де Парис, ПАРЦЦ, Инсерм, Париз, Француска) на помоћи у нези и руковању животињама, Ницолас Сорхаиндо за биохемијска мерења (ИЦБ-ИФР2, Лаборатоире де Биоцхимие,Хопитал Бицхат , Париз, Француска), и Алаин Сцхмитт и Јеан-Марц Массефор трансмисиона електронска микроскопија (Институт Цоцхин, Париз, Француска). Захваљујемо Моргане Ле Галл (Цоцхин протеомиц фацилити 3П5, Париз, Француска) на помоћи у ин силико анализи. Признајемо административну подршку Вероник Обервајс, Бруна Пилара и Сирила Махјеа (Университе де Парис, ПАРЦЦ, Инсерм, Париз, Француска).

ДОДАТНИ МАТЕРИЈАЛ

Додатни фајл (ПДФ)

Слика С1. Примарна култура подоцита изражава маркере подоцита. Вестерн блот анализа експресије маркера подоцита НПХС1 и НПХС2 у примарној култури подоцита код ВТ и ЦСТТг мишева. Тубулин (ТУБА) служи као контрола оптерећења. Представник н=4 мишева по генотипу.

Слика С2. Висок базални ниво подоцитааутофагија. (А, Б) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије ГФП (зелено) и НПХС1 (црвено) у гломерулима ГФП-ЛЦ3 мишева третираних или не са ЦК (80мг/кг) 4 сата пре убијања. Стрелице показују ГФПþ аутофагозоме. (Ц,Д) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије ГФП (зелено) и П62 (црвено) у гломерулима од ГФП-ЛЦ3 мишева третираних или не са ЦК (80 мг/кг) 4 сата пре убијања. Стрелице показују ГФПþ П62þ аутофагозоме. (А–Д) (0 ) представљају веће увећање. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Шипка=50 мм. Н=4 мишева по стању (Е–Х) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије ГФП (зелено) и П62 (црвено) у примарним подоцитима из ГФП-ЛЦ3 мишева третираних (Ф, Х) или не (Е, Г ) са Бафифиломицином А1 (100 нМ) током 4 сата. Н=5 мишева по стању.

Слика С3. П62 се акумулира у подоцитима у ДОЦ-сол моделу хипертензије. (А-Ц) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије П62 (зелено) и ПОДКСЛ (црвено) у гломерулима од ВТ мишева након 2 до 6 недеља модела ДОЦ-соли. (0) представљају веће увећање. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). Шипка ¼ 50 мм. (Д) Квантификација површине П62 по површини подоцита (проценти). Н=5–6 мишева по стању. Једносмерна анализа варијансе: време П=0.0059, Сидаков тест вишеструког поређења: Д42 наспрам Д14 **П=0.0055, Д28 наспрам Д14 П=0.8590.

Слика С4. Подоцитаутофагијанеопходан је за развој подоцита. (А) Систолни крвни притисак, (Б) однос албумина и креатинина у урину и (Ц) нивои азота уреје у крви код Атг5лок/лок и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева. Н=5–6 мишева по генотипу. Вредности су представљене као појединачне парцеле и средства±СЕМ. Манн-Вхитнеи тест: П=0.7273 (А), П=0.4286 (Б) и П=0.6623 (Ц). (Д–Е) Репрезентативне слике Массонових трихром-обојених делова гломерула код Атг5лок/лок и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева. (Ф–Г) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије ПОДКСЛ (зелено) и ВТ1 (црвено) код Атг5лок/лок и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева. Језгра су обојена Хоецхстом (плаво). (Д–Г) Шипка=50 мм. Н=6 мишева по генотипу. (Х–И) Репрезентативне фотомикрографије пресека гломерула трансмисионе електронске микроскопије код Атг5лок/лок и Нпхс2.цре Атг5лок/лок мишева. Шипка=1 мм. Н=3 мишева по генотипу.

Слика С5.Цалпастатинпрекомерна експресија не утичебубрегафункционишу на почетку. (А) ниво азота уреје у крви и (Б) ниво албумина у плазми код мишева ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 старих 12-недеља. Н=5 ГФП-ЛЦ3 и Н=6 ЦСТТг ГФП-ЛЦ3. Вредности су представљене као појединачне парцеле и средства±СЕМ. Манн-Вхитнеи тест: П=0.6623 (А) и П=0.9307 (Б). (Ц, Д) Репрезентативне слике Массонових трихром обојених делова гломерула од ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева. (Е-Х) Репрезентативне имунофлуоресцентне слике експресије ПОДКСЛ (Е, Ф) и НПХС1 (Г, Х) код ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева. (Ц–Х) Бар=50 мм. (И, Ј) Повезана квантификација ПОДКСЛ и НПХС1 површине по гломеруларном пресеку. Н=5 ГФП-ЛЦ3 и Н=6 ЦСТТг ГФП-ЛЦ3. Вредности су представљене као појединачне парцеле и средства±СЕМ. Манн-Вхитнеи тест: П=0.1898 (А) и П=0.8413 (Б).

Цистанцхе-функција бубрега

Слика С6.Цалпастатинпрекомерна експресија не утиче на глобално запаљење бубрега. Репрезентативна имунохистохемија експресије Ф4/80 (А, Б) и ЦД3 (Д-Е) код ГФП-ЛЦ3 и ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 мишева након 6 недеља ангиотензина ИИ þХСД. Шипка =200 мм. (Ц, Ф) Повезана квантификација Ф4/80 и ЦД3 површине побубрегаодељак. Н=7 ЦСТТг ГФП-ЛЦ3 и Н=8 ГФП-ЛЦ3 мишева. Вредности су приказане као појединачне дијаграме и СЕМ средње вредности. Манн-Вхитнеи тест: П=0.3969 (Ц) П= 0.3357 (Ф).

Слика С7. Подоцитаутофагијаdeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.

Табела С1. Ин силицо предвиђање места цепања калпаина. Места цепања калпаина су предвиђена у протеинима повезаним са подоцитима и аутофагијом помоћу ГПС-ЦЦД (хттп://ццд.биоцуцкоо.орг), ЦаМПДБ (ХТТП:// цалпаин.орг) и ДеепЦалпаин Предицт (хттп://деепцалпаин. цанцербио.инфо/хелп.пхп). Додатна датотека (Екцел)

Додатна табела С2. Потпуна датотека ин силицо прегледа места цепања калпаина. Предвиђена су места цепања калпаина у подоцитима повезаним иаутофагија-протеини повезани са ГПС-ЦЦД (хттп://ццд. биоцуцкоо.орг), ЦаМПДБ (хттп://цалпаин.орг) и ДеепЦалпаин Предицт (хттп://деепцалпаин.цанцербио.инфо/хелп.пхп). Предвиђена места цепања се настављају за сваки протеин за ГПС-ЦЦД и ДеепЦалпаин Предицт.

РЕФЕРЕНЦЕ

1. Цоресх Ј, Селвин Е, Стевенс ЛА, ет ал. Преваленција хроничнихбубрегаболест у Сједињеним Државама. ЈАМА. 2007;298:2038–2047.

2. Цоллинс АЈ, Вассалотти ЈА, Ванг Ц, ет ал. Ко би требало да буде циљан за скрининг на ЦКД? Утицај дијабетеса, хипертензије и кардиоваскуларних болести. Ам Ј Киднеи Дис. 2009;53:С71–С77.

3. Цханг ТИ, Ли С, Цхен СЦ, ет ал. Фактори ризика за ЕСРД код особа са очуваном процењеном ГФР са и без албуминурије: резултати из Програма ране евалуације бубрега (КЕЕП). Ам Ј Киднеи Дис. 2013;61:С4–С11.

4. Хсу ЦИ, МцЦуллоцх ЦЕ, Дарбиниан Ј, ет ал. Повишен крвни притисак и ризик од завршног стадијума бубрежне болести код субјеката без почетне болести бубрега. Арцх Интерн Мед. 2005;165:923–928.

5. Нагасе М, Схибата С, Иосхида С, ет ал. Повреда подоцита лежи у основи гломерулопатије Дахлових пацова са хипертензијом и поништена је блокатором алдостерона. Хипертензија. 2006;47:1084–1093.

6. Гаровић ВД, Вагнер СЈ, Турнер СТ, ет ал. Излучивање подоцита у урину као маркер за прееклампсију. Ам Ј Обстет Гинецол. 2007;196, 320.е321–е327.

7. Цраици ИМ, Вагнер СЈ, Баилеи КР, ет ал. Подоцитурија претходи протеинурији и клиничким карактеристикама прееклампсије: лонгитудинална проспективна студија. Хипертензија. 2013;61:1289–1296.

8. Ванг Г, Лаи ФМ, Кван БЦ, ет ал. Губитак подоцита код хипертензивне нефросклерозе код људи. Ам Ј Хипертенс. 2009;22:300–306.

9. Ванг Г, Кван БЦ, Лаи ФМ, ет ал. Интраренална експресија миРНА код пацијената са хипертензивном нефросклерозом. Ам Ј Хипертенс. 2010;23:78–84.

10. Руггененти П, Перна А, Гхерарди Г, ет ал. Хроничне протеинуричне нефропатије: исходи и одговор на лечење у проспективној кохорти од 352 пацијента са различитим обрасцима оштећења бубрега. Ам Ј Киднеи Дис. 2000;35:1155–1165.

11. Фукуда А, Вицкман ЛТ, Венкатаредди МП, ет ал. Упорни губитак подоцита зависан од ангиотензина ИИ из дестабилизованих гломерула изазива прогресију завршног стадијумабубрегаболест. Киднеи Инт. 2012;81:40–55.

12. Тунцдемир М, Озтурк М. Ефекти блокатора рецептора ангиотензина-ИИ на оштећење подоцита и гломеруларну апоптозу у пацовском моделу експерименталне дијабетичке нефропатије изазване стрептозотоцином. Ацта Хистоцхем. 2011;113:826–832.

13. Нијенхуис Т, Слоан АЈ, Хоендероп ЈГ, ет ал. Ангиотензин ИИ доприноси повреди подоцита тако што повећава експресију ТРПЦ6 преко НФАТ-посредованог сигналног пута позитивне повратне спреге. Ам Ј Патхол. 2011;179:1719–1732.

14. Студијска група ЕУЦЛИД. Рандомизовано плацебо контролисано испитивање лизиноприла код нормотензивних пацијената са дијабетесом зависним од инсулина и нормоалбуминуријом или микроалбуминуријом. Ланцет. 1997;349:1787–1792.

15. де Зееув Д, Ремуззи Г, Парвинг ХХ, ет ал. Протеинурија, циљ ренопротекције код пацијената са дијабетичком нефропатијом типа 2: лекције из РЕНТАЛ-а. Киднеи Инт. 2004;65:2309–2320.

16. Бенигни А, Гаглиардини Е, Ремуззи Г. Промене у селективности гломеруларне перм изазване ангиотензином ИИ имплицирају дисфункцију подоцита и преуређење протеина дијафрагме у прорезу. Семин Непхрол. 2004;24:131–140.

17. Ванг Л, Фланнери ПЈ, Спурнеи РФ. Карактеризација подтипова рецептора ангиотензина ИИ у подоцитима. Ј Лаб Цлин Мед. 2003;142:313–321.

18. Лангхам РГ, Келли ДЈ, Цок АЈ, ет ал. Протеинурија и експресија протеина дијафрагме подоцита, нефрина, у дијабетичкој нефропатији: ефекти инхибиције ензима који конвертује ангиотензин. Диабетологиа. 2002;45:1572–1576.

19. Накамура Т, Усхииама Ц, Сузуки С, ет ал. Ефекти инхибитора ангиотензин-конвертујућег ензима, антагониста рецептора ангиотензина ИИ и антагониста калцијума на уринарне подоците код пацијената са ИгА нефропатијом. Ам Ј Непхрол. 2000;20:373–379.

20. Хенгер А, Хубер Т, Фисцхер КГ, ет ал. Ангиотензин ИИ повећава активност цитосолног калцијума у ​​подоцитима пацова у култури. Киднеи Инт. 1997;52: 687–693.

21. Прага М, Хернандез Е, Монтоио Ц, ет ал. Дугорочни корисни ефекти инхибиције ензима који конвертује ангиотензин код пацијената са нефротском протеинуријом. Ам Ј Киднеи Дис. 1992;20:240–248.

22. Нитсцхке Р, Хенгер А, Рицкен С, ет ал. Ангиотензин ИИ повећава интрацелуларну активност калцијума у ​​подоцитима интактног гломерула.БубрегИнт. 2000;57:41–49.

23. Глои Ј, Хенгер А, Фисцхер КГ, ет ал. Ангиотензин ИИ модулира ћелијске функције подоцита. Киднеи Инт Суппл. 1998;67:С168–С170.

24. Мицели И, Бурт Д, Тараба Е, ет ал. Истезање смањује експресију нефрина преко механизма зависног од ангиотензина ИИ-АТ(1) у људским подоцитима: ефекат росиглитазона. Ам Ј Пхисиол Ренал Пхисиол. 2010;298:Ф381–Ф390.

25. Ендлицх Н, Ендлицх К. Стретцх, тенсион анд адхесион — адаптивни механизми актинског цитоскелета у подоцитима. Еур Ј Целл Биол. 2006;85:229–234.

26. Дурвасула РВ, Петерманн АТ, Хиромура К, ет ал. Активација локалног ткива ангиотензинског система у подоцитима механичким напрезањем. Киднеи Инт. 2004;65:30–39.

27. Рисер БЛ, Цортес П, Хеилиг Ц, ет ал. Циклична сила истезања селективно регулише трансформишуће бета изоформе фактора раста у мезангијалним ћелијама пацова у култури. Ам Ј Патхол. 1996;148:1915–1923.

28. Кретзлер М, Коеппен-Хагеманн И, Криз В. Оштећење подоцита је критичан корак у развоју гломерулосклерозе код пацова са хипертензијом са једноструком нефректомијом дезоксикортикостероном. Вирцховс Арцхив. 1994;425:181–193.

29. Јунг ХС, Цхунг КВ, Вон Ким Ј, ет ал. Губитак аутофагије смањује масу и функцију бета ћелија панкреаса са резултујућом хипергликемијом. Целл Метаб. 2008;8:318–324.

30. Ебато Ц, Уцхида Т, Аракава М, ет ал.Аутофагијаје важан у хомеостази острваца и компензаторном повећању масе бета ћелија као одговор на исхрану са високим садржајем масти. Целл Метаб. 2008;8:325–332.

31. Леноир О, Јасиек М, Хеникуе Ц, ет ал. Аутофагија ендотелних ћелија и подоцита синергистички штите од гломерулосклерозе изазване дијабетесом. Аутофагија. 2015;11:1130–1145.

32. Хартлебен Б, Годел М, Меиер-Сцхвесингер Ц, ет ал. Аутофагија утиче на подложност гломеруларним болестима и одржава хомеостазу подоцита код старијих мишева. Ј Цлин Инвест. 2010;120:1084–1096.

33. Сато С, Китамура Х, Адацхи А, ет ал. Два типа аутофагије у подоцитима у узорцима биопсије бубрега: ултраструктурна студија. Ј Субмицросц Цитол Патхол. 2006;38:167–174.

34. Асанума К, Танида И, Схирато И, ет ал. МАП-ЛЦ3, обећавајући аутофагозомални маркер, обрађује се током диференцијације и опоравка подоцита од ПАН нефрозе. ФАСЕБ Ј. 2003;17:1165–1167.

35. Мизусхима Н, Левине Б, Цуерво АМ, ет ал.Аутофагијабори се против болести кроз ћелијску самосварење. Природа. 2008;451:1069–1075.

36. Ианг Л, Ли П, Фу С, ет ал. Дефектна аутофагија јетре код гојазности промовише ЕР стрес и узрокује резистенцију на инсулин. Целл Метаб. 2010;11:467–478.

37. Ксие З, Клионски ДЈ. Формирање аутофагосома: језгро машине и адаптације. Нат Целл Биол. 2007;9:1102–1109.

38. Куме С, Тхомас МЦ, Коиа Д. Сенсинг нутријената, аутофагија и дијабетичка нефропатија. дијабетеса. 2012;61:23–29.

39. Куме С, Узу Т, Маегава Х, ет ал. Аутофагија: нова терапијска мета забубрегаболести. Цлин Екп Непхрол. 2012;16:827–832.

40. Хубер ТБ, Еделстеин ЦЛ, Хартлебен Б, ет ал. Нова улогааутофагијау функцији бубрега, болестима и старењу. Аутофагија. 2012;8:1009–1031.

41. Веиде Т, Хубер ТБ. Импликације аутофагије на старење гломерула и болести. Целл Тиссуе Рес. 2011;343:467–473.

42. Борк Т, Лианг В, Иамахара К, ет ал. Подоцити одржавају високе базалне нивое аутофагије независно од мтор сигнализације. Аутофагија. 2020;16:1932–1948.

43. Пелтиер Ј, Беллоцк А, Перез Ј, ет ал. Активација и секреција калпаина промовишу повреду гломерула код експерименталног гломерулонефритиса: докази изкалпастатин-трансгени мишеви. Ј Ам Соц Непхрол. 2006;17:3415–3423.

44. Моеллер МЈ, Санден СК, Соофифи А, ет ал. Подоцит-специфична експресија Цре рекомбиназе код трансгених мишева. Генесис. 2003;35:39–42.

45. Хара Т, Накамура К, Матсуи М, ет ал. Потискивање базалне аутофагије у нервним ћелијама изазива неуродегенеративну болест код мишева. Природа. 2006;441: 885–889.

46. ​​Лазаретх Х, Хеникуе Ц, Леноир О, ет ал. Тетраспанин ЦД9 контролише миграцију и пролиферацију паријеталних епителних ћелија и прогресију гломеруларне болести. Нат Цоммун. 2019;10:3303.

47. Боллее Г, Фламант М, Сцхордан С, ет ал. Рецептор епидермалног фактора раста промовише повреду гломерула и бубрежну инсуфицијенцију код брзо прогресивног полумесечастог гломерулонефритиса. Нат Мед. 2011;17:1242–1250.

48. Леноир О, Милон М, Вирсолви А, ет ал. Директно дејство ендотелина-1 на подоците промовише дијабетичку гломерулосклерозу. Ј Ам Соц Непхрол. 2014;25:1050–1062.

49. Хеникуе Ц, Боллее Г, Леноир О, ет ал. Фактор 2 повезан са нуклеарним фактором еритроидом 2- покреће подоцит-специфичну експресију рецептора г активираног пролифератором пероксизома који је неопходан за отпорност на полумесечасти ГН. Ј Ам Соц Непхрол. 2016;27:172–188.

50. Перез Ј, Дансоу Б, Херве Р, ет ал. Калпаини које ослобађају Т лимфоцити цепају ТЛР2 да би контролисали експресију ИЛ-17. Ј Иммунол. 2016;196:168–181.

51. Раимбоург К, Перез Ј, Вандермеерсцх С, ет ал. калпаин/калпастатинсистем има супротну улогу у расту и метастатској дисеминацији меланома. ПЛоС Оне. 2013;8:е60469.

52. Летаверниер Б, Зафрани Л, Нассар Д, ет ал. Калпаини доприносе поправљању крвних судова у брзо прогресивном облику гломерулонефритиса: потенцијална улога њихове екстернализације. Артериосцлер Тхромб Васц Биол. 2012;32:335–342.

53. Вебер ЈЈ, Переира Сена П, Сингер Е, ет ал. Убијање две љуте птице једним ударцем:аутофагијаактивација инхибицијом калпаина код неуродегенеративних болести и шире. Биомед Рес Инт. 2019;2019:4741252.

54. Лиу З, Цао Ј, Гао Кс, ет ал. ГПС-ЦЦД: нови рачунарски програм за предвиђање места цепања калпаина. ПЛоС Оне. 2011;6:е19001.

55. дуВерле Д, Такигава И, Оно И, ет ал. ЦаМПДБ: ресурс за калпаин и модулациону протеолизу. Геноме Информ. 2010;22:202–213.

56. Лиу ЗКС, Иу К, Донг Ј, ет ал. Прецизно предвиђање места цепања калпаина и њиховог одступања узрокованог мутацијама у канцеру. Фронт Генет. 2019;10:715.

57. Иоусефифи С, Пероззо Р, Сцхмид И, ет ал. Калпаин посредовано цепање Атг5 пребацује аутофагију на апоптозу. Нат Целл Биол. 2006;8:1124–1132.

58. Ксиа ХГ, Зханг Л, Цхен Г, ет ал. Контрола базалне аутофагије цепањем АТГ5 посредованим калпаином1.Аутофагија. 2010;6:61–66.

59. Руссо Р, Берлиоццхи Л, Адорнетто А, ет ал. Калпаин-посредовано цепање Бецлин-1 и дерегулација аутофагије након исхемијске повреде мрежњаче ин виво. Целл Деатх Дис. 2011;2:е144.

60. Иадав А, Валлабу С, Арора С, ет ал. АНГ ИИ промовишеаутофагијау подоцитима. Ам Ј Пхисиол Целл Пхисиол. 2010;299:Ц488–Ц496.

61. Фланнери ПЈ, Спурнеи РФ. Трансактивација рецептора епидермалног фактора раста ангиотензином ИИ у гломеруларним подоцитима. Нефрон Експ Нефрол. 2006;103:е109–е118.

62. Харрисон-Бернард ЛМ, Навар ЛГ, Хо ММ, ет ал. Имунохистохемијска локализација АНГ ИИ АТ1 рецептора код одраслих пацовабубрегакористећи моноклонско антитело. Ам Ј Пхисиол. 1997;273:Ф170–Ф177.

63. Лиебау МЦ, Ланг Д, Бохм Ј, ет ал. Функционална експресија ренин ангиотензинског система у људским подоцитима. Ам Ј Пхисиол Ренал Пхисиол. 2006;290:Ф710–Ф719.

64. Награда Павенстадт Х. Франц Волхард 2000: сигнализација ангиотензина ИИ у подоциту. Киднеи Блоод Пресс Рес. 2000;23:156–158.

65. Веннманн ДО, Хсу ХХ, Павенстадт Х. Систем ренин-ангиотензин алдостерон у подоцитима. Семин Непхрол. 2012;32:377–384.

66. Јиа Ј, Динг Г, Зху Ј, ет ал. Инфузија ангиотензина ИИ изазива промене експресије нефрина и апоптозу подоцита. Ам Ј Непхрол. 2008;28:500–507.

67. Цровлеи СД, Васиевицх МП, Руиз П, ет ал. Гломеруларни ангиотензински рецептори типа 1 повећавају повреду бубрега и упалу код мишјег аутоимуног нефритиса. Ј Цлин Инвест. 2009;119:943–953.

68. Сонг К, Стуарт Д, Абрахам Н, ет ал. Сакупљање ренина у каналу не посредује у хипертензији ДОЦА соли или оштећењу бубрега. ПЛоС Оне. 2016;11: е0159872.

69. Лиу З, Ји Ј, Зхенг Д, ет ал. Заштитна улога ендотелног нокаута калпаина у акутној болести изазваној липополисахаридомбубрегаповреда услед слабљења пута п38-иНОС и производње НО/РОС. Екп Мол Мед. 2020;52:702–712.

70. Серемве М, Сцхнеллманн РГ, Боллаг ВБ. Активност калпаина{1}} лежи у основи производње алдостерона изазване ангиотензином ИИ у моделу ћелија рулозе надбубрежног глома. Ендоцринологи. 2015;156:2138–2149.

71. Верхеијден КАТ, Сонневелд Р, Баккер-ван Беббер М, ет ал. Протеаза зависна од калцијума калпаин-1 повезује активност ТРПЦ6 са повредом подоцита. Ј Ам Соц Непхрол. 2018;29:2099–2109.

72. Фармер ЛК, Ролласон Р, Вхитцомб ДЈ, ет ал. ТРПЦ6 се везује за и активира калпаин, независно од активности његовог канала, и регулише цитоскелет подоцита, ћелијску адхезију и покретљивост. Ј Ам Соц Непхрол. 2019;30: 1910–1924.

73. Летаверниер Е, Перез Ј, Беллоцк А, ет ал. Циљање на систем калпаин/калпастатин као нова стратегија за спречавање кардиоваскуларног ремоделирања код хипертензије изазване ангиотензином ИИ. Цирц Рес. 2008;102:720–728.

74. Зафрани Л, Геротзиафас Г, Бирнес Ц, ет ал.Цалпастатинконтролише полимикробну сепсу ограничавањем ослобађања микрочестица прокоагуланта. Ам Ј Респир Црит Царе Мед. 2012;185:744–755.

75. Летаверниер Е, Дансоу Б, Лоцхнер М, ет ал. Критична улога равнотеже калпаин/калпастатин у акутном одбацивању алографта. Еур Ј Иммунол. 2011;41: 473–484.

76. Ханоуна Г, Меснард Л, Вандермеерсцх С, ет ал. Специфична инхибиција калпаина штитибубрегапротив упале. Сци Реп. 2017;7:8016.

77. Онг СБ, Лее ВХ, Схао НИ, ет ал. Инхибиција калпаина се враћааутофагијаи спречава фрагментацију митохондрија у хуманом иПСЦ моделу дијабетичке ендо лиопатије. Матичне ћелије Реп. 2019;12:597–610.

78. Норман ЈМ, Цохен ГМ, Бамптон ЕТ. Ин витро цепање високих протеина протеазама ћелијске смрти. Аутофагија. 2010;6:1042–1056.

79. Де Туллио Р, Аверна М, Педраззи М, ет ал. Диференцијална регулација комплекса калпаин-калпастатин помоћу Л-доменакалпастатин. Биоцхим Биопхис Ацта. 2014;1843:2583–2591.