Недостатак калретикулина ремети биогенезу рибосома и доводи до ретардације у развоју ембрионалног бубрега

edmund.chen@wecistanche.com

Апстрактан

Нефрогенезу покрећу сложени сигнални путеви који контролишу раст и диференцијацију ћелија. Ендоплазматски ретикулум шаперон калретикулин (Цалр) је добро познат по својој функцији у складиштењу калцијума и у савијању гликопротеина. Његова улога убубрегаразвој још увек није схваћен. Пружамо доказе о кључној улози Цалра у нефрогенези у овој истрази. Показали смо да недостатак Цалр-а доводи до поремећеног формирања интактне нефрогене зоне и до ретардације нефрогенезе, о чему сведочи поремећај у формирању тела у облику зареза и С. Користећи приступе протеомике и транскриптомије, показали смо да поред промене у кључним протеинима који сигнализирају Внт, ембрионалнибубрезииз Цалр-а // показао је свеукупно оштећење експресије рибозомалних протеина што открива поремећаје у синтези протеина и нефрогенези. ЦРИСПР/цас9 посредовани нокаут потврдио је да је Цалр недостатак повезан са недостатком неколико рибосомских протеина и кључних протеина у биогенези рибозома. Наши подаци истичу директну везу између Цалр експресије и биогенезе рибозома.

Увод

Бубрегорганогенезу карактерише низ морфогенетских догађаја који је вођен растом и диференцијацијом ћелија. Током нефрогенезе, мезенхимско-епителна транзиција (МЕТ) и гранање мокраћоводног пупољка (УБ), које је резултат реципрочне индукције између УБ и метанефричног мезенхима (ММ) [1], су покретачке снаге за формирање нефрона. Током овог процеса, неопходна је сложена и реципрочна интеракција различитих сигналних путева да би се оркестрирала диференцијација епитела и формирање нефрона [1–3]. Међу кључним путевима у овом процесу, сигнализација неуротрофног фактора који потиче од глије (Гднф) преко свог Рет рецептора игра централну улогу током процеса који се зове уретерично пупање. Поремећај ове сигнализације може изазвати ектопични уретер илибубрежниагенеза када је сигнализација потпуно одсутна [4]. Осим Гднф/Рет сигнализације, познато је да канонска Внт/-цатенин сигнализација координира више аспекатабубрежниразвој унутар ММ и УБ [5] и инхибиција канонске Внт сигнализације у линији пупољака уретера и прогениторима нефрона резултирабубрежниагенеза [6]. Одржавање репрограмирања транскрипције током нефрогенезе зависи од доступности хроматина [7]. Показали смо да су протеини хетерохроматина, за које је познато да су укључени у епигенетску регулацију утишавања гена, неопходни за одржавање равнотеже између активатора гранања и инхибитора у раној фази развоја [7].

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ ФУНКЦИЈУ БУБРЕГА/БУБРЕГА

Калретикулин (Цалр) је промискуитетни пратилац ендоплазматског ретикулума (ЕР) са високим капацитетом везивања калцијума и ниским афинитетом, који су кључни за секвестрацију Ца2 плус у ЕР и различите ћелијске процесе укључујући трансдукцију сигнала, експресију гена и промет протеина [8,9]. Механизми који се баве улогом Цалр-а у болестима углавном су засновани на Ца2 плус хелацији од стране Ца2 плус-везујућег Ц-терминалног домена Цалр-а и његовој улози у одговору несавијеног протеина (УПР) [10,11]. УПР може да игра цитопротективну улогу током изазова са погрешно савијеним протеинима или може бити штетан за ћелије јер је апоптоза изазвана трајном УПР сигнализацијом. Иако се неколико студија бавило потенцијалном улогом Цалра у болестима кроз регулацију транскрипције, ЕР функција шаперона Цалра остаје један од кључних механизама за судбину ћелије [9,12]. Продужени ЕР стрес и погрешно савијање протеина су истакнути код разнихболести бубрегакао што су гломерулопатије, акутнеповреда бубрега, дијабетичка нефропатија,бубрежнифиброза и хроничнаобољење бубрега[13,14]. Улога Калра у ембрионалном развоју још увек није јасна. Цалр нокаут узрокује смртност ембриона током развојне фазе Е14.5 због поремећеног развоја срца [15]. Последице недостатка Цалр-а на молекуларне механизмебубрегаембрионални развој, међутим, још увек није у потпуности схваћен. У овој студији урадили смо компаративну транскриптомску и протеомску анализу ембрионалнихбубрегаод три генотипа Цалр плус / плус , Цалр плус // и Цалр / / и истакао утицај Цалр нокаута на нефрогенезу и на експресију рибозомалних протеина.

Кључне речи:недостатак калретикулина; нефрогенеза; рибосомална биогенеза, бубрези, бубрези

2. Резултати

2.1. Нокаут калретикулина резултира морфолошким и хистолошким абнормалностима бубрега и оштећеним гранањем бубрега

Генетски нокаут Цалр-а код мишева узрокује рану смртност ембриона због дефекта вентрикуларног септума [15]. Да би се истражило да ли Цалр нокаут утичебубрегаразвоја, ембриони миша у фази Е13.5 су припремљени од Цалр плус // трудних мишева (слика 1А). Цалр// ембриони су показали значајну промену раста у поређењу са Цалр плус / плус и Цалр плус // и открили значајно оштећење ембрионалног развоја. Бруто морфологија ембриона ибубрезипоказао значајно смањење величине између Цалр плус / плус и Цалр-// мишева са Цалр// мишевима који показују највећу абнормалност (Слика 1А). Да би се илустровао утицај нокаута Калра набубрегаразвоја и структуре, ембриони у три различите фазе развоја (Е13.5, Е14.5, Е16.5) и из три генотипа (Цалр плус / плус , Цалр плус // и Цалр//) ​​су жртвовани ибубрезидобијено. Секције ткива су показале различите фазе развојабубрег,који напредује кроз компликоване морфолошке структуре о чему сведоче ПАС и ХЕ-бојење пресека ткива.Бубрезииз истог ембрионалног стадијума са различитим генотиповима показали су различите нивое развоја (Слика 1Б). Штавише, значајне разлике убубрегаструктуре су уочене посебно када се Цалр // пореди са Цалр плус / плус и Цалр плус //. Ове разлике остају иу узнапредовалим фазама нефрогенезе (Слика 1Б). Цалр//бубрезипоказују озбиљно оштећење у поређењу са Цалр плус / плус и Цалр плус // (Слика 1Б). У фази Е13.5 величина Цалр-а//бубрегабила је мања а број мокраћоводних пупољака и грана мокраћовода знатно мањи. Слична запажања су направљена у фазама Е14.5 и Е16.5. Култура органа ембрионабубрезиод три генотипа ембриона открили су значајан поремећај у гранању УБ ибубрегараст. Да бисте визуелизовалибубрежниструктуре, култивисани рудименти су обојени ламинином као маркером за базалну мембрану и лектином Долицхос бифлорус аглутинин (ДБА) да би се визуелизовала УБ.

Комбиновано ФЛ флуоресцентно бојење култивисаногбубрегаРудименти су показали значајно оштећење гранања које прати недостатак Цалр-а и доводи до укупног ретардације убубрегаразвој (Слика 2А,Б). У време изолације, Калр//бубрегарудименти су показали 6–10 УБ врхова, док су Цалр плус / плус и Цалр плус // рудименти показали 20–30 УБ врхова. Цалр плус / плус и Цалр плус // култивисани рудименти су се нормално развијали током периода културе (72 х) и показали су добро разгранату УБ (85 ± 9, н=6 сваки) као и различите познате структуре из виво развој бубрега. Културнибубрегадемонстрирани пред-цевасти агрегати,бубрежнивезикуле и мезенхим капице (слика 2А,Б). Насупрот томе, Цалр// рудименти нису успели да се нормално развијају и показали су значајну промену у гранању УБ (15 ± 3 н=6) (Слика 2Б).

Слика 2. Цалр−/− мишбубрегарудименти показују озбиљне промене у расту и гранању УБ. (А):БубрегРудименти из Цалр плус / плус Цалр плус /− и Цалр−/− (Е13.5) су изоловани и култивисани ек виво током три дана. Цалр−/−бубрегарудименти су показали општу промену у расту и значајну промену у гранању пупољака уретера. (Б): Имунофлуоресцентно бојењебубрегарудименти после три дана културе. Урађено је заједничко бојење ламинина (црвено) и ДБА лектина (зелено) да би се визуелизовале различите структуре рудимената. Квантификација гранања је постигнута пребројавањем броја грана пупољка уретера. Квантификација је представљена као тракасти графикон са тракама грешака. Свака трака представља средњу вредност гране ± сд од шест култивисаних рудимената. Значајне разлике: (*) п < 0.05,="" (***)="" п="">< 0,001.="" 2,5×="" 2,5×="" 2,5×="" инт.="" ј.="" мол.="" сци.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" од="" 21="" слика="" 2.="" цалр悆="" рудименти="" бубрега="" миша="" показују="" озбиљне="" промене="" у="" расту="" и="" гранању="" уб.="">БубрегРудименти из Цалр плус / плус Цалр плус // и Цалр / (Е13.5) су изоловани и култивисани ек виво током три дана. Цалр /бубрегарудименти су показали општу промену у расту и значајну промену у гранању пупољака уретера. (Б): Имунофлуоресцентно бојењебубрегарудименти после три дана културе. Урађено је заједничко бојење ламинина (црвено) и ДБА лектина (зелено) да би се визуелизовале различите структуре рудимената. Квантификација гранања је постигнута пребројавањем броја грана пупољка уретера. Квантификација је представљена као тракасти графикон са тракама грешака. Свака трака представља средњу вредност гране ± сд од шест култивисаних рудимената. Значајне разлике: (*) п < 0.05,="" (***)="" п=""><>

2.2. Недостатак Цалр је повезан са великим и значајним променама транскриптома

Морфолошка и хистолошка испитивања су показала оштећење убубрегаразвој у Цалр/ мишјим ембрионима у поређењу са Цалр плус / плус и Цалр плус // . Да би се истражило да ли је Цалр нокаут утицао на експресију кључних протеина и путева нефрогенезе, целокупне анализе транскриптомабубрегаРудименти су изведени из три генотипа ембриона. Да би се проценили различито изражени гени између Цалр плус / плус , Цалр плус // и Цалр /бубрегаузорци, квантитативни тестови засновани на бројању очитавања вршени су коришћењем Фишеровог егзактног теста са Бењамини-Хохберговим подешавањем за више тестова. Додатне слике С1 и С2 приказују топлотну мапу упоредне анализе између експресија гена убубрегарудименти од Цалр плус / плус , Цалр плус // и Цалр / . Да би се добио свеобухватан преглед промена експресије гена између Цалр плус / плус и Цалр/ бубрега, направљена је МА-графика са трансформисаном променом набора (ФЦ) експресије између Цалр плус / плус и Цалр / до лог2 трансформисаног просечан ниво експресије за сваки ген у свим узорцима (слика 3А, додатна слика С1). МА-графикон показује различито регулисане гене у Цалр плус / плус у поређењу са Цалр / . Функционална класификација регулисаних гена према биолошком процесу открила је промену развојног процеса у Цалр /бубрези(Слика 3Б, Додатна табела С1). Пажљивије истраживање напомене о путевима регулисаних гена открило је аберацију два главна процеса: Внт сигнализације и савијања протеина, јер је утврђено да је већина регулисаних протеина укључена у ова два главна пута (Слика 3Б). Хијерархијско груписање и груписање к-средстава на профилима експресије потврдили су да је ембрионалнибубрегатранскриптоми Цалр плус / плус и Цалр плус // су веома слични, али се значајно разликују од транскриптома Цалр / (слика 3Ц, додатне слике С1 и С2).

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ ИНФЕКЦИЈУ БУБРЕГА/БУБРЕГА

Наши подаци анализе транскриптома показали су да је нокаут Цалр-а био праћен променом експресије кључних протеина убубрегаразвој (Слике 3Ц и 4А, допунска табела С2) поред кључних протеина у Внт сигнализацији и великог броја нефрогених гена је смањен или није откривен у Цалр /бубрегарудименти (слика 3Ц, слика 4А). Између осталог, фактори транскрипције, као што су Сик1 и Сик2, за које је раније пријављено да функционишу у различитим фазама нефрогенезе, значајно су смањени у Цалр// ембрионалном бубрегу. Оср1 је један од гена чија је експресија потребна за Еиа1, Пак2, Сик2, Салл1 и ГДНФ и експресија овог гена је скоро изостала у Цалр / . Да би се истражио утицај промене Внт сигнализације и нефрогених кључних гена набубрегаразвој код Цалр нокаут мишева, имунофлуоресцентно бојење маркерима ембрионалног развоја спроведено је убубрегаделови из ембриона у фази Е14.5. Бојење је јасно потврдило промену истраживаних гена у Цалр-у / (Слика 4Б). Поред тога, у поређењу са Цалр плус / плус и Цалр плус // , Цалр /бубреганедостаје јасна нефрогена зона (Слика 4Б) о чему сведочи бојење и то потврђује озбиљне поремећаје убубрегаразвој у Цалр/ембрионима.

2.3. Упоредне протеомске анализе идентификовале су значајне промене у протеому Цалр/ембрионалног бубрега

Морфолошке и хистолошке анализе показале су да је ограничење Цалр-а проблематично за ембрионални развојбубрега. Да бисмо даље разумели улогу Калра убубрегаембрионални развој, широке протеомске анализе су спроведене на ембрионалномбубрезикористећи две стратегије. У првим експериментима користили смо 2Д-гел електрофорезу да упоредимо ембрионалнибубрегапротеоми из Цалр плус / плус и Цалр плус // ембриони миша из стадијума Е13.5. 2Д образац показао је значајну промену у протеому Цалр плус //бубрези(п < 0.05)="" (допунска="" слика="" с3а).="" идентификација="" протеина="" са="" различитим="" обиљем="" открила="" је="" промену="" у="" експресији="" протеина="" укључених="" у="" путеве="" стреса="" и="" у="" метаболизму="" рнк="" у="" цалр="" плус="">бубрега(Допунска слика С3Б, Ц). Да би се боље истражила промена протеома у Цалр плус // и Цалр悆 / у поређењу са Цалр плус / плусбубрега, извршили смо профилирање протеома засновано на спектрометрији масе (слика 5, додатне табеле С3-С8). Анализа преклапања показала је високу репродуктивност детекције протеина између генотипова (Слика 5А). Статистичка анализа је показала значајне промене у експресији протеина између Цалр плус / плус наспрам Цалр悆 / (слика 5А, додатне табеле С3 и С4, додатна слика С4А.), Цалр плус // наспрам Цалр/ (слика 5А, додатне табеле С5 и С6, додатна слика С4Б), и Цалр плус / плус у односу на Цалр плус // (слика 5А, додатне табеле С7 и С8, додатна слика С4Ц). Имунофлуоресцентно бојење потврдило је нокаут Цалр-а у Цалр-у //бубрези. Поред тога, потврдили смо налазе протеомике за два протеина са смањеном регулацијом у Цалр / : калбиндин 1 (Цалб-1) и супероксид дисмутаза 1 (Сод1). У случају Сод1, и протеомски и транскриптомски подаци открили су нокаут Сод1 у Цалр悆 // ембрионалномбубрегаи имунофлуоресцентно бојење потврдило је недостатак Сод1 у Цалр / ембрионалномбубрега(Слика 5Б). Сод1 је антиоксидативни металоензим који игра важну улогу у детоксикацији реактивних врста кисеоника (РОС) претварањем слободних супероксидних радикала у водоник пероксид за даљу детоксикацију ћелијским каталазама, чиме се спречава токсичност. Цалб-1 је главни интрацелуларни протеин који везује калцијум у дисталном конволутном тубулу (ДЦТ) и игра кључну улогу у трансћелијској реапсорпцији Ца2 плус. Као интрацелуларни Ца2 плус -пуфер и Ца2 плус -транситни протеин, Цалб-1 преноси Ца2 плус са апикалне на базолатералну страну без значајне модификације интрацелуларне Ца2 плус -концентрације. Веза између Цалр нокаута и промене у експресији оба протеина није јасна и захтева даље истраживање.

Слика 3. Упоредна анализа експресије гена код мишева са нокаутирањем калретикулина. (А): МА дијаграм који приказује опсежно регулисане и ниже регулисане гене у Цалр плус / плус мишевима у односу на Цалр /. Квантитативни тестови промене набора (на основу нормализованог лог трансформисаног броја читања) су изведени коришћењем Фишеровог егзактног теста са Бењамини–Хохберговом корекцијом (п < 0.05)="" и="" незначајни="" гени="" су="" представљени="" сивом="" бојом.="" ма="" дијаграм="" се="" користи="" за="" приказ="" различито="" експримираних="" гена="" у="" цалр="" плус="" плус="" вс.="" цалр="" (б):="" дистрибуција="" биолошких="" процеса="" гена="" са="" смањеном="" регулацијом="" у="" цалр-у/у="" поређењу="" са="" цалр="" плус="" плус="" -.="" класификација="" идентификованих="" гена="" је="" извршена="" коришћењем="" биоинформатичког="" алата="" давид.="" симбол="" гена="" је="" коришћен="" за="" категоризацију="" напомена="" о="" онтологији="" гена,="" нпр.="" биолошки="" процеси.="" (ц):="" анализа="" обогаћивања="" врхунских="" гена="" за="" које="" је="" утврђено="" да="" су="" значајно="" регулисани="" између="" три="" генотипа="" (цалр="" плус="" плус,="" цалр="" плус="" и="" цалр/).="" компаративна="" анализа="" је="" представљена="" као="" топлотна="" мапа="" (фц=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Класификација онтологије гена и анализе мреже интеракције протеин-протеин

Вулкански дијаграми и анализе тортног графикона су показале да промена Цалр експресије доводи до глобалних промена у ембрионалномбубрегапротеом (додатна слика С4). Да бисмо добили више информација о биолошким механизмима повезаним са ембриономбубрегаразвојне промене у Цалр / мишевима, комбиновали смо ДАВИД биоинформатику са информацијама о наводној функцији протеина пронађених у УниПрот и ГенБанк базама података. Класификација идентификованих протеина према њиховој укључености у биолошке процесе резултирала је у двадесет категорија, са девет високо заступљених категорија (додатна слика С4Д). Једна од главних категорија био је развојни процес, са више од 1000 идентификованих протеина који припадају овој групи. Пошто су интеракције протеин-протеин кључни механизми за скоро све биолошке процесе, укључујући развој, издвајање информација о могућим интеракцијама протеин-протеин и регулација пута који повезује регулисане протеине у Цалр плус // и Цалр/ ембрионалномбубрегаможе пружити значајне информације о процесима који су оштећени у условима недостатка Цалр-а. У ту сврху смо истражили мреже интеракција између регулисаних протеина користећи СТРИНГ 11.0 (хттп://стринг.ембл.де, приступљено 24. марта 2021). Даља анализа протеина експримираних само у Цалр плус / плус и Цалр плус // открила је два чвора јаке интеракције од протеина укључених у два главна процеса, а то су метаболизам РНК и оксидативна фосфорилација (додатна слика С5А). Ово сугерише да је Цалр / ембрионалнибубрегаможе да пати од абнормалности у метаболизму РНК и недостатка енергије. Истраживање мрежа интеракција између протеина прекомерно експримираних у Цалр плус / плус и Цалр плус // у поређењу са Цалр / снажно подржава наше претпоставке јер мреже показују три јака чвора интеракције. Два чвора су акумулирала протеине укључене у РНА-метаболизам и оксидативну фосфорилацију, док трећи чвор укључује рибозомске протеине и открио је поремећај у формирању рибозома и промету протеина (додатна слика С5Б). Пажљиво испитивање рибосомских протеина за које је утврђено да су регулисани показало је значајну промену протеина и великих и малих рибозомских подјединица и то је открило озбиљне поремећаје у биогенези рибозома и синтези протеина (Слика 6А-Д).

2.5. Цалр Кноцкоут доводи до промене у експресији рибозомалног протеина 

Транскриптомске и протеомске анализе података показале су значајну промену у експресији рибосомских протеина у Цалр/ ембрионалним мишевимабубрези. Вестерн блот анализа и МС квантификација ембрионабубрегаекстракти протеина из три генотипа потврдили су значајну снижену регулацију Рпс10, Рпс19 и Рпс26бубрези(Слика 7А) и Рпс12, Рпс13, Рпс14 Рпс15, Рпс17 и Рпс19 (додатна слика С6А, Б) у Цалр/. Штавише, бојење ембрионабубрегасекције су потврдиле степен промене у експресији рибозомалних протеина; Рпс10 или Рпс6 није могао бити откривен у Цалр/ембрионалномбубрегасекције (слика 7Б). Да бисмо истражили везу између Цалр нокаута и експресије рибосомског протеина, успоставили смо ин витро Цалр нокаут модел у МДЦКбубрежнићелије тубула које користе ЦРИСПР/цас9 ендонуклеазни систем. Вестерн блот анализе су потврдиле дозно-зависну регулацију Цалр експресије у МДЦК ћелијама и показале значајно смањење 40С рибозомалне подјединице које кодирају протеине Рпс10 и Рпс19, што је открило поремећај биогенезе рибозома. Штавише, експресија есенцијалних компоненти за синтезу протеина, на пример, елонгација, открила је да је фактор иницијације еЕИФ5а значајно смањен у Цалр кноцкоут МДЦК ћелијама (Слика 7Ц). Калров нокаут је био праћен значајним морфолошким, протеомским и транскриптомским изменама. Наша истраживања ин виво и ин витро додатно су истакла да су ове аберације биле праћене значајним падом биогенезе рибозома. Смањење експресије рибозомалног протеина у Цалр нокаутубубреганије био ограничен на ембрионалне стадијуме, већ се такође могао показати у ћелијама добијеним од одраслихбубрези, откривајући потенцијалну улогу Цалра у рибозомалној биогенези.

Слика 7. Недостатак Цалр-а је повезан са смањењем експресије рибозомалних протеина. (А): Вестерн блот анализе рибосомских протеина Рпс10, Рпс19 и Рпс26 у екстрактима протеина из Цалр плус / плус , Цалр плус // и Цалр // ембрионалнибубрези. Ембрионални бубрези су сакупљени од три различита трудна Цалр плус /- мишева. Након генотипизације, ембриони исте мајке и генотипа су груписани заједно и њихов ембрионалнибубрегапротеински екстракти су спојени заједно. Након процене протеина, Вестерн блот анализе су изведене у три примерка за сваки испитивани протеин. За компаративну анализу узорака коришћена је једносмерна АНОВА. Резултати су представљени као средња вредност ± сд из најмање три независна експеримента. Разлике су сматране статистички значајним када је п < 0.05.="" (б):="" имунофлуоресцентно="" бојење="" против="" рпс10="" и="" рпс6="" у="" цалр="" плус="" плус="" и="" цалр悆="" мбрионалним="" пресецима="" ткива="" бубрега="" са="" увећањем="" од="" 20×.="" (ц):="" вестерн="" блот="" анализа="" екстракта="" протеина="" из="" мдцк="" ћелија="" (лево)="" и="" квантификација="" мрна="" након="" нокаута="" цалр-а="" у="" мдцк="" ћелијама="" (десно).="" цалр="" је="" нокаутиран="" коришћењем="" система="" цриспр/цас9="" са="" две="" различите="" сгрна.="" вестерн="" блотови="" су="" испитани="" са="" цалр,="" гапдх,="" рпс10,="" рпс19="" и="" еиф5а="" антителима.="" квантификације="" цалр="" и="" рпс10="" мрна="" у="" узорку="" сгцалр-2="" су="" спроведене="" коришћењем="" кпцр.="" снижавање="" цалр-а="" коришћењем="" система="" цриспр/цас9="" открило="" је="" повезаност="" између="" цалр="" дефицита="" и="" промене="" у="" експресији="" рибосомског="" протеина.="" значајне="" разлике:="" (**)="" п="">< 0,01,="" (***)="" п="">< 0,001,="" (****)="" п=""><>

3. Дискусија

Тхебубрезиразвијају се кроз гранајућу морфогенезу, што је процес који укључује сложене процесе раста и диференцијације и вођен је сигналима који долазе из околних ћелија у мезенхимском одељку у настајању [16]. Током протеклих година, неколико кључних гена и путева убубрегаразвој су идентификовани. Трофични фактори, посебно ГДНФ, коштани морфогенетски протеини (БМП) и фактори раста фибробласта (ФГФ) су укључени убубрежнираст и диференцијацију. Они управљају сигнализацијом укљученом у морфогенезу гранања УБ, као и у одржавању и диференцијацији нефрогеног мезенхима у ембрионалномбубрега[17]. Цалр нокаут узрокује смртност ембриона због дисфункционалног развоја срца [15]. Повећање концентрације Ца2 плус у цитоплазми потребно је у нормалним кардиомиоцитима да би се покренула срчана миофибрилогенеза. Ова неопходна промена у концентрацији Ца2 плус зависи од Цалр-а и одсутна је у условима недостатка Цалр-а [18]. Функционална улога ЕР шаперона и калцијум-везујућег протеина Цалр у нефрогенези још није истражена. Да би се истражила потенцијална улога Цалра у ембрионалномбубрегаразвоја и утицаја Цалр дефицита на нефрогенезу, извршили смо компаративну транскриптомску и протеомску анализу. Све у свему, недостатак Цалр-а је довео до ретардације развоја бубрега и безначајних промена транскриптома и протеома. Штавише, наши подаци су открили да је недостатак Цалр-а изазвао озбиљне поремећаје у путевима нефрогенезе пошто су идентификоване значајне промене експресије кључних протеина који сигнализирају Внт (нпр. Внт7а, Внт11, Внт10б, Фзд10, Фзд9, Пркцб, Пркцк и Кремен2). Индуктивна сигнализација између епитела пупољка уретера и метанефричног мезенхима је углавном регулисана Внт повратном сигнализацијом [19,20]. Док је Цалр главни део ћелијске хомеостазе калцијума, он је истовремено суштински ЕР пратилац за савијање и промет гликопротеина и протеина укључених у ћелијску сигнализацију и експресију гена [21]. Нокаут Цалр-а може довести до поремећаја савијања протеина и ЕР стреса, што узрокује поремећај у транслационој машинерији. Ово може објаснити уочено заостајање у развоју бубрега код хомозиготних мишева.

Један од изненађујућих и занимљивих аспеката истакнутих у нашим подацима је промена у експресији рибосомских протеина. Показали смо скоро потпуно исцрпљивање неколико протеина 40С и 60С рибосомских подјединица. Штавише, наши ин витро експерименти су потврдили корелацију између смањења Цалр-а и оштећења експресије рибозомског протеина. Биогенеза рибосома је добро организована и подвргнута строгој регулацији. Нове студије су показале да рибозом игра важну улогу не само у физиологији нормалне ћелије, већ иу реакцији на стимулусе и у патогенези болести. Штавише, биогенеза рибозома контролише ћелијски раст, а пролиферација и промене у рибозомима се огледају у аберацији ћелијске пролиферације, заустављању ћелијског циклуса, апоптози и патолошкој манифестацији [22,23].

Поред њихове улоге у биогенези рибозома, откривено је да рибозомски протеини врше различите екстра рибозомске функције, на пример, у расту и пролиферацији ћелија, у поправци ДНК, иу ћелијској диференцијацији и развоју [24–31]. Оштећење функција рибосомских протеина је повезано са хематолошким и метаболичким поремећајем и може довести до кардиоваскуларних болести и рака [32–36]. Мутације у генима који кодирају рибозомске протеине су повезане са абнормалношћу еритропоезе која доводи до клиничких синдрома, нпр. Диамонд-Блацкфан анемије (ДБА) [37] и 5к-синдрома [38]. Мутације у РПС10 су повезане са Диамонд-Блацкфан анемијом и 30 процената ових пацијената има потковицу или сигмоидбубрези[39]. Занимљиво је да пацијенти Диамонд–Блацкфан имају веће шансе за развој мијелодиспластичног синдрома, који је повезан са мутацијом Цалр гена егзон 9 [40–42]. Ово преобликовање транслационе машинерије изазива огромне аберације у развојном процесу и утиче не само на урогенитални већ и на циркулаторни и репродуктивни систем, на крају изазивајући смртност ембриона након недостатка калретикулина. Наши подаци су открили узнемирујућу биогенезу рибозома у Цалр/ембрионубубрегаи истакао значајну улогу Цалра у биогенези протеина. Верујемо да би боље разумевање односа између Цалр дефицита и промене експресије рибосомских протеина пружило нове увиде за разумевање како Цалр утиче на биогенезу рибозома и ембрионалнибубрегаразвој и омогућавају нове погледе на процесе који управљају развојем органа.

4. Материјали и методе

4.1. Животиње

Калретикулин хетерозиготни (Цалр плус //) и дивљи тип (Цалр плус / плус) мишеви легла у идентичним Ц57БЛ/6Ј генетским подлогама добијени су од професора Марека Мицхалака, Универзитета Алберта, Едмонтон, Алберта, Канада. Мишеви су узгајани под специфичним условима смештаја без патогена и генотипизовани као што је претходно описано у Мицхалак ет ал. [15]. За нашу студију, трудни мишеви Цалр плус // жртвовани су у различитим фазама ембрионалног развоја (ембрионални дани 13.5: Е13.5; 14,5: Е14.5; и 16.5: Е16.5), ембриони су сакупљени, абубрезибили сецирани. За генотипизацију коришћен је комад репа ембриона. Тхебубрезису даље припремљени за хистохемијско бојење или транскриптомску или протеомичку анализу. Све експерименталне процедуре су спроведене у складу са немачким законима о бризи о животињама и етичком закону (НИХ стандарди) и одобрени су од стране локалног етичког комитета Универзитетског медицинског центра Гетинген, Немачка (33.14-42502-04-11/0598).

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛ БУБРЕГА/БУБРЕГА

4.2. Хистохемијско бојење

За хистолошко бојење ембрионабубрези, изрезанибубрезификсирани су преко ноћи у 4 процентном пуферском раствору формалдехида и затим уклопљени у парафинске блокове. Секције уграђене у парафин су депарафинизоване и рехидриране и обојене раствором хематоксилина Гилл ИИИ и раствором еозина И (Мерцк, Дармстадт, Немачка) према протоколу произвођача.

4.3. Ек-Виво култура органа ембрионалног бубрега

Култура органа ек виво је спроведена према Давиес ет.ал [43]. Трудни мишеви су жртвовани у фази Е13.5 ембрионалног развоја, ембриони су сакупљени ибубрезибили сецирани. Након генотипизације, 6бубрегаРудименти из сваког генотипа (Цалр плус / плус, Цалр плус // и Цалр/) су постављени на провидну ПЕТ мембрану са 0.4 µМ величином пора (24 бунара, БД Фалцон). Мембрана је стављена у један бунар плоче са 24 бунара, који садржи 400 µЛбубрегамедијум за културу (КЦМ, ДМЕМ, 10 процената инактивирани ФЦС). Ово је омогућилобубрегада контактира медијум без да га удави. Под овим условима било је могуће задржатибубрегакултивисан на 37 ◦Ц и 5 процената ЦО2 најмање 144 х.

4.4. Имунофлуоресцентно бојење култивисаних бубрега и имунохистолошка анализа пресека бубрега

Ембрионалнибубрезикултивисани ек виво током 72 х, након тога,бубрегарудименти су фиксирани у хладном метанолу на т 20 ◦Ц током 30 мин. Након корака фиксације следе 3 корака испирања, од којих је сваки трајао 5 минута у ПБС-у. Примарно антитело зечје моноклонско анти-ламинин антитело (Сигма-Алдрицх, Ст Лоуис, МО, САД) је разблажено у ПБС-у и инкубирано на 4 ◦Ц преко ноћи. КултурнибубрегаРудименти су испирани у ПБС-у 4 х и секундарно антитело (Молецулар Пробес Алека Флуор 555 козји анти-зечји ИгГ (1:500)) је додато преко ноћи на 4 °Ц. УБ је обојен лектином Долицхос бифлфлорус аглутинином (ДБА) најмање 3 х. Након инкубације,бубрезису испрани у ПБС-у 3 х и уграђени за микроскопску анализу. Имунобојење депарафинизованог и рехидрираног ембрионабубрегасекције су изведене да би се открила експресија и дистрибуција неколико протеина. Секције су третиране раствором за извлачење антигена (1,8 µМ лимунске киселине и 8,2 µМ натријум цитрата) претходно загрејаним у парној посуди за храну током 25 минута. Секције су блокиране са 10 процената козјег серума у ​​ПБС-у током 1 х и инкубиране преко ноћи на 4 ◦Ц са примарним антителима (коришћена су следећа примарна антитела: зечја моноклонска анти-Цалбиндин-1, анти-Вт1, анти- Сик2, анти-Пак2, анти-Цалр (Абцам, Цамбридге, УК), зечја моноклонска анти-Рпс6, антиРпс10 (Инвитроген) и зечја моноклонска анти-Сод1 антитела (Абнова, Тајпеј, Тајван). Примарна антитела су откривена флуоресценцијом обележена секундарна антитела (Молецулар Пробес Алека Флуор 555 козје анти-мишје ИгГ антитело и Алека Флуор 555 козји анти-зечји ИгГ) током 1 х на собној температури. За негативне контроле, делови ткива су инкубирани само са секундарним антителом. Стакалца су постављена са покровним стакалцима у медијуму за монтажу Вецтасхиелд са ДАПИ за противбојност језгара (Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, Калифорнија, САД).

4.5. Ћелијска култура

Мадин-Дарби пасбубрега(МДЦК) ћелије су добијене из Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ) и размножене у Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (ДМЕМ), 10 процената феталног говеђег серума (ФБС), 1 проценат пеницилина/стрептомицина и 1 проценат Л-глутамина на 37 ◦Ц у атмосфери од 5% ЦО2-. Ћелије су култивисане у Т25 боцама и подељене су два пута недељно. За пролаз ћелија, МДЦК ћелије су трипсинизоване на кратак временски период да би се избегла промена структуре ћелије.

4.6. Генерација нокаут ћелија

СгРНА секвенце Цалр-а (КСМ8622117) за врсте цанис лупус дизајниране су коришћењем онлајн алата БлуеХеронБио (Оригене, Херфорд, Немачка). СгРНА секвенца 50 ГТАГАТГГЦГГГТТЦГГЦАГ 30 је уметнута у плазмид пЛенти-Цас-Гуиде (Аддгене плазмиди #3931646) са БамХИ и БсмБИ рестрикцијским ензимима да би се генерисала пЛенти-Цас{{7}.Калрова секвенца је касније потврђена помоћу Сангерове секвенце. Да би се нокаутирао Царл у МДЦК ћелијама, извршена је пЛенти-Цас9-Цалр пролазна трансфекција. Један дан пре трансфекције, 200,000 ћелија/мЛ је засејано у плоче са 6 бунара са МЕМ медијумом. Пре трансфекције, медијум културе је промењен у Опти-МЕМ медијум без ФЦС. Липофецтамине 2000 (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА) је коришћен за трансфекцију ћелија. Мешавина ДНК плазмида липофектамина је припремљена са ОптиМЕМ на основу протокола инструктора. За трансфекцију плоче са 6 јажица, 4 µг плазмидне ДНК је одвојено додато у 250 µЛ Опти-МЕМ медијума и инкубирано 10 минута на собној температури. Након тога, смеша ДНК је додата у смешу Липофецтамине 2000 и инкубирана 30 минута пре него што је додата ћелијама. Успех трансфекције је процењен коришћењем Вестерн блота.

4.7. Транскриптомска анализа

За испитивање транскриптома коришћена су 3 трудна Цалр плус // миша. Ембриони (8–10/трудни мишеви) су сакупљени ибубрезибили изоловани. Након генотипизације,бубрезииз истог генотипа и исте мајке су спојени и обрађени за екстракцију РНК. Укупне РНК су изоловане из Цалр плус / плус , Цалр плус // и Цалр / ембрионалнибубрезиприменом методе Тризол (Инвитроген) према препорукама произвођача. Узорци су затим третирани ДНК-азом И (Сигма) да би се уклонила контаминација ДНК. Квалитет РНК је утврђен коришћењем микрофлуидне електрофорезе Агилент 21{{10}}0 Биоанализер (Агилент Тецхнологиес, ​​Санта Цлара, ЦА, УСА). За секвенцирање, узорци РНК су припремљени коришћењем "ТруСек РНА Сампле Преп Кит" у складу са протоколом произвођача (Иллумина, Сан Диего, ЦА, УСА). Секвенцирање појединачног читања (50 бп) је спроведено коришћењем ХиСек 2000 (Иллумина, Сан Диего, Калифорнија, САД). Секвенце су усклађене са референтном секвенцом генома Мус Мусцуллуса (Енсембл геноме Ассембли 3.2.1; хттпс://ввв.енсембл.орг/инфо/геноме/генебуилд/ассембли. хтмл, приступљено 24. марта 2021.) коришћењем СТАР поравнања софтвер (Цолд Спринг Лабаро тори, Цолд Спринг Харбор, САД) (верзија 2.3.0е, хттпс://гитхуб.цом/алекдобин/СТАР, приступљено 24. марта 2021.) [44] који дозвољава 2 неподударања унутар 50 основа. За филтрирање јединствених погодака и бројање коришћени су САМтоолс пакет (верзија 0.1.18) и ХТСек (верзија 0.6.1п1) [45,46]. Гени кандидати су филтрирани до минималне промене 2- пута и ФДР-кориговане п-вредности < 0,05.="" анотација="" гена="" је="" обављена="" коришћењем="" мус="" мусцуллус="" из="" енсембл="" в78="" (ввв.енсембл.орг,="" приступљено="" 1.="" марта="" 2019)="" преко="" биомарт="" пакета="" (верзија="" 2.24.0)="" [47].="" анализа="" обогаћивања="" го="" за="" гене="" кандидате="" спроведена="" је="" са="" госек="" пакетом="" (верзија="" 1.2)="" [48]="" користећи="" стандардне="">

4.8. Лиза бубрега, екстракција протеина и дводимензионална гел електрофореза (2-ДЕ)

За 2Д гел електрофорезу коришћени су ембриони од 6 трудних Цалр плус // женки (8–10 ембриона/женке). За екстракцију протеина за 2Д гел електрофорезу (2-ДЕ),бубрезииз ембриона у истом ембрионалном стадијуму и из истог генотипа и женке (8-10 ембриона/трудна женка) су обједињене, поремећене пуфером за лизу (9,5 М уреа, 2 процента ЦХАПС (в/в), 2 процента амфолита (в/в) /в), 1 проценат ДТТ) и вртложни. Након додавања пуфера за лизу, узорци су инкубирани на 4 ◦Ц током 30 мин. Да би се уклонили остаци ћелија, центрифугирање је спроведено на 13, 000 × г и 4 ◦Ц током 30 мин. Супернатант је центрифугиран додатних 30 минута на 13,000× г и 4 ◦Ц да би се добила максимална чистоћа. Супернатанти су сакупљени и пелете су одбачене, а добијени узорци су коришћени одмах или чувани на –80 ◦Ц до употребе. Да би се смањила контаминација соли и обогатили протеини, извршена је преципитација метанол-хлороформом према Вессел-у и Флугге-у [49]. Пелет је осушен и растворен у пуферу за лизу. Укупна концентрација протеина је одређена коришћењем Био-Рад протеинског теста (Био-Рад, Херцулес, ЦА, УСА) према Брадфорду. БСА (Сигма, Стеинхеим, Немачка) је коришћен као стандард. Да бисмо гарантовали експерименталну поновљивост, направили смо три гелове од свакогбубрегабазен. 2Д раздвајање протеина је спроведено као што је претходно описано [50]. 2-ДЕ гелови су обојени фламинго флуоресцентном гел бојом (Био-Рад, Херцулес, Калифорнија, САД) према упутствима произвођача. Након бојења, гелови су скенирани при резолуцији од 50 µм на Фуји ФЛА-5100 скенеру. Дигитализоване слике су анализиране коришћењем Делта 2Д 3.4 (Децодон, Браунсцхвеиг, Немачка). За визуелизацију протеина, 2-ДЕ гелови су додатно обојени преко ноћи колоидним Цоомассие плавим, Роти-Блуе (Ротх, Карлсрухе, Немачка).

4.9. Масена спектрометријска анализа и идентификација протеина

Значајно регулисане тачке су изрезане из гелова и триптично варење у гелу и екстракција пептида су изведени као што су претходно описали Дихази ет ал. [51]. Укратко, гел тачке су испране два пута у 25 мМ амонијум бикарбоната (амБиц) и једном у води, скупљене са 100 процената ацетонитрила (АЦН) током 15 минута и сушене у СпеедВац (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД) 20–30 мин. Све изрезане тачке су инкубиране са 12,5 нг/µЛ секвенционираног трипсина (Роцхе Молецулар Биоцхемицалс, Базел, ЦХ) у 25 мМ амБиц преко ноћи на 37 ◦Ц. Екстракција пептида је изведена два пута, прво користећи 50 процената АЦН/1 проценат трифлуоросирћетне киселине (ТФА), а затим 100 процената АЦН. Сви екстракти су спојени и запремина је смањена коришћењем СпеедВац-а. Триптични пептиди су подвргнути секвенцирању масене спектрометрије коришћењем К-ТОФ Ултима Глобал масеног спектрометра (Мицромасс, Манцхестер, УК) опремљеног нанофлфлов ЕСИ З-спрејом. Идентификација протеина је извршена помоћу Масцот претраживача у односу на МСДБ и Свисспрот базе података коришћењем толеранције масе пептида и толеранције фрагмента од 0,5 Да.

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БУБРЕЗУ/БУБРЕЗУ

4.10. Екстракција протеина, СДС-ПАГЕ, у гел триптичкој дигестији и масеним спектрометријским анализама

За масену спектрометрију квантификацију промене протеина у Цалр/бубрега, узорци истог генотипа и исте мајке су обједињени. Да бисмо генерисали довољно базена и обезбедили биолошко и експериментално репликације, користили смо 6 различитих трудних Цал плус // са 8–10 ембриона/мишева. Ембрионалнибубрезиод три генотипа су сакупљени из ембриона и екстракција протеина је изведена коришћењем пуфера за лизу као што је горе описано. Екстракти протеина су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ, гелови су обојени Цоомассие Блуе, свака трака је изрезана и исечена на 20 кришке једнаке величине, а кришке су подвргнуте дигестији у гелу са трипсином. За масену спектрометријску анализу, узорци су обогаћени на самопакованој предколони обрнуте фазе-Ц18 (0.15 мм ИД × 20 мм, Репросил-Пур120 Ц{{11} }АК 5 µм, Др. Маисцх, Аммербуцх-Ентринген, Немачка) и раздвојени на аналитичкој колони обрнуте фазе-Ц18 (0.075 мм ИД × 200 мм, Репросил-Пур 120 Ц{ {21}}АК, 3 µм, Др. Маисцх) користећи 30-минутни линеарни градијент од 5–35 процената ацетонитрила/0,1 процената мравље киселине (в:в) на 300 нл мин-1). Елуент је анализиран на К Екацтиве хибридном квадрупол/орбитрап масеном спектрометру (ТхермоФисхер Сциентифиц, Дреиеицх, Немачка) који је био опремљен са ФлекИон наноСпраи извором и који је радио под софтвером Екцалибур 2.4 коришћењем методе аквизиције зависне од података. Сваки експериментални циклус је био следећег облика: једно потпуно МС скенирање у опсегу од 350–1600 м/з добијено је при поставци резолуције од 70,000 ФВХМ и АГЦ циља од 106 и максималном времену попуњавања од 60 мс . До 12 најзаступљенијих пептидних прекурсора стања наелектрисања од 2 до 5 изнад прага интензитета од 2 × 104 је затим секвенцијално изоловано на изолационој ширини од 2,0 ФВХМ, фрагментовано азотом при нормализованој поставци енергије судара од 25 процената и резултирајући спектар јона производа је снимљен при поставци резолуције од 17.500 ФВХМ и постојао је АГЦ циљ од 2 × 105 и максимално време пуњења од 60 мс. Одабране вредности м/з прекурсора су затим искључене наредних 15 с. Добијене су две техничке реплике по узорку. Листе врхова су извучене из сирових података коришћењем софтвера Рав2МСМС в1.17 (Мак Планцк Институте фор Биоцхемистри, Мартинсриед, Немачка). Идентификација протеина је извршена коришћењем софтвера МАСЦОТ 2.5.1 (Матриксциенце, Лондон, УК). Протеини су идентификовани у односу на УниПротКБ референтни протеом миша в2017.09 (16930 уноса протеина) заједно са сетом од 51 загађивача који се обично идентификује у нашој лабораторији. Претрага је обављена са трипсином као ензимом и јодоацетамидом као блокатором цистеина. Дозвољена су до два пропуштена триптичка цепања и оксидација метионина као променљива модификација. Толеранције претраге су постављене на 10 ппм за масу прекурсора и 0,05 Да за масе фрагмената, а ЕСИ-КУАД-ТОФ је одређен као тип инструмента. Верзија софтвера Сцаффолд 4.8.9 (Протеоме Софтваре Инц., Портланд, ОР, САД) је коришћена за валидацију идентификације пептида и протеина заснованих на МС/МС. Идентификације пептида су прихваћене ако се могу утврдити са вероватноћом већом од 95,0 процената помоћу алгоритма Перцолатор. Идентификације протеина су скраћене на стопу лажног открића од 1 проценат на најмање 2 поуздано идентификована пептида. Протеински погоци који су садржали сличне пептиде и, даље, нису могли бити диференцирани само на основу МС/МС анализе, груписани су да би се задовољили принципи штедљивости. Протеини који деле значајне доказе о пептидима груписани су у кластере. Обиље протеина је процењено њиховим спектралним бројем након нормализације укупних сума између свих реплика.

4.11. Вестерн блот анализа

Вестерн блот анализе су изведене према Товбин ет ал. [52]. Једнаке количине протеина (50-75 µг) су раздвојене електрофорезом у полиакриламидном гелу (СДС-ПАГЕ) и пренете на нитроцелулозне мембране (Амерсхам Пхармациа Биотецх, Буцкингхамсхире, УК). Мембране су блокиране у 5% немасног сувог млека у ТБСТ пуферу (20 мМ Трис-ХЦл, пХ 7.4 150 мМ НаЦл 0,1 проценат Твеен 20) и инкубиране са примарним антителима (анти-Цалр, анти -Рпс10, анти-Рпс19, анти-Рпс26 и анти-еИФ5А) преко ноћи на 4 ◦Ц. У циљу визуелизације протеинских трака, коришћена су флуоресцентно обележена секундарна антитела. Да би се потврдило једнако оптерећење протеином, мрље су третиране анти-Ацтб или анти-ГАПДХ антителима (Сигма, Тауфкирцхен, Немачка).

4.12. Биоинформатика

Класификација идентификованих протеина према њиховим углавном познатим и постулираним функцијама извршена је коришћењем ДАВИД биоинформатике (хттп://давид.абцц. нцифцрф.гов, приступљено 21. фебруара 2019) [53,54]. Симболи гена су коришћени за истраживање и категоризацију напомена о онтологији гена (ГО) (биолошки процеси и молекуларне функције). Мрежна анализа познатих и предвиђених интеракција протеин-протеин идентификованих протеина је обављена коришћењем СТРИНГ (алатка за претрагу за проналажење интерагујућих гена/протеина) [55].

4.13. Статистичка анализа

За {{0}}ДЕ, дигитализоване слике су анализиране и упаривање тачака између гелова и нормализација је извршена коришћењем Делта2Д 3.4 (Децодон, Брауншвајг, Немачка). Делта2Д израчунава вредност "квалитета спота" за свако детектовано место. Ова вредност показује колико блиско тачка представља „идеалан“ 3Д Гаусов облик звона. На основу просечног односа запремине тачака, тачке чија је релативна експресија промењена најмање 2- пута (повећање или смањење) у три примерка између упоређених узорака се сматрала значајним. Да би се анализирала значајност регулације протеина, урађен је Студентов т-тест и претпостављена је статистичка значајност за П вредности мање од 0.05. Сви мрљи су квантификовани помоћу софтвера ИмагеЈ. Подаци су сакупљени софтверским пакетом ГрапхПад Присм, верзија 8 (Сан Дијего, Калифорнија, САД). Софтвер је коришћен за графичко представљање и анализу било Студентовом т-дистрибуцијом или једносмерном АНОВА. Резултати су представљени као средња вредност ± сд из најмање три независна експеримента. Разлике су сматране статистички значајним када је п < 0,05.="" врхови="" уретеричких="" пупољака="" и="" нефрони="" су="" пребројани="" ручно,="" а="" подаци="" су="" сакупљени="" помоћу="" софтверског="" пакета="" грапхпад="" присм,="" верзија="">