Поглавље 2: Фактор сличан Крупелу 15 потискује пролиферацију мезангијалних ћелија бубрежних гломерула преко појачавања коњугације П53 СУМО1

За више информација. контактtina.xiang@wecistanche.com

3 РЕЗУЛТАТА

3.1|Скрининг гена који везују КЛФ15- преко ЦхИП-Сек у примарним бубрежним гломеруларним МЦ

Да бисмо идентификовали партнерске гене за директно везивање КЛФ15, извршили смо ЦхлП-Сек анализу и на крају прегледали 2478 гена. ГО анализа ових гена путем алата на веб страници ввв.унипрот.орг (Слика 1А, Б) открила је термине молекуларне функције повезане са 1941 геном, термине ћелијских компоненти који се односе на 1662 гена и термине биолошког процеса који се односе на 1766 гена. Пошто је наш циљ био да сазнамо како КЛФ15 утиче на МЦ, фокусирали смо се на гене повезане са ћелијским процесом. Међу 1315 гена повезаних са ћелијским процесом, пронађено је да 74 гена учествују у процесима ћелијског циклуса; конкретно, ови гени су учествовали у митотичком ћелијском циклусу, фазној транзицији ћелијског циклуса и другим процесима (Слика 1Ц, Д). Надаље, анализирали смо гене укључене у раст и открили да су повезани са развојним растом, растом ћелија и другим типовима раста (Слика 1Е).

3.2|Скрининг диференцијално регулисаних гена у КЛФ15-претераној експресији бубрежних гломеруларних МЦ помоћу СИЛАЦ и ЛЦ/МС

СИЛАЦ и ЛЦ/МС анализа ХРМЦ-а који прекомерно експримирају КЛФ15 у поређењу са родитељским ћелијама довела је до идентификације 1357 протеина. Користили смо ДАВИД и ИПА да набавимо ГО домене и обогаћене путеве квантификованих протеина које је идентификовао СИЛАЦ. Занимљиво је да су многи термини везани за биолошке функције протеина били међу првих 30 значајно обогаћених термина ГО, укључујући регулацију метаболичког процеса ћелијских аминокиселина, комплекс протеазома, везивање за протеине и термине транскрипције и транслације, који су сви уско повезани са убиквитинација (Слика 2А). Слика 2Б приказује првих 30 значајно обогаћених термина путање. Неколико термина биолошких процеса, укључујући термине протеазома и неуродегенеративне болести, такође су били повезани са убиквитинацијом.

Кликните да бисте сазнали оцистанцхена продају са детаљима

3.3|Биоинформатичка анализа КЛФ15-везујућих гена који су потенцијално повезани са пролиферацијом бубрежних гломеруларних МЦ

Да бисте истражили КЛФ{0}}везујуће гене који су потенцијално повезани сабубрежни гломеруларМЦ пролиферације, извршили смо биоинформатичку анализу ЦхИП-Сек података и СИЛАЦ-ЛЦ/МС података. Прегледано је 52 гена (Табела 2 и Слика 2Ц), а пет од ових гена, укључујући СУМО1, фактор инхибитора миграције макрофага (МИФ), еукариотски иницијацијски фактор (ЕИФ), фактор раста сличан инсулину (ИГФ) и ретикулокалбин (РЦН). ), били су уско повезани сапролиферација ћелија. Пошто су ГО и анализе путања различито експримираних протеина сугерисале да су скринирани гени повезани углавном са процесом убиквитинације, закључили смо да СУМО1, члан породице протеина сличних убиквитину (УБЛ), учествује у пост-транслационој модификацији сличној убиквитинација као циљни ген КЛФ15.

Све већи број доказа указује на то да је ХГ један од главних фактора који изазивају развој дијабетичке нефропатије, и промовише пролиферацију МЦ и повећану синтезу матрикса ин витро.25 Претходна студија је показала да је ПДГФ-ББ неопходан за пролиферацију МЦ која претходи развоју гломерулосклерозе код експерименталног гломерулонефритиса.26 Након што смо потврдили да су МЦ стимулисани ХГ или ПДГФ-ББ ин витро, открили смо промене у експресији КЛФ15 и СУМО1 и на РНК и на протеину.

нивоа и открили да ови молекули имају сличне трендове (слика 2Д-л). Коначно, утврдили смо да је СУМО1 циљни ген КЛФ15.

3.4|КЛФ15 регулише експресију СУМО-1 гена везивањем за ЦАЦЦЦА-СУМО{7}} регион од 16 бп и мотивом богатим Ц плус А

Користили смо МЕМЕ пакет (хттп://меме-суите.орг/тоолс/меме) да карактеришемо КЛФ15-мотиве везивања 52 прегледана гена из КЛФ15 ЦхлП-Сек података и идентификовали смо мотив везивања КЛФ (Слика 3А). Поред тога, даље смо анализирали више од хиљаду база узводно од СУМО1 промотера и открили да КЛФ15 може препознати и везати се за секвенцу од 16 бп (нуклеотиди -205~-199), укључујући - ЦАЦЦЦА-(Слика 3Б).ЦхИП-ПЦР је потврдио да је КЛФ15 везан за СУМО1 промотер, а резултати су показали значајно већу експресију СУМО1 у групи анти-КЛФ15 антитела него у контролној групи у позадини (слика 3Ц).

Штавише, извршили смо тест репортера са двоструком луциферазом да бисмо потврдили однос циљања између СУМО1 и КЛФ15. Група промотора СУМО1 дивљег типа показала је већу активност луциферазе од вектора пГЛ3 и мутантних група у ХРМЦ, а активност је значајно повећана прекомерном експресијом КЛФ15. Побољшања активности луциферазе су поништена трансфекцијом са плазмидом који експримира мутантни промоторски регион (Слика 3Д). Узети заједно, ови подаци сугеришу да је СУМО1 директна мета транскрипције КЛФ15.

3.5 |Провера П53 као СУМОилационог супстрата СУМО1

СУМО модификације су широко изражене пост-транслационе модификације код еукариота. Реверзибилна коњугација ових модификација са супстратним протеинима је такође позната као СУМОилација, која игра важну улогу у регулацији функција циљних протеина и даље учествује у различитим биолошким процесима, као што су нуклеоцитоплазматски транспорт, регулација транскрипције, апоптоза, стабилизација протеина, одговори на стрес и прогресија ћелијског циклуса.27 Да бисмо истражили низводне сигналне молекуле директно коњугиране са СУМО1, извршили смо мрежну анализу СУМО1 користећи ИПА базу података, а подаци су показали да се СУМО1 може директно коњугирати са П53, АПП, ЈУН и АКТ, између осталог. протеини (Слика 4А-Ц). Првобитно смо одабрали П53 као низводни молекул СУМО1 јер је то добро познати протеин који је уско повезан са ћелијском пролиферацијом.28.29 Штавише, користили смо СУМОсп софтвер за предвиђање могућих СУМОилационих секвенци П53инвариоусспециес и открили да П53 има секвенцу СУМОилације（ Слика 4Д). Да бисмо утврдили да ли је П53 заиста модификован СУМОилацијом, привремено смо трансфектовали ХРМЦ са СУМО1 прекомерно експресионим плазмидом или СУМО1 сиРНА. И ИП и Вестерн блот резултати открили су трендове у променама експресије СУМО1-П53 и П53 који су били у складу са променама у СУМО1 (Слика 4Е-Ј). Ови подаци указују да је П53 СУМОилациони супстрат СУМО1.

3.6 |КЛФ15 инхибира МЦ пролиферацију промовишући експресију СУМО1 и СУМОилацију П53

Да бисмо успоставили регулацију СУМОилације П53 и пролиферације МЦ помоћу КЛФ15 и СУМО1, интервенисали смо са експресијом КЛФ15 или СУМО1 у ХРМЦ и лечили ХРМЦ са ПДГФ-ББ. Међу ХРМЦ третираним ПДГФ-ББ, ћелије трансфектоване плазмидом прекомерне експресије КЛФ15 показале су већу експресију СУМО1-П53, П53, КЛФ15 и СУМО1 него ћелије трансфектоване КЛФ15 контролним плазмидом. Исте промене у СУМО1-П53, П53 и СУМО1 пронађене су у ћелијама трансфектованим плазмидом прекомерне експресије СУМО1, док је експресија КЛФ15 остала непромењена у овим ћелијама (Слика 5А-Ф). ПДГФ-ББ је један од најефикаснијих фактора раста МЦ-ова описаних до сада, а примећен је пролиферативни одговор ХРМЦ-а на ПДГФ-ББ. Као што је приказано на слици 5Г, Х, проценат ЕдУ-позитивних ћелија је значајно повећан применом рекомбинантног ПДГФ-ББ. Резултати бојења ЕдУ показали су да прекомерна експресија КЛФ15 и СУМО1 инхибира пролиферацију ћелија изазвану ПДГФ-ББ (Слика 5Г, Х).

Да бисмо стекли даљи увид у улоге КЛФ15 и СУМО1 у пролиферацији ХРМЦ-а, трансфектовали смо ћелије само са СУМО1 сиРНА или их котрансфектовали са СУМО1 сиРНА и плазмидом прекомерне експресије КЛФ15. Снижавање СУМО1 није утицало на експресију КЛФ15, али нивои експресије СУМО1-П53 и П53 су очигледно смањени након трансфекције СУМО1 сиРНА (Слика 6А-Ц). Поред тога, када је експресија СУМО1 инхибирана, нивои експресије СУМО1-П53 и П53 су такође потиснути чак и у ћелијама које прекомерно експримирају КЛФ15 (слика 6Д-Ф). Затим је пролиферација МЦ процењена коришћењем ЕдУ теста бојења. СУМО1 РНАи је побољшао пролиферативни ефекат ПДГФ-ББон ХРМЦс, а група котрансфектована плазмидом прекомерне експресије КЛФ15 и СУМО1 сиРНА имала је више ЕдУ-позитивних ћелија него група котрансфектована плазмидом прекомерне експресије и контролном хибридном секвенцом сиРНА (Слика 6Г, Х) . Стога закључујемо да КЛФ15 потискује пролиферацију МЦ повећавајући П53 СУМОилацију.

3.7|Глобална експресија СУМО1 и П53 у гломеруларним МЦ је у негативној корелацији са пролиферацијом МЦ код Тхи-1 нефритиса пацова

Анти-Тхи1 нефритис је класичан модел самоограниченог мезангијалног пролиферативног гломерулонефритиса са пролиферативном фазом и фазом опоравка. Убризгали смо Тхи1 антитело у Вистар пацове да бисмо направили овај модел. И азот урее у серуму и креатинин немају значајне промене између контролних пацова и моделних пацова (Слика С1). Изражена мезангијална пролиферација и акумулација ЕЦМ примећени су током пролиферативне фазе (5. и 7. дани) код пацова модела, а број МЦ се смањио током фазе опоравка 10. дана (Слика 7А). Такође смо детектовали промене експресије у маркеру ћелијске пролиферације ПЦНА помоћу ИХЦ (Слика 7А, Б). Нивои ПЦНА су повећани 5. дана, достигли врхунац 7. и смањени 10. дана (Слика 7Ф). Вестерн блот анализа је показала да је експресија протеина П53, СУМО1 и КЛФ15 у изолованим гломерулима била нижа у моделним групама него у контролној групи (Слика 7Ц, Д), у складу са имунохистохемијским резултатима (Слика 7Е, Ф). Ови резултати показују да је абнормална пролиферација МЦ код пацова анти-Тхи1 модела повезана са ниским нивоом експресије КЛФ15 и СУМО1. Очекује се да ће ометање експресије ових молекула ублажити патолошки фенотип код пацова.

4. ДИСКУСИЈА

Тхегломеруласу јединице за филтрирањебубрега. Поремећај функције гломерула може бити узрокован примарном патологијом гломерула или може бити секундарно у односу на системске болести. Мезангијалне промене су примећене након повреде гломерула укључујући хиперпролиферацију МЦ праћено прекомерном производњом ЕЦМ (мезангијална експанзија) и производњом хемоатрактанта за инфламаторне ћелије. Стога је модулација МЦ одговора, посебно абнормалне пролиферације, нови терапијски приступ. КЛФ15 је протеин који игра регулаторну улогу као фактор транскрипције везивањем за специфичне секвенце ДНК. Многе студије су известиле да је КЛФ15 укључен у регулацију пролиферације ћелија. На пример, откривено је да КЛФ15 учествује у инхибицији сигналних путева повезаних са пролиферацијом МЦ,15,30 али његов директни циљни ген није пријављен у литератури. Стога је ова студија укључивала углавном заједнички скрининг нивоа транскрипције и транслације да би се идентификовао директни циљни ген КЛФ15.

КЛФ15 регулише различите гене у различитим врстама иу различитим ткивима и органима. У процесу регулације пролиферације МЦ, КЛФ15 утиче на експресију више гена и учествује у више путева.131,32 Да бисмо истражили директне циљне гене КЛФ15, користили смо ЦхИП-Сег. Клеин РХ и његове колеге су користили ЦхлП-сек технологија за проучавање регулације КЛФ7 на диференцијацију епителних ћелија рожњаче.33 Иинг М и сарадници су користили ову технику да проучавају инхибиторни ефекат КЛФ9 на плурипотенцију глиобластома.34У поређењу са ЦхлП-чипом, ЦхИП-Сек омогућава праву анализу целог генома са вишом резолуцијом, већом осетљивошћу детекције и мањим захтевом за величином узорка.35 Користили смо ЦхП да бисмо добили ДНК фрагменте директно везане за КЛФ15, а након поређења и анализе са ГенБанк-ом, прегледали смо 2478 могућих циљних гена. Кроз ГО и анализе пута, идентификовали смо многе циљне гене укључене у ћелијски циклус и процесе пролиферације.

ЦхлП-Сек експерименти захтевају ПЦР за појачање детекционог сигнала, а одређени степен пристрасности током процеса амплификације је неизбежан. Поред тога, ЦхИП-Сек добија само гене које КЛФ15 може да веже и не указује на промене које се јављају у експресији ових гена када се експресија КЛФ15 промени. Користили смо СИЛАЦ-ЛЦ/МС протеомичку анализу да компензирамо ове недостатке. Ова техника пружа информације о свим протеинима чија се експресија мења након регулације помоћу КЛФ15, укључујући протеине које директно регулише КЛФ15 и протеине који су индиректно регулисани или пост-транслационо модификовани. ХРМЦ су култивисане коришћењем СИЛАЦ-а, а КЛФ15 је прекомерно експримиран у ћелијама кроз трансфекцију плазмида. Протеини су сакупљени за ЛЦ/МС детекцију и добијено је 1357 различито експримираних протеина. ГО и анализе путева откриле су да су неки од различито експримираних протеина укључени у убиквитинацију. Подаци о генима и протеинима су укрштани. Гени који нису повезани са сврхом истраживања и гени који нису директно регулисани КЛФ15 су уклоњени; на крају, прегледана су 52 гена. Међу њима је одабрано пет гена са најочигледнијим разликама у експресији који су били најближи повезани са пролиферацијом. Имајући у виду комбиноване резултате анализе пута, анализе експресије СУМО1 и КЛФ15 у пролиферирајућим ХРМЦс, ЦхлП-ПЦР и дуал-луциферасе репортер тестовима, протеин СУМО1 је одабран као циљни ген КЛФ15.

Поред убиквитина, идентификује се све већи број УБЛпротеина,3637 укључујући СУМО,38 неуралне прекурсорске ћелије изражене, развојно наниже регулисане 8(НЕДД8)3940 и интерфероном стимулисан ген 15(ИСГ15),41. Ови модификујући протеини снажно регулишу различите биолошке процесе. Ковалентно додавање СУМО-а супстратима, названо СУМОилација, је посттранслациона модификација укључена у низ ћелијских процеса, укључујући нуклеарно-цитосолни транспорт, регулацију транскрипције, апоптозу, контролу стабилности протеина, реакције на стрес и прогресију ћелијског циклуса.27СУМО је типично везан за акцепторске лизинске остатке протеинских супстрата који садрже консензус секвенцу и доприносе регулацији интеракција протеин-протеин, као и субћелијској компартментализацији и стабилности протеина.2 сУМО1, као члан СУМОС породице, може утицати на пролиферацију ћелије модификовањем супстрата и стабилизовање регулаторних протеина ћелијског циклуса.43 Стога, у комбинацији са извештајем из литературе и свеобухватним резултатима скрининга и анализе, фокусирали смо се на то како КЛФ15 регулише ефекат СУМО1 на пролиферацију мезангијалних ћелија.

Да бисмо идентификовали супстрате СУМО1, извршили смо мрежну анализу СУМО1 користећи ИПА базу података и СУМОсп софтвер. У комбинацији са објављеним истраживањем о П53, наши почетни подаци скрининга сугерисали су П53 као низводни молекул СУМО1 са СУМОилационом секвенцом ИКкД/Е. Претходне студије су показале да је П53 био супстрат СУМОилације,45 а појачана коњугација П53 СУМО1 промовише стабилност и активност П53 и индукује се-несценцију.46 У нашој студији, интерференција са експресијом СУМО1 у ХРМЦ-има произвела је исте трендове промене у СУМО1-П53 и П53, што указује да је П53 био СУМОилациони супстрат СУМО1.

Нови докази указују да СУМОилација и де-СУМОилација играју улогу у бројним нефропатским болестима, као што су дисгенеза бубрега, карцином бубрега, гломеруларна болест, апоптоза подоцита и хипертоницност бубрежне сржи, акутна повреда бубрега и нефролитија. однос између КЛФ15, СУМО1, П53 СУМОилације и МЦ пролиферације, извршили смо серију третмана трансфекције на ћелијама које су биле подвргнуте пролиферацији изазваној ПДГФ-ББ. Прекомерна експресија КЛФ15 је регулисала експресију СУМО1, док прекомерна експресија СУМО1 није утицала на експресију КЛФ15. Прекомерна експресија КЛФ15 или СУМО1 повећала је СУМОилацију П53 и антагонизирала пролиферацију ћелија изазвану ПДГФ-ББ. Када је експресија СУМО1 била инхибирана, СУМОилација П53 је такође била инхибирана, а КЛФ15 је изгубио свој антагонистички ефекат на пролиферацију ћелија. Ин виво. пролиферација МЦ се постепено повећавала са погоршањем мезангијалног пролиферативног нефритиса, док се експресија КЛФ15, СУМО1 и П53 значајно смањивала. Узимајући у обзир интегрисана посматрања у ћелијама и ткивима, прелиминарно закључујемо да КЛФ15 регулише СУМОилацију П53 преко СУМО1, чиме инхибира МЦ пролиферацију.

5. ЗАКЉУЧЦИ

Неке студије су показале да КЛФ15 игра важну улогу у регулисању пролиферације МЦ. У овом раду истражили смо механизме супресије пролиферације МЦ посредоване овим фактором транскрипције. Идентификовали смо СУМО1 као примарни циљ КЛФ15 у МЦ путем биоинформатичких анализа које укључују ЦхИП-Сек и СИЛАЦ-ЛЦ/МС. Штавише, уз помоћ ИПА базе података и СУМОсп софтвера, утврдили смо да је П53 директан супстрат СУМО1. Експерименти ин витро и ин виво потврдили су да КЛФ15 може да промовише експресију СУМО1 и СУМОилацију П53, а затим инхибира пролиферацију МЦ (слика С2). Ови резултати доприносе разумевању регулаторне улоге КЛФ15 у пролиферацији МЦ и пружају теоријску основу за проналажење нових третмана за болести бубрега повезаних са МЦ пролиферацијом.