Медијум културе мицелија Церипориа Лацерата као нови микробни материјал против старења за козметичку примену
Mar 27, 2023
Кључне речи:Цистанцхелацерата; против старења; анти-инфламацијаn; антиоксидација; анти-колагеназа; регулација филагрина;избељивање; зарастање рана
Кликните овде да бисте сазнали како Цистанцхе функционише за негу коже
1. Представљање
Између осталих органа, људска кожа је авангардни интерфејс који је стално изложен штетним спољашњим стимулансима, као што су опште метаболичке реакције, козметика и ултраљубичасто (УВ) зрачење. Ови фактори доводе до нежељених биохемијских нуспроизвода, укључујући реактивне врсте кисеоника (РОС), матрикс металопротеиназе (ММП) и напредне крајње производе гликације (АГЕ), који могу изазвати старење коже, укључујући боре, пигментацију и губитак тонуса коже [1,2]. РОС, опасни молекули кисеоника као плеиотропни физиолошки предајник сигнала, углавном индукују унакрсно повезивање колагена и еластина да би изазвали боре и нижи опоравак коже, за које се сматра да су главни покретач старења узрокованог УВ зрацима и загађењем [3]. ММП су ензими који се активирају излагањем УВ зрачењу или упалом, који доприносе разградњи колагена док инхибирају стварање новог колагена [1]. Формирање АГЕ је резултат реакције глукозе са протеинима, укључујући колаген коже, што може допринети губитку еластичности, бора, упалама, инхибицији раста ћелија коже и убрзаном старењу [2]. Пошто је оксидативни стрес један од метаболичких фактора и путева који су највише повезани са старењем ћелија, потрошња функционалне хране и функционалне козметике са антиоксидативним деловањем значајно расте. Стога, антиоксиданси могу бити корисни за људско тело директно или индиректно неутралишући РОС, преко регулисања метаболичких путева и експресије гена као главних механизама ћелијске активације. Природни метаболити добијени из микробних извора коришћени су у разним применама као извор исхране и као средство за негу коже [4]. Међу њима, метаболити добијени из гљива садрже биолошки активне састојке значајне комерцијалне вредности укључујући олигосахариде, егзополисахариде (ЕПС), ензиме, пептиде, витамине и биосурфактанте. Ови метаболити се широко користе као главне сировине за фармацеутске производе, функционалну храну и козметичке производе (5-9). Препуни хиљада антиоксиданата и антиинфламаторних својстава, широко се користе у борби против старења побољшавајући стање коже. природну одбрану, враћање еластичности коже, повећање садржаја влаге, подстицање синтезе колагена и испољавање ефеката избељивања коже (4,5) Осим тога, ова једињења која замењују традиционалне хемијске састојке, примењују се у разним козметичким производима који се користе за побољшање здравља и лепоте коже. човечанство на безбедан и детоксикациони начин. Посебно, јединствена биокомпатибилност, нетоксичност и функционалност гљивичног ЕПС-а су широко коришћени у козметичкој индустрији (4). На пример, метаболичка једињења као што је шизофилан, полисахарид п{ {7}},3 П-глукан са п-1,6 гранањем, екстрахован из Сцхизопхиллум цоммуне, познато је да помаже код антиинфламаторних ефеката коже и заштите од УВ зрачења (101. изолован је ферментни филтрат Галацтомицес (ГФФ) из Галацтомицесцандидум да проучава козмецеутске ефекте на смањење пора коже лица, пигментацију коже и ублажавање оксидативног стреса, док су механизми деловања који су у основи ЕПС ГФФ-а заједно са информацијама о његовим спојевима још увек неидентификовани (11). Цистанцхе лацерат је врста беле-путрефактивне филаментозне гљиве која игра важну улогу у биоремедијацији разградњом целулозе и лигнина (12,13). Биоактивна ефикасност мицелија Ц. лацерата (ЦЛМ култура је проучавана за контролу нивоа хипергликемије (14)) , секрецију инсулина кроз цитопротективне ефекте (15) и сигнализацију инсулина кроз активацију АМП-активиране протеин киназе (АМПК) и транспортера глукозе типа 4 (ГЛУТ4) (16,17. Међутим, фармаколошки ефекат ЦЛМ на антиоксидацију и антиоксидацију -старење још није познато.
КултурниЦ. лацератасастоји се од микроскопских полипора; тако, изгледа као бела маховина (Сл1а). Током процеса течне културе, различити секундарни метаболити, нпр. егзометаболити, настају у зависности од услова околине (Слика1б). Међутим, не постоје извештаји о Ц. лацерате или ЦЛМ о ефектима повезаним са негом коже. Стога је ова студија имала за циљ да истражи антиоксидативне ефекте, зарастање рана, побољшање бора, хидратацију и избељивање ефеката ЦЛМ-а на механизам против старења ћелија коже. Колико нам је познато, ова студија је први извештај који предлаже нови пут за негу коже на ћелијском нивоу заснован на механизму против старења користећи антидијабетичке састојке добијене из културе ЦЛМ, микроорганизма у настајању [14–17].
Слика 1. Зелени начин производњеЦистанцхе лацератаегзофармацеутске супстанце (ЦЛЕПС), укључујући чврсту културу
(а) и низводни процеси (б) као што су предкултура (и), главна култура (и) и филтрација (и).
2.2. Мерење антиоксидативне активности2.2.1. 2,2-дифенил-1-пикрил-хидразил-хидрат (ДППХ)
Тест активности чишћења Способност ЦЛЕПС-а за уклањање слободних радикала је тестирана фотометријским тестом уклањања радикала ДППХ према методологији коју су описали Цхои ет ал. (18] и Кедаре ет ал. (19. ЦЛЕПС је помешан са 90 мМ метанолног ДППХ да би се формирале коначне концентрације раствора од 0.5, 1 и 5 мг/мЛ у {{7} }плоче са бунарима, које су инкубиране 30 мин на 25 степени и очитана је апсорпција (ОД) у читачу микроплоча (Мултискан ГОТермофисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) на таласној дужини од 517 нм. Три независна експеримента Као позитивна контрола коришћена је аскорбинска киселина (АА, 1 мг/мЛ). Проценат инхибиције ДППХ је израчунат према следећој формули: проценат уклањања ДППХ=контрола А0 - узорак А1/контрола А0] к 100, где А1 означава апсорпцију узорка, док А0 означава апсорбанцију контроле (метанолни раствор ДППХ).
2.2.2. 2,2-азинобис-(3-етилбензотиазолин-сулфонска киселина) (АБТС)
Активност уклањања радикала Одређивање активности уклањања слободних радикала ЦЛЕПС раствора је постигнуто АБТС тестом деколоризације катјона радикала према методологији описаној бКедаре ет ал. (19). Генерисање АБТС катјонских радикала је постигнуто комбиновањем 10мг АБТС и 2 мг калијум персулфата у води. Раствор је стављен у таму на 25 степени око 12 х пре употребе. АБТС раствор (1 мЛ) је разблажен са 60 мЛ метанола, затим је ЦЛЕПС помешан са 90 уМ метанолног АБТС да би се формирале коначне концентрације раствора од 0,5, 1 и 5 мг/мл у 96-плочама. Плоче су инкубиране на25 ◦Ц током 30 минута и ОД је мерен на таласној дужини од 734 нм коришћењем МултисканГО инструмент. Изведена су три независна експеримента. аскорбинска киселина (АА,1 мг/мЛ) је коришћен као позитивна контрола. Проценат инхибитора АБТС је израчунат помоћупратећи формулу испод:Проценат уклањања АБТС-а {{0}} [контрола А0− узорак А1/контрола А0]× 100 где А1 означаваапсорбанцију узорка, док А0 означава апсорбанцију контроле (метанолни раствороф АБТС).
2.3. Тест виталности ћелија
монтиран са 10 посто феталног говеђег серума (ФБС) (ВелГЕНЕ, Гиеонгсан, Кореја) и 1 посто пенијацилин/стрептомицин (ВелГЕНЕ, Гјеонгсан, Кореја) на 37◦Ц у 5% ЦО2 инкубатор (УП50Х,Форма Сциентифиц, Мариетта, ОХ, САД). Ћелије су инкубиране на 7× 104ћелије / бунар у12-бунартањир. Након потврђивања адхезије ћелије, она је пребачена у уређај без серумамедијума и раствори су третирани на радној концентрацији у сваком бунарчићу 72 х. Раствор тиазолил плавог тетразолијум бромида (МТТ) (Сигма, Ст. Лоуис, МО, САД) наа концентрацијаод 100µг/мЛ је додат у сваки бунар и инкубиран на 37◦Ц, 5 процената ЦО2 за2 ч. Затим је сав медијум културе уклоњен и 500µЛ ДМСО (Дуцхефа Биоцхемицалс, Харлем, Холандија) је додат у сваки бунар. Апсорбанца на 570 нм је биламерено ЕЛИСА читачем (Епоцх, Био-тек ИНЦ, Винооски, ВТ, САД). Ћелијска културамедијум је коришћен као негативна контрола (контрола (-)).
2.4. Ниво експресије Филагрина
Да би се приказало како ЦЛЕПС утиче на функцију баријере коже, ниво експресије мРНА филагрина је мерен РТ-ПЦР. ХаЦаТ ћелија је култивисана на 2× 104 ћелије/бунарић у 24-плочи са бунарима користећи ДМЕМ медијум који садржи 10 процената ФБС, 1 проценат пеницилина и 1 проценат стрептомицина, а затим култивисан на 37◦Ц, 5 процената ЦО2 инкубатор 24 х. Након уклањања супернатанта, сваки узорак је додат у ДМЕМ медијум искључујући ФБС током 24 х на 37◦Ц, 5 процената ЦО2 инкубатор. Након инкубације, супернатант је уклоњен и РНК је сакупљена у складу са приручником коришћењем Еаси Блуе реагенса за лизу (иНтРОН Биотецхнологи, Сеонгнам, Кореја). РТ ПреМик (БИОНЕЕР, Даејеон, Кореја) је коришћен на 42◦Ц 60 мин и 95◦Ц током 5 минута да се синтетише цДНК. ПЦР прајмери (Мацроген, Даејеон, Кореа) су дизајнирани како је приказано у табели1 и Вестерн блоттинг је изведен да би се одредила количина експресије филагрина.
Лум Г (Аплеген, Плеасантон, Калифорнија, САД). Као стандардни унутрашњи протеин, -актин (Сигма,Сент Луис, МО, САД).
2.5. Тест инхибиције меланогенезе Б16 ћелија меланома
Да би се пронашле безбедне дозе за тест инхибиције меланина и посматрала активност инхибиције меланина третманом ЦЛЕПС узорка, Б16 ћелије меланома (АТЦЦ) на 1× 105 ћелије/бунарић су култивисани у 6-плочи за културу бунара која садржи ДМЕМ медијум са 10 процената ФБС и 1 проценат пеницилин-стрептомицина који је додат на 37◦Ц и 5 процената ЦО2 стање. Индуктор синтезе меланина, - хормон који стимулише меланоците ( -МСХ), припремљен је растварањем у 10 процената ДМСО у концентрацији од 50µМ. После инкубације од 24 х, додају се ЦЛЕПС раствори и одмах третирају са -МСХ (50 нМ), након чега следи додатна инкубација током 72 х. Затим су ћелијске плоче испране два пута са ПБС-ом и трипсинизоване, а затим су обновљене ћелије центрифугиране на 5000 рпм током 10 минута да би се уклонио супернатант, након чега је добијена ћелијска пелета. Садржај интрацелуларног меланина је одређен према методи која је претходно објављена уз мање модификације [20]: меланин је сакупљен растварањем у 2 Н НаОХ који садржи 10 процената ДМСО на 60◦Ц током 4 х, који је пребачен у 96-плочу са бунарима. ДМСО (0.1 проценатv/v) је био растварач за контролни и испитни узорци са -МСХ. Апсорбанца је мерена на 475 нм помоћу ЕЛИСА читача.
2.6. Анти-инфламаторни тест азот-оксида (НО)
медијум без ЛПС (нормална група) је коришћен као негативна контрола.
2.7. Анти-инфламаторни тест индуцибилне синтазе азот-оксида (иНОС), циклооксигеназе-2 (ЦОКС2) и фактора туморске некрозе (ТНФ )
2.8. Синтеза колагена и инхибиција колагеназе
НХДФ ћелије су култивисане и претходно третиране са ЦЛЕПС да би се испитала ефикасностЦЛЕПС на формирање колагена и инхибицију колагеназе узимањем проколагена типа ИЦ-пептид ЕИА комплет (Такара, Кусатсу, Јапан) и хумани про-ММП-1 квантикин ЕЛИСАкомплет (Р&Д систем, Минеаполис, МН, САД), респективно. Као метод за мерење нивоа активности колагеназе, ензима који разграђује колаген, антитела противкоришћена је колагеназа (ММП-1), док је форбол 12-миристат 13-ацетат (ПМА) (Сигма)користи се за активирање израза ММП-1. 10 нг/мЛ ТГФ- (Сигма) је растворенау медијуму културе и коришћен је као позитивна контрола, док је подлога за културу биланегативну контролу.
2.9. Ин витро тест зарастања рана
Да би се испитао ефекат ЦЛЕПС-а на зарастање рана, ХаЦаТ ћелије (1× 104ћелије / бунар)стављени су у плоче са 12-бунарићима током 48 х и нарасли су до ~100% конфлуенције. Једнослој је биорањен врхом стерилне 200µЛ пипета. Остаци ћелија су уклоњени прањемдва пута са ПБС. Ове ћелије су затим замењене свежим 1% серумским медијумом са илибез ЦЛЕПС-а (100, 500 и 1000µг/мЛ), након чега следи стимулација у трајању од 0–48 х. Контролагрупа је коришћена за поређење својства зацељивања рана у присуству и одсуствуоф ЦЛЕПС. Микрофотографије затварања ране (миграција ћелија) су направљене у 0–48 хистих рањених подручја помоћу инвертног микроскопа (Зеисс, Јена, Немачка). Тхепроцентуална промена површине ране у пикселима је квантификована ручно за сваку слику помоћу ИмагеЈСофтвер (в1.52а, Национални институти за здравље, Бетхесда, МД, САД).
2.10. Статистичка анализа
Биофункционални тестови ЦЛЕПС-а на свакој платформи су изведени у три примерка. Тхерезултати су изражени као средња вредност± стандардна девијација. Извршене су статистичке анализекоришћењем АНОВА, након чега следи Тукеи ХСД постхоц тест или Студентовt-тест. Ови тестовиобављене су коришћењем СПСС софтвера (в25, Интернатионал Бусинесс Мацхинес, Армонк, НИ,САД) и Мицрософт Екцел (в1905, Мицрософт, САД). Ап-вредностоф<0.05 was considered статистички значајна.
Имејл:wallence.suen@wecistanche.com Вхатсапп плус 86 15292862950
