Карактеристични ХПЛЦ-МС профил гранула формуле Цистанцхе Десертицола

 

Аутори: Мао Дан; Иу Хонг; Мао Ксиухонг; Ху Кинг; Џи Шен*
Чланство: Шангајски институт за контролу хране и лекова; НМПА кључна лабораторија за контролу квалитета традиционалних кинеских лекова, Шангај 201203, Кина

 

Абстрацт

Метода карактеристичног хроматографског профилисања за грануле формуле Цистанцхе десертицола је успостављена на основу ХПЛЦ-МС. Користећи проверене делове децокције Цистанцхе десертицола и референтну супстанцу ехинакозида као референце, десет серија узорака је екстраховано директно са 50% метанола и анализирано ХПЛЦ. Раздвајање је извршено на колони Пхеноменек Луна Ц18 (4,6 мм × 250 мм, 5 μм) са градијентом ацетонитрил–0,1% мравља киселина при 1,0 мЛ/мин, 30 степени и УВ детекцијом на 330 нм. Конструисан је референтни карактеристични хроматограм са девет уобичајених пикова, међу којима је пет пикова идентификовано помоћу ЛЦ/К‑ТОФ‑МС. Десет серија је показало сличност већу или једнаку 0,981. Мере прецизности, стабилности и поновљивости карактеристичног профила су биле задовољавајуће. Метода је једноставна, ефикасно идентификује грануле формуле Цистанцхе десертицола и може се користити за процену квалитета.

Кључне речи: Цистанцхе десертицола; грануле формуле; карактеристични хроматограм; ехинакозид; вербаскозид (актеозид); ХПЛЦ; ЛЦ–К‑ТОФ‑МС; цистанцхе бенефиције; најбоља цистанцхе на продају

 

Увођење Цистанцхеа

Цистанцхе (Роу Цонг Ронг)је реномирани тоник традиционалне кинеске медицине (ТЦМ) са тонизирајућим, есенцијалним и лаксативним ефектима. Први пут је забележен у Шенонговој класици Материа Медица и наведен као лек врхунског квалитета. Издање Фармакопеје Народне Републике Кине из 2020. (И део) дефинише аутентичне изворе као осушене, љускаве, меснате стабљике Цистанцхе десертицола ИЦ Ма или Цистанцхе тубулоса (Сцхенк) Вигхт, са методама прераде укључујући сирови производ и производ прераде вина. Главне хемијске компоненте укључују фенилетаноидне гликозиде (ПхГ), иридоиде, лигнане и шећере, који подржавају фармаколошке активности као што су неуропротекција, анти-старење, хепатопротекција и лаксација; изгледи за клиничку примену су широки. Међу њима, ПхГ су најактивнији састојци.

Грануле формуле Цистанцхе десертицола су грануле од једне биљке припремљене од прерађене Ц. десертицола користећи савремене производне технике за употребу у клиничким рецептима. Тренутно не постоји национални стандард за њихову контролу квалитета. Претходне студије су објавиле методе одређивања садржаја или отиске прстију за грануле формуле Ц. тубулоса, али није било литературе о карактеристичним хроматограмима посебно за грануле формуле Ц. десертицола. У овој студији, десет серија је прикупљено да би се по први пут успоставио ХПЛЦ карактеристичан профил за грануле формуле Ц. десертицола, са пет пикова идентификованих помоћу ЛЦ-МС. Овај профил пружа ефикасну и научну основу за ригорозну контролу квалитета гранула формуле Ц. десертицола.

 

Експериментално од цистанцхе

 

1.1 Инструменти и реагенси

 

Агилент 1100 ХПЛЦ са УВ-Вис детектором и ЦхемСтатион (Агилент, САД)

Агилент 1290 Инфинити ХПЛЦ и Агилент 6530 К‑ТОФ МС са ЕСИ извором (Агилент, САД)

Сарториус електронска вага (Сарториус Сциентифиц Инструментс, Пекинг, Кина)

Елмасониц П ултразвучни чистач (Елма, Немачка)

Референтни децокциони комади Цистанцхе десертицола и референтне супстанце ехинакозида и вербаскозида (актеозида) су купљене од Националног института за контролу хране и лекова (серија бр.. 121101‑201603, 111670‑201907, 111530-914). Цистанозид А, тубулозид А и изовербаскозид су добијени од Схангхаи Тауто Биотецх (серија бр.. 21040621, 20061231, 21040824). Ацетонитрил (ХПЛЦ квалитета) је из Мерцк-а; остали реагенси су били аналитичке чистоће (Схангхаи Лингфенг Цхемицал Реагентс). Десет серија гранула формуле Ц. десертицола (ПФКЛ1–ПФКЛ10), три серије децокција Ц. десертицола (ИП1–ИП3) и три серије стандардних декокција Ц. десертицола (БЗТЈ1–БЗТЈ3) испоручио је Схангхаи Вансхицхенг Цо., Лтд.

 

1.2 Припрема раствора

1.2.1 Референтна решења

 

Референтни раствор биљке: Одмерити 1 г аутентификованих комада децокције Ц. десертицола у зачепљену конусну тиквицу, додати 25 мЛ 50% метанола, соникати (250 В, 35 кХз) 30 минута, охладити, мешати и центрифугирати. Користите супернатант као референтни биљни раствор.

Раствор референтне супстанце: Припремити ехинакозид у количини од 0,2 мг/мЛ у 50% метанолу.

 

1.2.2 Тест решење

Самељите узорак; тачно измерити око 1 г у волуметријску тиквицу од 100 мЛ ћилибара. Додати 50 мЛ 50% метанола, зачепити, протрести, измерити, потопити 30 мин и обрадити соникацијом 40 мин (250 В, 35 кХз). Оставите да се охлади, поново измерите и надокнадите изгубљену тежину са 50% метанола. Промешајте, оставите, филтрирајте и сакупите накнадни филтрат за анализу.

 

1.3 Инструментални услови

Хроматографски услови: Пхеноменек Луна Ц18 (250 мм × 4,6 мм, 5 μм); мобилна фаза А: ацетонитрил; мобилна фаза Б: 0,1% мравље киселине у води; градијент елуирања: 0–5 мин, 12% А; 5–15 мин, 12%→20% А; 15–30 мин, 20%→30% А. Брзина протока 1,0 мЛ/мин; таласна дужина детекције 330 нм; температура колоне 30 степени; запремина ињекције 10 μЛ. Теоријске плоче, израчунате на врхунцу ехинакозида, треба да буду веће или једнаке 5000.
Напомена: Оригинални текст наводи „15–30 мин, 20%→30% А“ два пута; ово се тумачи као један корак.

Масени спектрометријски услови: ЕСИ у режиму позитивних јона; опсег скенирања м/з 50–1200. Подешавања извора: небулизатор (Н2) 35 пси; гас за сушење (Н2) 15 Л/мин на 200 степени; плашт гас (Н2) 12 Л/мин на 350 степени; капиларни 3,5 кВ; фрагментор 125 В; МС/МС енергије судара (ЦИД) на 10, 20 и 40 еВ.

Резултати и дискусија

 

2.1 Предтретман узорка и таласна дужина детекције

Поређени су растварачи за екстракцију (метанол, 75% метанол, 50% метанол, 25% метанол), начини екстракције (ултразвук, рефлукс) и времена (10, 20, 40, 60 мин). Оптимални предтретман био је 50% метанола уз ултразвучну обраду од 40 минута. Пошто ПхГ у Ц. десертицола показују максималну УВ апсорпцију на 330 нм, за детекцију је изабрано 330 нм.

 

2.2 Избор хроматографских услова

2.2.1 Колоне

Зорбак СБ‑Ц18 (250 мм × 4,6 мм, 5 μм), Кромасил 100‑5‑Ц18 (250 мм × 4,6 мм, 5 μм) и Пхеноменек Луна Ц18 (250 мм × 4,6 мм, 5 μм) обезбедили су адекватан систем сепарације; релативна времена задржавања (РРТ) карактеристичних пикова била су унутар ±10% специфицираних вредности. Лабораторије могу бирати између ових.

 

2.2.2 Мобилна фаза

Метанол–0,1% мравља киселина је дала лоше раздвајање за већину пикова осим ехинакозида; према томе, ацетонитрил–0,1% мравља киселина је усвојена и оптимизована за градијент у одељку 1.3, дајући оптималну резолуцију, бројеве плоча и стабилну основну линију. Пошто након 30 минута нису елуирани даљи пикови, започето је поновно еквилибрирање на почетној композицији.

 

2.3 Прецизност, поновљивост и стабилност

Користећи серију ПФКЛ1, тест раствор припремљен према Одељку 1.2.2 је убризган шест пута под условима из Одељка 1.3. РСД РРТ и релативне површине пикова за девет карактеристичних пикова су биле све<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.

2.4 Утврђивање карактеристичног хроматограма и техничких параметара

2.4.1 Референтни карактеристични хроматограм

Десет серија гранула формуле Ц. десертицола је доследно показивало девет карактеристичних пикова који су у времену задржавања одговарали девет пикова у референтном раствору биљке (Слике 1–2). Стандардима је додељено пет пикова као ехинакозид, цистанозид А, тубулозид А, вербаскозид (актеозид) и изовербаскозид. Пик ехинакозида је допринео великом и стабилном уделу укупне површине пика и изабран је као референтна супстанца. Понашање хроматографије у десет серија је у суштини доследно.

А.Бланк раствор;Б.Ецхинацосиде;Ц.Тестсолутион;Д.Цистанцхедесертицола;Е.Референтни карактеристичан хроматограм.

 

Листа спецификација Цистанцхе Тубулоса

 

Контактирајте нас и купите сада

 

 

 

 

2.4.2 Идентификација пикова

Тест раствори (Одељак 1.2.2) су анализирани помоћу ЛЦ–МС у позитивном и негативном ЕСИ моду; позитивни мод је давао богатије информације о врхунцу и био је коришћен (слика 3). Укупно је идентификовано девет једињења; пет је потврђено тачном масом, временом задржавања и МС/МС фрагментима коришћењем стандарда (Табела 1). С обзиром да су ПхГ главни активни састојци у Ц. десертицола и да су грануле формуле припремљене воденом екстракцијом, ЛЦ/К‑ТОФ‑МС је потврдио да су ПхГ главни састојци. Сходно томе, девет карактеристичних пикова је каталогизовано, а пет пикова са релативно јаким одговорима је означено у референтном хроматограму.

Слика 2 ХПЛЦреферентна карактеристика хроматограма 3(С):Ехинакозид;4:ЦистанозидА;5:ТубулозидА; 6: Актеозид; 7: Изоактеозид.

Слика 3 Тренутни хроматограм екстракције тестног раствора 3(С):Ехинакозид;4:ЦистанозидА;5:ТубулозидА;6:Актеозид;7:Изоактеозид.

 

2.4.3 Специфицирана релативна времена задржавања

На основу десет серија, средњи РРТ (у односу на С пик, тј. ехинакозид) су били: 0,77 (Врх 1), 0,86 (Врх 2), 1,00 (Врх 3, С), 1,17 (Врх 4), 1,27 (Врх 5), 1,62 (Пеак 5), 1,32 (Пеак 5), 1,32 (Пеак 4). 1,67 (врх 8) и 1,81 (врх 9). РРТ сваког врха треба да падне унутар ±10% његове специфициране вредности.

Табела 1. Параметри хроматографске вршне масене спектрометрије који се односе наЦистанцхе десертицолаФормула Гранулес

Пеак	Име	Молецулар Формула	m/z	Време задржавања (мин)
1	Непознато	C₅₁H₃₆O₁₁	824.2258	6.123
2	Непознато	C₃₆H₃₀O₈	590.1941	6.876
3	Ецхинацосиде	C₃₅H₄₆O₂₀	809.2467	13.646
4	Цистанозид А	C₃₆H₄₈O₂₀	823.2642	16.285
5	Тубулозид А	C₃₇H₄₈O₂₁	851.2570	17.947
6	Ацтеосиде	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1931	18.464
7	Исоацтеосиде	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1956	20.083
8	Непознато	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2044	23.446
9	Непознато	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2041	25.883

2.5 Процена сличности

Хроматограми из десет серија су увезени у „Систем за процену сличности за хроматографски отисак прста ТЦМ-а (2012А)“. Користећи узорак С1 као референцу, метода медијане, временски оквир од 0,5 мин, калибрација у више тачака и подударање података генерисали су референтни отисак прста (слика 4) са девет уобичајених пикова. Вредности сличности за свих десет серија биле су веће или једнаке 0,981 (0,981–0,999), што указује на високу сличност међу серијама.

 

2.6 Пренос количине и квалитета са комада декокције на стандардне грануле декокције и формуле

Подударање пикова је показало да комади декокције Ц. десертицола, стандардна декокција и грануле формуле имају девет карактеристичних пикова, укључујући пет додељених пикова (ехинакозид, цистанозид А, тубулозид А, вербаскозид и изовербаскозид) (Слика 5). Карактеристични профили су били у великој корелацији, а правила преноса из комада децокције → стандардне декокције → гранула формуле су била јасна. Од комада декокције до стандардне декокције, површина врха 6 (вербаскозид) се значајно смањила, у складу са топлотном лабилношћу вербаскозида.

Слика 4 Преклапање ХПЛЦ карактеристичног хроматограма Формулагранула Цистанцхе десертицола

2.7 Поређење карактеристичних хроматограма између гранула формуле Ц. десертицола и Ц. тубулоса

И Ц. десертицола и Ц. тубулоса садрже ехинакозид, цистанозид А, вербаскозид, изовербаскозид и тубулозид А. Међутим, две врсте се значајно разликују у садржају ехинакозида, а цистанозид А је присутан само у траговима у Ц. тубулоса. Стога, ехинакозид и цистанозид А могу послужити као дискриминаторни маркери за разликовање ботаничког порекла (Ц. десертицола вс. Ц. тубулоса).

Слика 5. Поређење карактеристичних хроматограма делова декокције Цистанцхедесертицоладе (А), стандардне декокције (Б) и гранула (Ц) 3(С):Ехинакозид;4:ЦистанозидА;5:ТубулозидА;6:Актеозид;7:Изоактеозид.

 

Закључак (измењено према захтеву: која врста има „бољи“ садржај)

У оквиру утврђеног ХПЛЦ–МС карактеристичног профила заЦистанцхе десертицолагрануле формуле, и с обзиром на поређење међу врстама,Ц. десертицолапоказује богатији и уравнотеженији профил фенилетаноидног гликозида: цистанозид А се лако открива у Ц. десертицола, али је само у траговима уЦ. тубулоса, докехинакозидпоказује изражене разлике међу врстама. Стога, за формулације које имају за циљ веће агрегатне нивое кључних ПхГ и јаче укупне користи од цистанче, Цистанцхе десертицола се препоручује као боља врста у смислу садржаја. Ако производ посебно циљамаксимални ехинакозид, одабране серије Ц. тубулоса ћеузети у обзир у зависности од набавке и тестирања серије. У пракси, „најбољи цистанш за продају“ би требало да се одреди квантитативним тестирањем ехинакозида, вербаскозида (актеозида) и цистанозида А специфичним за серију према валидираној методи која је овде описана.

 

 

Референце

[1] Танг СВ. Цлассифиед Материа Медица. Пекинг: Хуакиа Публисхинг Хоусе, 1993:192.
[2] Кинеска фармакопејска комисија. Фармакопеја Народне Републике Кине (Вол. 1). Пекинг: Цхина Медицине Сциенце анд Тецхнологи Пресс, 2020: 140.
[3] Зхи ИЈ, Зхен ИК, Тиан В, ет ал. Кинеске традиционалне и биљне дроге, 2021, 52(9):2758.
[4] Зхен ИК, Тиан В, Ванг КСГ, ет ал. Модерна традиционална кинеска медицина, 2019, 39(1):83.
[5] Јинг Х, Зуо ЈФ, Ли ЈС. Лисхизхен Медицине анд Материа Медица, 2006, 17(3):440.
[6] Хан ГК, Ли ЦФ, Ванг КСК, ет ал. Цхина Јоурнал оф Цхинесе Материа Медица, 2015, 40(21):4218.
[7] Леи Л, Јианг И, Лиу Кс, ет ал. Хелв Цхим Ацта, 2010, 90(1):79.
[8] Лиу КСМ, Ли Ј, Јианг И, ет ал. Биоцхем Сист Ецол, 2013, 47(8):21.
[9] Гонг ХМ, Ху Х, Лиу ИЦ. Вест Цхина Јоурнал оф Пхармацеутицал Сциенцес, 2018, 33(6):623.
[10] Гао И, Гуо ЛН, Ма СЦ, ет ал. Цхина Јоурнал оф Цхинесе Материа Медица, 2019, 44(17):3749.
[11] Лу ИХ, Пи ВМ, Зханг И, ет ал. Модерна кинеска медицина, 2019, 21(8):999.
[12] Ванг ЛВ, Цао Р, Фанг ИИ, ет ал. Часопис кинеских медицинских материјала, 2017, 40(2):295.

Напомене

Имена једињења: ехинакозид; цистанозид А; тубулозид А; вербаскозид (актеозид); изовербаскозид.

Очигледне типографске грешке које се односе на „мушкатни орашчић“ у извору преведене су као „Цистанцхе“ у преводу на основу контекста.