Карбоксипептидаза Е условни нокаут мишеви показују недостатке учења и памћења и неуродегенерацију, 2. део

Ниссл и имунофлуоресцентно бојење

Животиње су перфузиране са 4% параформалдехида и добијени су смрзнути делови можданог ткива. Ткива мозга су подељена на пресеке од 30 µм за Ниссл, доублецортин (ДЦКС), ЦПЕ и МАП2 бојење.

Последњих година, уз континуирани развој медицинске технологије, све више људи је почело да обраћа пажњу на то како да побољшају своје памћење да би се носили са све сложенијим и брзим темпом живота. Истовремено, доублецортин је постепено постао једна од врућих тема разговора.

Дакле, шта је доублецортин? Доублецортин је супстанца у мозгу која игра важну улогу у промовисању и одржавању функције памћења. Углавном се дистрибуира у синапсама између неурона у мозгу. Може регулисати ексцитабилност неурона и промовисати пренос информација између неурона, чиме се побољшавају људске когнитивне способности и памћење.

Неке студије су показале блиску везу између нивоа двоструког кортина и памћења. На пример, неки старији одрасли имају значајно ниже нивое двоструког кортина, а у исто време, памћење опада. Не само то, неке неуролошке болести, као што су Алцхајмерова болест и Паркинсонова болест, такође су повезане са смањеним нивоима двоструког кортина.

Међутим, немојте занемарити да доублецортин није панацеја. Може само донекле помоћи људима да побољшају своје памћење, али не може да реши све проблеме са памћењем. Поред тога, иако су неки експерименти показали да суплементација двоструким кортином може побољшати когнитивне способности и способности учења, ови експерименти не могу у потпуности доказати да двоструки кортин може побољшати људску интелигенцију.

Због тога, ако желите да побољшате своје памћење, није довољно само суплементирати двоструки кортин. Многи други фактори могу помоћи у побољшању памћења. На пример, више вежбања, одржавање доброг става, редован рад и одмор итд. може помоћи људима да побољшају своје памћење.

Укратко, заиста постоји одређена веза између двоструког кортина и памћења, али не треба полагати превелика очекивања на двоструки кортин. То не значи да не треба обратити пажњу на даблкортин. Напротив, морамо дубље да разумемо његову улогу да бисмо боље одржали и побољшали своје физичко здравље. Хајде да радимо заједно на побољшању нашег памћења! Види се да треба побољшати своје памћење. Цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење, јер Цистанцхе десертицола такође може да регулише равнотежу неуротрансмитера, као што је повећање нивоа ацетилхолина и фактора раста. Ове супстанце су веома важне за памћење и учење. Поред тога, месо такође може побољшати проток крви и подстаћи испоруку кисеоника, што може осигурати да мозак добије довољно хранљивих материја и енергије, чиме се побољшава виталност и издржљивост мозга.

Кликните на суплементе да бисте побољшали памћење

Зечје антиДЦКС антитело (1:1000; Целл Сигналинг Тецхнологи, Бостон, САД, 4604С), мишје анти-ЦПЕ антитело (1:1000; БД биосциенце, Нев Јерсеи, САД, 610758), зечје анти-ГФАП антитело (1:200; Технологија ћелијске сигнализације,80788) и зечја анти-МАП2 антитела (1:1000; Целл Сигналинг Тецхнологи,8707) су коришћени за имунофлуоресценцију.

Секундарна антитела су била секундарно антитело козјег анти-мишја Алека Флуор 594 ​​(1:1000; Инвитроген, Карлсбад, Калифорнија, 11005) или Алека Флуор 594 ​​козје анти-зечје секундарно антитело (1:1000; Инвитроген, 11012). Релативни интензитет флуоресценције МАП2 и ГФАП у хипокампалном суб и дмПФЦ при ×100 увећању израчунат је коришћењем софтвера ИмагеЈ (Натионал Институтесоф Хеалтх, УСА).

Вестерн блоттинг

Хипокампална и ПФЦ ткива су припремљена као што је претходно описано [22]. Траке су анализиране коришћењем софтвера ИмагеЈ. Узорци протеина су пуштени на 10% СДС-полиакриламид гел гел за електрофорезу и пренети на мембране од нитроцелулозе (0,22 μм; Миллипоре, Биллерица, МА, САД).

Након блокаде са 5% немасног млека, мембрана је умазана антителима против мишјег анти- - антитела (1:1000, ЦСТ, 4967С), мишјих анти-ЦПЕ антитела (1:1000; БД биосциенце, 610758), мишјих анти- БДНФ антитело (1:600, Абцам, УК, аб108319), зечје анти-п-ТркБ антитело (1:1000; Бостер, Вухан, Кина, БМ4437), зечје анти-АКТ (1:2000, технологија ћелијске сигнализације, 4691С) , и анти-п-АКТ (1:2000, Целл Сигналинг Тецхнологи, 23430С) преко ноћи на 4 степена.

После испирања, мембране су инкубиране са анти-мишјим или анти-зечјим ИгГ антителима 1 х на собној температури. Ниво експресије протеина за сваки узорак је нормализован на -актин.

Статистичка анализа

Подаци су анализирани једносмерном анализом варијансе (АНОВА) за више група. Анализа је обављена коришћењем ГрапхПад Присм 8.0 (ПрисмГрапхПад софтвер). Све вредности су означене средњим вредностима ± стандардне грешке (СЕМ). П < 0.05 се сматрало значајним.

РЕЗУЛТАТИ

Анализа телесне тежине и глукозе у плазми

За анализу телесне тежине и глукозе у плазми коришћени су мишеви старости 1–20 недеља (слика 1а). Резултати су показали да постоје значајне разлике у телесној тежини између мишева ВТ, ЦПЕфлок/− и ЦПЕфлок/флок. Нивои глукозе у плазми наташте и метаболизам су процењени у доби од 10 недеља (слика 1б). Пронашли смо разлике између ногунотипова међу животињама ВТ, ЦПЕфлок/− и ЦПЕфлок/флок.

Учење и губитак памћења код ЦПЕфлок/флок мишева

Из теста на отвореном, приметили смо да нема разлике између сваке групе генотипова за пређену удаљеност у апарату на отвореном (слика 2а). Ово указује да аутономно и испитивачко понашање ЦПЕфлок/флок мишева није утицало на то. За учење и памћење код мишева, користили смо тест препознавања објеката (слика 2б). Приметили смо да ЦПЕфлок/флок мишеви проводе значајно мање времена на новим објектима него ВТ мишеви. И-лавиринт и ФЦТ-краткорочни су спроведени да би се проценила краткорочна меморија код мишева (Слика 2ц–е).

У тесту И-лавиринт, ВТ и ЦПЕфлок/− мишеви су провели више времена у новеларму него ЦПЕфлок/флок мишеви. За краткорочни ФЦТ, задржавање краткорочне меморије код ЦПЕфлок/флок мишева било је горе него код ВТ и ЦПЕфлок/− мишева. За дуготрајно задржавање памћења (слика 2ф), тест условљавања страхом је показао да ВТ и ЦПЕфлок/− мишеви имају значајно бољу меморију за шок стопала од ЦПЕфлок/флок мишева.

ЦПЕфлок/флок мишеви показују дегенерацију субикулума (Суб).

Користили смо Вестерн блоттинг да бисмо окарактерисали експресију нивоа ЦПЕ у хипокампусу у поређењу са интерним контролним протеином -актином (слика 3а, б). Резултати су показали да се ЦПЕ протеин у хипокампусу ЦПЕфлок/флок мишева значајно смањио. После парадигме стреса, подрегија ЦПЕфлок/флок мишева је потпуно дегенерисана, али не пре ношења, док је хипокампална формација ВТ мишева била нетакнута (слика 3ц).

ЦПЕфлок/флок мишеви показују смањење интензитета ГФАП и МАП2 и ТркБ сигнализације у хипокампусу

Процењивали смо експресију Акт/мТОР-посредованих БДНФ/ТркБпатхваи протеина. Вестерн блот анализа БДНФ протеина је показала да је у поређењу са ВТ мишевима, садржај БДНФпротеина у хипокампусу ЦПЕфлок/флок мишева показао једнаке количине у поређењу са ВТ и ЦПЕфлок/− мишевима (Слика 4а, б). П-ТркБ протеин је значајно смањен код ЦПЕфлок/флок мишева у поређењу са ВТ и ЦПЕфлок/− мишевима (слика 4а, ц).

Резултати су показали да су ЦПЕфлок/флок мишеви показали смањење експресије фосфорилисаног Акт и фосфорилисаног мТОР у хипокампу у поређењу са ВТ мишевима (сл. 4а, д, е). Резултати имунофлуоресценције су показали смањену експресију ЦПЕ у хипокампалној подлози (слика 4ф, г). Користили смо имунобојење анти-МАП2 да бисмо показали интензитет МАП2 у хипокампалном суб и хилус региону (слика 4ф).

Резултати имунофлуоресценције су показали смањени интензитет МАП2 у Суб андхилусу ЦПЕфлок/флок мишева, али не и код ВТ и ЦПЕфлок/- мишева (Слика 4ф, х,и). Поред тога, ДЦКС имунобојење је показало да је неурогенеза у ДГ хипокампуса код ЦПЕфлок/− мишева била слична оној код ВТ мишева, али значајно смањена код ЦПЕфлок/флок мишева (Слика 4ф, ј). Интензитет ГФАП у хипокампалној подлози био је значајно нижи код ЦПЕфлок/флок мишева него код ВТ мишева (Слика 4ф, к).

ЦПЕфлок/флок мишеви показују смањење интензитета ГФАП и МАП2 у дмПФЦ

Користили смо Вестерн блоттинг да бисмо окарактерисали експресију нивоа ЦПЕ у дмПФЦ у поређењу са -актином (слика 5а, б). Резултати су показали да је ЦПЕ протеин у дмПФЦ код ЦПЕфлок/флок мишева значајно смањен. Након парадигме стреса, резултати имунофлуоресценције су показали смањен интензитет МАП2 код дмПФЦЦПЕфлок/флок мишева, али не и код ВТ мишева (Слика 5ц, д). Поред тога, ГФАПинтензитет у дмПФЦ је био значајно нижи код ЦПЕфлок/флок мишева него код ВТ мишева (Слика 5ц, е).

ДИСКУСИЈА

У овој студији смо генерисали ЦПЕ-цКО миша да бисмо проучавали фенотип губитка функције ЦПЕ у неуронима мозга. Претходна студија је показала да ЦПЕ-КО мишеви развијају гојазност и дијабетес и постају тежи у доби од 8 недеља од ВТ мишева [5]. Наша мерења су показала да није дошло до значајне промене телесне тежине, нивоа глукозе у плазми и толеранције глукозе код ЦПЕфлок/флок мишева у поређењу са ВТ мишевима.

Студије понашања су утврдиле да парадигма стреса за ЦПЕфлок/флок мишеве нарушава учење и памћење. Поред тога, стрес и смањена експресија ЦПЕ довели су до субдегенерације хипокампуса, смањене неурогенезе у ДГ и смањене густине неурона у суб-дегенерацији хипокампуса и дмПФЦ.

ЦПЕ је ензим за обраду прохормона који обрађује прохормон, који цепа базични остатак Ц-терминала од прекурсора енкефалина да би се добио енкефалин [23]. Као ануропротективни фактор, ЦПЕ игра важну улогу у ембрионалном и постнаталном развоју мозга [24].

Извештај о случају је показао да је хомозиготна бесмислена мутација у ЦПЕ гену повезана са клиничким фенотиповима који се састоје од гојазности, интелектуалне слабости и хипогонадизма [2]. ЦПЕфат/фат мишеви показују смањење нивоа ЦПЕ и повећање нивоа проинсулина, што подржава улогу ЦПЕ у дисрегулацији инсулина [25].Спонтане тачкасте мутације у ЦПЕ смањују активност ензима, што доводи до тешке гојазности [4]. ЦПЕ-КО мишеви развијају дијабетес, а ови мишеви имају висок ниво глукозе у доби од 8-10 недеља.

Висок ниво глукозе је одржаван отприлике 2 месеца, а затим је почео да опада, што указује на реверзибилни дијабетесфенотип [26]. Наша студија је показала да постоји значајна разлика између ЦПЕфлок/флок и ВТ мишева у нивоима плазмаглукозе и толеранцији глукозе у доби од 10 недеља. ЦПЕ-КОМице почињу да добијају на тежини са отприлике 4 недеље старости, а теже су од ВТ легла за 8 недеља [27]. Показало се да ЦПЕ-КО мишеви показују повећану потрошњу хране.

Повећана потрошња је резултат неправилних сигнала који контролишу понашање у исхрани, укључујући равнотежу орексигених и анорексичних неуропептида у хипоталамусу [5]. Правилна сазревање ових неуропептида захтева правилан транспорт и обраду ових неуропептида, у чему ЦПЕ игра важну улогу [28].

Снимали смо телесну тежину мишева од 1 до 20 недеља, а резултати су показали да избрисани неурони ЦПЕин не утичу на телесну тежину. У нашој студији, ЦПЕ-цКО није променио тежину или потрошњу глукозе. Може бити да условни нокаут ЦПЕ у неуронима не утиче на сигнале који контролишу понашање у исхрани. Стога је такав ЦПЕ-цКО миш вредан модел за проучавање фенотипа губитка функције ЦПЕин неурона мозга.

ЦПЕ игра различите улоге у централном нервном систему, укључујући одржавање нормалне когнитивне функције, правилну неуронску структуру и преживљавање неурона [3]. Сматра се да ЦПЕ игра улогу у ћелијској обради прекурсора протеина. Такође има неуропротективну активност, независно од активности ензима, делујући екстрацелуларно као неуротрофни фактор [25]. Демонстрирана је нова улога ЦПЕ у неуроразвоју и гранању проксималних дендрита, што је неопходно за миграцију и дендрогенезу кортикалних неурона [29]. ЦПЕ-КО мишеви под стресом без активности ЦПЕ показују многе абнормалности у понашању, укључујући дефиците у учењу и памћењу [30]. Претходне студије су процењивале процесе учења и памћења када су животиње имале отприлике 2 месеца када је тежина мишева тек почела да се разликује [31].

Утврђено је да стрес утиче на хипокампус на различитим нивоима анализе [32]. У погледу понашања, студије су откриле да стрес генерално нарушава различите задатке учења и памћења зависне од хипокампуса [20]. Неурално, студије на животињама су откриле да стрес мења последичну синаптичку пластичност и својства покретања хипокампалних неурона [33]. Структурно, студије су показале да промене морфологије неурона стреса потискују производњу нових неурона гранула у зупчастом гирусу и смањују запремину хипокампуса [34]. Извршили смо тестове препознавања објеката, И лавиринта и страха на ЦПЕфлок/флок мишевима у доби од 10 недеља. За препознавање објеката, ВТ мишеви су показали неочигледну предност према новом објекту.

Насупрот томе, ЦПЕфлок/флок мишеви нису успели да покажу преференцију за било који објекат током ових периода. И лавиринт је коришћен за процену краткорочног памћења мишева. ВТ мишеви су били радозналији од ЦПЕфлок/флок мишева да истражују подручја која раније нису посетили . Поред тога, тест стања страха је коришћен за процену краткорочног и дугорочног памћења препознавања.

ВТ мишеви су били ефикаснији у препознавању условљених стимулуса од ЦПЕфлок/флок мишева. Треба напоменути да су условни ЦПЕ КО мишеви недавно генерисани под Помц промотором, који нокаутира ћелије које експримирају проопиомеланокортин. Ови ЦПЕ-цКО мишеви су показали нормалну физиологију, понашање и нивое неуропептида[35]. Насупрот томе, наши условни ЦПЕ КО мишеви под Цамк2апромотором показали су оштећену меморију и неуродегенерацију, подржавајући хипотезу да је ЦПЕ неуропротективни протеин против стреса [36].

Студије на ЦПЕ-КО мишевима су откриле више нивоа абнормалности. У погледу понашања, ЦПЕ-КО мишеви показују понашање слично депресији и сметње у учењу. Електрофизиолошке анализе су показале да је дуготрајна потенцирање хипокампуса код ЦПЕ-КО мишева поремећена. Морфолошка анализа је показала да је хипокампус дегенерисао након стреса када је ЦПЕ био нокаутиран [31]. ЦПЕ се регулише под различитим врстама стреса и важан је у заштити неурона [3]. Ефекат недостатка ЦПЕпротеина на префронтални кортекс под стресом није пријављен.

Нема сумње да понашање учења и памћења захтева интеракцију између великих можданих мрежа. Меморија и присећање зависе од интеракције између префронталног кортекса и хипокампуса [37]. Стога, коло префронталног кортекса хипокампуса игра кључну улогу у когнитивној регулацији и консолидацији меморије [38]. Код ЦПЕ-КО мишева, делеција ЦПЕ протеина је изазвала повреду хипокампалних ЦА3 неурона [39].

Претходна студија је указала на то да стрес при одвикавању повећава секрецију глукокортикоида и индукује покретање неурона у ДГ гранулозаћелијама како би се повећало лучење глутамата, што доводи до ексцитотоксичности и смрти ЦА3 неурона код ЦПЕ-КО мишева [40]. Може бити да цКО оф ЦПЕ гена у неуронима има мањи ефекат на ендокрини систем.

Такође се показало да су након пролазне глобалихемије неурони у ЦА1 региону били рањивији и да су показали само пролазно повећање експресије ЦПЕ [41]. Генетичке промене хипокампалних подрегиона су показале различите функције у учењу и памћењу [42]. Класично „трисинаптичко“ коло (ДГ > ЦА3 > ЦА1 > Суб) је тополошки уређена и делимично непоклапајућа дорзална-дорзална, средња, средња до-средња и вентрална-вентрална пројекција [43].

Главна организација формирања хипокампуса сисара је једносмерно коло, у коме се информације које се преносе са површинског слоја енторхиналног кортекса до ДГ обрађују сукцесивно у ЦА потпољу: ЦА3, ЦА2 и ЦА1. Дорзални ЦА1 своју главну пројекцију шаље директно у унутрашњи слој енторхиналног кортекса 5 или индиректно кроз дорзални суб (заобилазни круг) [42].

Једна од интересантних разлика између директних и индиректних излазних путева хипокампуса је да у последњем, дорзални потпројекти на слој 5 енторхиналкортекса и многе кортикалне и субкортикалне регионе мозга[44]. Неке клиничке студије су показале да се ДГ и ЦА потпоља селективно активирају током формирања епизодне меморије, док је Суб активан током сећања епизоде ​​[45].

У овој студији, експресија ЦПЕ протеина у хипокампусу и дмПФЦ код ЦПЕфлок/флок мишева се значајно смањила. Стога, повреда неурона и апоптоза у подрегији доводе до недостатака памћења. Код ЦПЕфлок/флок мишева, неуролошки дефицити могу бити последица делимичних компензационих механизама, укључујући повреду хипокампалних суб и дмПФЦ неурона.

Астроцити посредују у развојним, физиолошким и патолошким процесима [46]. Они се сматрају кључним елементима који подржавају функцију неурона, који пружају структурну и метаболичку подршку неуронима [47]. Астроцити утичу на регрутовање и функцију неурона на локалном и мрежном нивоу [48]. Открили смо да се број астроцитних ћелија у хипокампалној подлози и дмПФЦ значајно смањио, вероватно зато што је ЦПЕ важан у диференцијацији неуралних матичних ћелија од астроцита [49].
БДНФ се сматра важним регулатором вишеструких стресора [50]. Он регулише синаптичку трансмисију и дуготрајну потенцирање у хипокампусу и учествује у формирању одређених облика памћења [51]. Недавно је указано да је ЦПЕ критични фактор раста и трофије који штити хипокампус од смрти пирамидалних неурона изазваних стресом и когнитивних оштећења [36]. У овој студији смо открили да је експресија БДНФ била једнака оној код ВТ мишева. Овај резултат указује да упркос експресији сличних нивоа БДНФ, ЦПЕфлок/флок мишеви показују потпуну неуродегенерацију са тешким стресом.

ЗАКЉУЧАК

Укратко, ова студија указује на то да ЦПЕфлок/флок мишеви показују оштећено учење и памћење под парадигмом стреса која укључује емоционални и физички стрес повезан са одбијањем.

Смањена експресија ЦПЕ и парадигма стреса довели су до субдегенерације хипокампуса, смањене неурогенезе у ДГ и смањене неуронске густине у суб-дегенерацији хипокампуса и дмПФЦ.

РЕФЕРЕНЦЕ

1. Цавлеи НКС, Ветсел ВЦ, Муртхи СР, Парк ЈЈ, Пацак К, Лох ИП. Нове улоге карбоксипептидазе Е у ендокриној и неуралној функцији и раку. Ендоцр Рев.2012;33:216–53.хттпс://дои.орг/10.1210/ер.2011-1039

2. Дурмаз А, Аикут А, Атик Т, Озен С, Аииıлдıз Емецен Д, Ата А, ет ал. Нови узрок синдрома гојазности повезан са мутацијом у гену карбоксипептидазе откривеном код троје браће и сестара са гојазношћу, интелектуалним инвалидитетом и хипогонадотропним хипогонадизмом. Ј Цлин Рес Педиатр Ендоцринол. 2021;13:52–60.хттпс://дои.орг/10.4274/јцрпе.галенос.2020.2020.0101

3. Ји Л, Ву ХТ, Кин КСИ, Лан Р. Дисекција карбоксипептидазе Е: својства, функције и патофизиолошке улоге у болести. Ендоцр Цоннецт. 2017;6:Р18–Р38.хттпс://дои.орг/10.1530/ец-17-0020

4. Наггерт ЈК, Фрицкер ЛД, Варламов О, Нисхина ПМ, Роуилле И, Стеинер ДФ, ет ал. Хиперпроинсулинемија код гојазних масних/масних мишева је повезана са емулацијом карбоксипептидазе која смањује активност ензима. Нат Генет. 1995;10:135–42.хттпс://дои.орг/10.1038/нг0695-135

5. Цавлеи НКС, Зхоу Ј, Хилл ЈМ, Абебе Д, Ромбоз С, Ианик Т, ет ал. Миш који је нокаутирао карбоксипептидазу Е показује ендокринолошке и бихевиоралне дефиците.Ендокринологија. 2004;145:5807–19.хттпс://дои.орг/10.1210/ен.{2}}

6. Босцх Е, Хебебранд М, Попп Б, Пенгер Т, Бехринг Б, Цок Х, ет ал. БДВ синдром: синдром у настајању са дубоком гојазношћу и неуроразвојним кашњењем који подсећа на Прадер-Вилли синдром. Ј Цлин Ендоцринол Метаб. 2021;106:3413–27.хттпс://дои.орг/10.1210/цлинем/дгаб592

7. Цхен Х, Јавахар С, Киан И, Дуонг К, Цхан Г, Паркер А, ет ал. Миссенсе полиморфизам у гену хумане карбоксипептидазе Е мења ензимску активност. ХумМутат. 2001;18:120–31.хттпс://дои.орг/10.1002/хуму.1161

8. Зху Кс, Ву К, Рифе Л, Цавлеи НКС, Бровн Б, Адамс Т, ет ал. Карбоксипептидаза Е је неопходна за нормалан синаптички пренос од фоторецептора до унутрашње ретине. Ј Неуроцхем. 2005;95:1351–62.хттпс://дои.орг/10.1111/ј.1471-4159.2005.03460.к

9. Гриего Е, Херрера-Лопез Г, Гомез-Лира Г, Баррионуево Г, Гутиеррез Р, Галван ЕЈ. Функционална експресија ТркБ рецептора на интернеуронима и пирамидалним ћелијама подручја ЦА3 хипокампуса пацова. Неуропхармацологи 2021;182:108379хттпс://дои.орг/10.1016/ј.неуропхарм.2020.108379

10. Ксиао Л, Схарма ВК, Тоулаби Л, Ианг Кс, Лее Ц, Абебе Д, ет ал. Неуротрофни фактор 1, нови тропин је критичан за превенцију смрти хипокампалне ЦА3 ћелије изазване стресом и когнитивне дисфункције код мишева: поређење са БДНФ. ТранслПсицхиатри. 2021;11:24хттпс://дои.орг/10.1038/с41398-020-01112-в

For more information:1950477648nn@gmail.com