Карактерише га опадање физиолошких функција у појединачним системима органа

За више информација контактирајте oscar.xiao@wecistanche.com

РЕЗИМЕ

Црни чај је најчешће конзумирано чајно пиће на свету и стално се наводи да има предности против старења. Међутим, остаје углавном непознато да ли су теафлавини, једна врста карактеристичних фитокемикалија у екстрактима црног чаја, укључени у регулисање старења и животног века потрошача. У овој студији, показали смо да теафлавини играју корисну улогу у спречавању цревног цурења и дисбиозе са почетком старења, чиме се одлаже старење код дрозофиле. Механички, теафлавини регулишу скуп кондензата Имд-а да негативно управљају прекомерном активацијом Имд сигнала у цревима воћне мушице. Поред тога, теафлавини спречавају ДСС-индуковани колитис код мишева, што сугерише да теафлавини играју улогу у модулацији интегритета црева. Све у свему, наша студија открива молекуларни механизам којим теафлавини регулишу хомеостазу црева вероватно кроз контролу Имд коалесценције.

Кликните овде да бисте сазнали више

УВОД

Старење, које карактерише пад физиолошких функција у појединачним системима органа и растући ризик од болести и смрти, укључује накупљање оштећења на молекулима, ћелијама и ткивима (Алавез ет ал., 2011; Бартке ет ал., 2019; Енгеет ал., 2017). Идентификација функционалних материјала или хемикалија које спречавају биолошко пропадање ради одлагања процеса старења и продужења животног века је несумњиво кључна (Бар-ардо ет ал., 2017; Капахи ет ал., 2017). Претходне студије су објавиле да црни чај, најчешће конзумиран чај на свету, има значајне активности које одлажу старење (Цамерон ет ал., 2008; Феи ет ал., 2017; Кумар и Ризви, 2017; Наумовски ет ал., 2019. ; Пенг ет ал., 2009; Ксиао ет ал., 2020). Додатак исхрани са екстрактима црног чаја ефикасно продужава животни век експерименталних животиња као што су црви (Феет ал., 2017), воћне мушице (Пенг ет ал., 2009; Сите ал., 2011), мишеви (Сите ал., 2011 ; Ксиао ет ал., 2020) и пацови (Кумар и Ризви, 2017).

Добро је познато да екстракти црног чаја углавном садрже две врсте фитокемикалија, наиме, катехине и теафлавине (ТФ) (Цамерон ет ал., 2008; Кондо ет ал., 2019; Ли ет ал., 2013), од којих је последњи се производе од катехина ендогеном полифенол оксидазом и пероксидазом током процеса оксидације у производњи црног чаја (Ли ет ал., 2013). Низ студија је идентификовао улогу катехина против старења кроз побољшање оксидативног стреса и упале повезане са старењем и смањење оштећења ткива (Цамерон ет ал., 2008; Ниу ет ал., 2013; Пенг ет ал., 2009; Си ет ал. .2011; Ваанер ет ал., 2015). Међутим, функционалне студије о доприносу ТФ-а старењу увелико су заостајале за онима о катехинима, јер је тешко издвојити довољне количине ТФ-а из листова црног чаја за медицинске студије (Такемото и Такемото, 2018). Недавно је развијено неколико биосинтетичких метода за масовну производњу ТФ-а (Такемото и Такемото, 2018), што је омогућило да се истраже тачни биолошки ефекти ТФ-а и основни регулаторни механизми.

Недавно је све већи скуп података истакао кључну улогу црева у старењу и модулацији животног века (Гуо ет ал., 2014; Јји ет ал., 2019; Маинард и Веинкове, 2018; Ротхенберг и Зханг, 2019; Салазар ет ал. ,2018). Интестинални епител, који делује као селективна баријера, омогућава апсорпцију хранљивих материја, јона и воде и ограничава контакт домаћина са штетним ентитетима, укључујући микроорганизме, дијететске антигене и токсине из животне средине (Цапо ет ал., 2019; Ницхолсон ет ал. , 2012; Риу ет ал., 2010). Као ткиво са високим прометом код појединаца, цревни тракт пружа најбоље животно окружење за симбиотске микроорганизме, укључујући природне анаеробне услове, обиље хранљивих материја и одговарајућу температуру и пХ

Слика 1. Теафлавини продужавају животни век Дросопхиле и побољшавају способност пењања

(А и Б) Женке воћних мушица су узгајане са стандардном храном која је допуњена са 1 мг/мл или 2,5 мг/мл теафлавина (ТФ) или без ТФ као базала. Муве су пренете у свеже бочице које садрже нове медије сваки други дан, а мртве муве су се бележиле током целог животног века одраслих, анализиране су и приказане криве преживљавања (А) и средња дуговечност (Б) женки мува.

(Канд Д) Женке в18 храњене су стандардном храном за Дросопхила (позваном Басал) или храном са додатком 1мг/мл или 2,5мг/ЕТФ, респективно. Шест независних група мува у назначеном узрасту (10 дана, 30 дана, 40 дана и 50 дана, респективно) подвргнуто је тестовима цафе (Ц) и храњења флуоресцеином (Д). вредности, формирајући нише које заузимају специфичне бактеријске врсте у телу (Бонфини ет ал.,2016; Буцхон ет ал., 2013; Ницхолсон ет ал., 2012). У међувремену, ови симбиотски микроорганизми и њихови метаболити такође директно или индиректно утичу на обраду хранљивих материја; варење и апсорпција; енергетски биланс; имунолошка функција; гастроинтестинални развој и сазревање; и многе друге важне физиолошке активности (Бонфини ет ал., 2016; Бродерицк, 2016; Маинард и ВВеинкове, 2018; Ницхолсон ет ал., 2012). Обострано користан однос између два симбионта може одржати стабилност и динамичку равнотежу цревног микро-екосистема (Бонфини ет ал., 2016; Бродеерицк, 2016; Бродерицк ет ал., 2014; Гуо ет., 2014; Маи-нард и Веинкове, 2018; Ницхолсон ет ал., 2012).

цистанцхе може против старења

Низ студија је показао да је урођени имуни одговор критичан за одржавање хомеостазе цревне микробиоте и да се чува од бескичмењака до кичмењака (Гуиллоует ал., 2016; Гуо ет ал., 2014; Риу ет ал., 2006, 2010; Вијаи- Кумар ет ал., 2010). Код Дросопхиле, два главна сигнална пута, наиме, путеви Толл и имунодефицијенције (Имд), укључени су у урођене имуне одговоре (Лу ет ал., 2020; Миллимакиет ал., 2014; Валанне ет ал., 2011). Значајно је да пут Дросопхила Толл дели сличности са путевима рецептора интерлеукина-1 сисара (ИЛ-1Р) и МиД88-зависним Толл-лике рецептор (ТЛР), док је Имд пут сличан на пут рецептора фактора туморске некрозе (ТНФР) и ТРИФ-зависни ТЛР пут код сисара (Имлер, 2014; Миллимаки ет ал., 2014; Валанне ет ал., 2011). Ова два пута контролишу експресију антимикробних пептида (АМП) кроз активацију фактора транскрипције НФ-КБ (Имлер, 2014; Миллимаки ет ал., 2014; Валанне ет ал., 2011).биофлавоноидиИмд сигнални пут се нормално активира Грам-негативном бактеријском инфекцијом и резултира експресијом другог скупа АМП, као што су Аттацин, Цецропин и Диптерицин (Клеино и Силверман, 2014; Миллимаки ет ал., 2014). Експресија ових АМП захтева протеин за препознавање пептидогликана (ПГРП)-ЛЦ рецептор на путу Имд и цепање зависно од сигнала и нуклеарну транслокацију Релисха, транскрипционог фактора породице НФ-кБ (Клеино и Силверман, 2014; Миллимаки ет ал., 2014). Недавна студија је показала да је формирање амилоида потребно за активацију пута Дросопхила Имд након препознавања бактеријских пептидогликана (Клеино ет ал., 2017). Међутим, да ли је овај Имд кондензат укључен у друге биолошке процесе, као што је одржавање цревне хомеостазе и регулација старења, остаје углавном непознато.

У овој студији користили смо воћне мушице и мишеве као животињске моделе да бисмо истражили улогу ТФ-а у контроли интегритета црева и старења. Показали смо да ТФ одлажу прекомерну пролиферацију цревних матичних ћелија која почиње са старењем, штите од дисбиозе цревног микробиома и спречавају активацију Имд сигналног пута, чиме се продужава животни век Дросопхиле. Даље механичке студије су показале да ТФ-ови негативно доприносе Имд сигнализацији могу бити кроз блокирање кондензације Имд-а, а не његове свеприсутне. Штавише, открили смо да су ТФ веома ефикасни у превенцији колитиса изазваног ДСС код мишева. Узети заједно, наши налази откривају потенцијалну улогу ТФ-а у модулацији понашања Имд-а, што би могло бити кључни фактор у њиховом позитивном доприносу цревној хомеостази и продужењу животног века.

РЕЗУЛТАТИ

Додатак исхрани теафлавина продужава животни век Дросопхиле

Да бисмо испитали да ли теафлавини (ТФ) утичу на старење и животни век код Дросопхиле, узгајали смо женке в'118 мува са стандардном храном за узгој којој је додато 1мг/мЛ или 2.5мг/мл ТФ и извршили тестове животног века као што је претходно описано (Ји ет ал. .,2019). Муве храњене исхраном допуњеном једнаком запремином ТФс растварача (Х2О) сматране су контролама. Као што је приказано на слици 1А, додатак исхрани релативно ниске концентрације ТФ-а (1 мг/мЛ) благо је продужио животни век воћне мушице, а висока концентрација ТФ-а (2,5 мг/мЛ) имала је значајно позитиван ефекат на продужење животног века. Значајно је да је дугорочно узимање високих концентрација ТФ-а (2,5 мг/мЛ) резултирало повећањем просечног животног века женки мува за отприлике 8 дана (Слика 1Б), што указује на корисну улогу ТФсин-а у регулисању дуговечности код Дросопхиле. Слични резултати су добијени када смо тестирали потенцијалне ефекте додатних ТФ-ова на животни век мужјака в'*'''8 мува (слике С1А и С1Б).

Слика 2. Теафлавини спречавају дисфункцију црева са почетком старења и дисбиозу микробиоте код Дросопхила

(А и Б) Губитак интегритета црева је анализирао Штрумпфтест у доби од 10 дана, 30 дана, 40 дана и 50 дана код женки са 18 одраслих. Примери не-Штрумпфова и Штрумпфова приказани су у (А). Проценти Штрумпфова у различитим назначеним групама су анализирани и приказани у (Б).

(Ц) Анализиране су и приказане количине бактерија које су сачуване кПЦР гена 16С рРНА у женским в18 фајловима из различитих назначених група.

(ДФ) Извршено је секвенцирање комензалног бактеријског 16С рРНА гена. Анализирани су и представљени пропорције бактеријских таксона (Д), топлотна мапа главних микробних таксона (Ф) и релативна бројност гамапротеобактерија (Ф).

Слика 2. Наставак

(Г и Х) Излуци су сецирани од назначених женки мува храњених са 2,5 мг/мл ТФ или без ТФ као контрола у доби од 10 и 40 дана. Слике клизача средњег црева су снимљене флуоресцентном микроскопијом за ГФП сигнале (Г). Статистичка анализа која показује проценте ГФП-позитивних ћелија приказана је у (Х).

(И) Сакупљена су црева од наведених женки мува и подвргнута тестовима имунолошког бојења који користе антитела против фосфорилисаног хистона 3(пХ3). Статистички резултати који квантификују пХ3-позитивне ћелије по цреву су анализирани и приказани. У Б, Ц, Х и, подаци су анализирани двостраним Студентовим тестом и приказани су као средња вредност ± СЕМ.НС, није значајно,*п<><0.001. see="" also="" figure="">

Познато је да ЕТФ-ови имају горак укус, а горку храну обично избегавају оба потрошача, укључујући воћне мушице и сисаре (Иамазаки ет ал., 2014; Ианг ет ал., 2018). Затим смо покушали да разјаснимо да ли ТФ могу утицати на унос хране Дросопхиле, јер су претходне студије доказале да ограничење у исхрани доводи до продуженог животног века и код кичмењака и код бескичмењака (Худри ет ал., 2019; Капахи ет ал., 2017; Могер-Реисцхер ет ал. ., 2020). Да бисмо то урадили, прво смо извршили цафе тест, широко коришћен приступ за директно и прецизно мерење брзине храњења коришћењем капиларног хранилице који садржи течни медијум, као што је претходно описано (Ја ет ал., 2007). Као што је приказано на сликама 1Ц и С1Ц, додатак исхрани ТФ (1 мг/мЛ и 2,5 мг/мЛ, респективно) једва да је променио потрошњу хране тестираних мува. Да бисмо ово додатно потврдили, затим смо користили флуоресцеин као траг за храну (Рера ет ал., 2012; Ванг ет ал., 2005) и извршили тест природног храњења (Данилов ет ал., 2015). Као што је приказано на сликама 1Д и С1Д, нисмо успели да уочимо било какву корелацију између суплементације ТФ и нивоа уноса хране. Узети заједно, наши резултати сугеришу да корисна улога ТФ-а у продужењу животног века можда није последица ограничења у исхрани код Дросопхиле.

Додатни ТФ су неопходни за утицај на енергетску хомеостазу Дросопхила

Предложено је да полифеноли црног чаја имају позитиван ефекат на превенцију гојазности тако што инхибирају варење, апсорпцију и унос липида и сахарида, смањујући на тај начин унос калорија (Цамерон ет ал., 2008). Затим смо покушали да разјаснимо да ли је продужење животног века ЛДросопхиле регулисано ТФс последица промена у апсорпцији хранљивих материја и складиштењу енергије. Да бисмо то урадили, прво смо испитали нивое триацилглицерида (ТАГ), једног од најчешће откривених метаболита липида (Теннессен ет ал., 2014), код женки мува током целог живота, као што је претходно описано (Фан ет ал., 2017).купити цистанцхеКао што је приказано на слици 1Е, третман ТФ-а тешко је утицао на укупну количину ТАГ-а у различитим старосним тачкама. Када смо даље детектовали садржај гликогена и квантификовали циркулишуће угљене хидрате (глукозу и трехалозу) помоћу хексокиназног комплета (Ли ет ал., 2018; Тен-нессен ет ал., 2014), резултати су показали да није било очигледних промена између узорака са или без третмана ТФ (Слике 1Ф-1Х). Треба напоменути да су конзистентни резултати добијени када смо испитали метаболичке фенотипове користећи мужјаке в118 као животињске моделе (слике С1Е-С1Х). Заједно, ови подаци сугеришу да је додатак исхрани ТФ-а неопходан за регулацију хомеостазе угљених хидрата и енергије током животног века Дросопхиле.

Даље смо истражили кинетику природног старења Дросопхиле под интервенцијом дијеталних ТФ-а извођењем брзих итеративних тестова негативне геотаксије (РИНГ) као што је претходно описано (Диллиане ет ал., 2017; Стаатс ет ал., 2018). Као што је приказано на сликама 1л, 1Ј, С1л и С1Ј, индекси пењања старијих (40 дана) в1118 (и за жене и за мушкарце) у групама са суплементацијом ТФ су значајно побољшани (скоро 12 процената повећања код жена и скоро 18 процената пораста код мушкараца ) у поређењу са контролним групама, што сугерише да ТФ потенцијално побољшавају пењање и локомоторне активности Дросопхиле.

Теафлавини спречавају цурење црева у годинама и дисбиозу микробиоте

Претходне студије су показале да су локомоторне активности воћне мушице и животни век у великој мери повезани са здравственим стањем домаћина, као што су пол, исхрана, старост и генотип (Царусо ет ал., 2013; Хеинтз и Маир, 2014). Недавно је неколико линија доказа доказало да очување интестиналне Имд сигналне хомеостазе побољшава интегритет црева спречавањем прекомерне пролиферације ИСЦ и ћелија прекурсора и одлагањем дисфункције цревног епитела са почетком старења, што заузврат позитивно доприноси здрављу организма (Цларк ет ал. , 2015; Гуо ет ал., 2014). Код Дросопхиле, скраћени животни век је уско повезан са дисфункцијом епителне баријере црева, а развој интегритета ове баријере током старења резултира продужењем животног века (Цларк ет ал., 2015; Гуоет ал., 2014; Јет ал., 2019). Стога смо покушали да утврдимо да ли ТФ мењају интегритет црева извођењем Смурф теста, методе која је претходно описана (Цларк ет ал., 2015; Рера ет ал., 2011). Као што је приказано на слици 2А, тестиране воћне мушице код којих су плаве боје биле ограничене на дигестивни тракт називане су не-штрумпфовима (лева плоча на слици 2А). Ако би се посматрале плаве боје

Слика 3. Наставак

(ЕГ) Утробе су изоловане из женских датотека в1118 које су храњене са 2,5 мг/мл ТФ-а или без ТФ-а као базалне старости 10 дана, 30 дана, 40 дана и 50 дана старости, респективно. Укупна РНК је екстрахована и подвргнута аРТ-ПЦР анализама. Анализирани су и приказани нивои експресије мРНК диптерицина (Ф), атацина (Ф) и цекропина А1(Г). У ЕГ, подаци су анализирани двостраним Студентовим т-тестом и приказани као средња вредност ± СЕМ.НС, није значајно, *п<><><0.001. see="" also="" figure="">

који су исцурили из црева у стомак, домаћини су рачунати као Штрумпфови (десни панел на слици 2А). У складу са претходним налазима (Цларк ет ал., 2015), пропорције Штрумпфа се постепено повећавале током старења (Слика 2Б). Занимљиво је да су пропорције одраслих Штрумпфова у великој мери смањене у групама које су храњене ТФ у поређењу са контролама које одговарају узрасту код обе жене (са 8,2 одсто на 3,7 одсто, са 19,4 одсто на 15,6 одсто и са 35,4 одсто на 27,1 одсто за групе у доби од 30 дана, 40 дана, односно 50 дана, Слика 2Б) и одрасли мушкарци (од 2,7 процената до 0,9 процената, од 6,9 процената до 0,9 процената и од 8,3 процената до 2,7 процената у доби од 30 година дана, 40 дана и 50 дана, респективно, слика С2А), што указује да ТФ могу спречити дисфункцију цревне баријере код старих воћних мушица. Треба напоменути да смо приметили веће смањење процента Штрумпфова код мушкараца (смањен за скоро 65,8 процената, 86,9 процената и 67,4 процената у доби од 30 дана, 40 дана и 50 дана, респективно) од оних у годинама -подударне женке (смањено за скоро 54,1 процената, 19,5 процената и 23,3 процената у доби од 30 дана, 40 дана и 50 дана, респективно), што имплицира да би ТФ могли играти бољу улогу у смањењу цревног цурења код мушких мува.

Претходне студије су сугерисале да је дисфункција цревне баријере која почиње са узрастом често у корелацији са дисбиозом цревне микробиоте (Цларк ет ал., 2015; Гуо ет ал., 2014). Стога смо испитали цревни комензални бактеријски састав након додавања ТФ. Прво смо користили универзалне прајмере и извели квантитативне ПЦР експерименте да бисмо квантификовали нивое бактеријског 16С рРНА гена. Као што је приказано на слици 2Ц, код старијих резова, укупна бактеријска популација из интервентних група ТФ је показала упадљиво смањење (скоро 45 процената -55 процената) у поређењу са контролама, што сугерише да суплементација ТФ вероватно спречава ширење микробиоте током старења . Затим смо извршили метагеномику да бисмо детаљно испитали промене у цревној микробној заједници изазване суплементацијом исхраном са ТФ. Као што је приказано на сликама 2Д-2Ф, удео гамапротеобактерија, за чије је ширење установљено да је уско повезано са неуспехом цревне баријере (Цларк ет ал., 2015), очигледно је смањен суплементацијом ТФ у старим цревима ( смањење од скоро 7 процената), што имплицира да ТФ позитивно доприносе хомеостази цревне микробиоте током старења код Дросопхиле.

Теафлавини побољшавају интестиналну пролиферативну хомеостазу код Дросопхила

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>ГФП), у којој су цревне матичне ћелије (ИСЦ) и прогениторне ћелије обележене ГФП-ом. Као што је приказано на сликама 2Г и 2Х, број ГФП-позитивних ћелија у интервентним групама ТФс у доби од 40 дана (избројано је 20 црева) био је много мањи (скоро 29,7 процената) од оног у контролама које одговарају узрасту (скоро 47,6 процената и Пребројано је 19 црева), што сугерише да би ТФ могли инхибирати претерану пролиферацију ИСЦ-а у узрасту. Штавише, извели смо експерименте имунобојења користећи антитела против фосфо-хистона 3 (пХ3), специфичног маркера за митотичке ћелије у ткивима црева. Приметили смо мање пХ3-позитивних ћелија у цревима код старијих одраслих особа које су узимале ТФс (средњи број је био 20,6) него код оних из контроле (средњи број је био 39,5, слика 2). Узети заједно, наши резултати сугеришу да суплементација исхрани са ТФ побољшава цревну пролиферативну хомеостазу и спречава дисплазију микробиоте са почетком старења, чиме се одлаже старење код дрозофиле.

Теафлавини негативно модулирају интестиналне Имд сигнале

Да бисмо истражили основне молекуларне механизме помоћу којих ТФ позитивно доприносе хомеостази црева Дросопхиле, извршили смо РНА-сек анализу користећи цревне узорке одговарајућих узраста од одраслих жена в1118 лечених са или без ТФ. Анализа фрагмената по килобази на милион (ФПКМ) сугерише да су укупни обрасци експресије гена слични између две експерименталне групе (Слика 3А). Даља анализа диференцијалне експресије, међутим, идентификовала је укупно 229 различито експримираних гена, од којих је 99 било појачано, а 126 смањено (Слика 3Б). Занимљиво је да је анализа генске онтологије ових гена открила да је пут имуног одговора био веома измењен суплементацијом исхраном са ТФ (слика 3Ц).

Код Дросопхиле, доказано је да урођени имунолошки сигнални путеви играју доминантну улогу у регулисању цревне хомеостазе и дуговечности (Цларк ет ал, 2015; Гуо ет ал, 2014). Затим смо се фокусирали на испитивање образаца експресије антимикробних пептида (АМП) низводно од урођених имунолошких сигнала. Као што је приказано

Слика 4. Наставак

(Д) Пречишћени Имд протеини су инкубирани са различитим концентрацијама ТФ (50 уМ, 100 уМ и 200 уМ, респективно) на собној температури током 5 минута. Узорци су затим подвргнути анализи спектра флуоресценције коришћењем назначених таласних дужина (ексцитација на 430 нм, емисија од 450 нм до 550 нм са ширином прореза од 5 нм). Узорак без ТФ је коришћен као основна контрола.

（E and F）Lysates of guts from NP11>Миц-Имд мушице су припремљене и инкубиране са ТФс (100 μМ) на собној температури током 30 минута. СДД-АГЕ (горњи панел у Е) и СДС-ПАГЕ (доњи панел у Е) тестови су изведени за анализу агрегата Имд протеина. Тубулин је коришћен као контрола оптерећења.цистанцхДензитометријска анализа је извршена да би се квантификовали Имд кондензати у различитим узорцима, а резултати су приказани у (Ф). (Г) Репрезентативни хроматограм узорка ТФ.

(Х и И) Пречишћени Флаг-Имд протеини су инкубирани са ТФ, ТФ1, ТФ2а, ТФ2б или ТФ3 (100 μМ за сваки узорак) или са једнаком запремином пуфера (контрола) на собној температури током 30 минута како је назначено. Узорци су затим подвргнути СДД-АГЕ (горњи панел у Х) и СДС-ПАГЕ (доњи панел у Х) тестовима да би се одредили обрасци агрегације Имд. Извршена је дензитометријска анализа за квантификацију Имд кондензата у различитим узорцима и приказана у (). У Ц, Ф и И, подаци су анализирани двостраним Студентовим тестом и приказани као средња вредност ± СЕМ.***п< 0.001.="" see="" also="" figure="">

на слици 3Д, АМП гени управљани путем имунодефицијенције (Имд), укључујући диптерицин А (ДптА), дип-терицин Б (ДптБ), атацин А (АттА), цекропин А1 (ЦецА1), цекропин А2 (ЦецА2) и цецропин Ц (Цеце), су значајно смањени (за 39,4 процената, 72,3 процената, 10,5 процената, 86,5 процената, 99,8 процената и 36,1 процената, респективно) у групама које су третиране ТФс у поређењу са контролним групама. Да бисмо даље потврдили резултате добијене РНА-сек анализом, извели смо квантитативну ланчану реакцију реверзне транскрипције-полимеразе (гРТ-ПЦР) да бисмо квантификовали релативне нивое експресије АМП гена повезаних са Имд у узорцима црева Дросопхила добијеним у четири различите старосне тачке. укључујући 10 дана, 30 дана, 40 дана и 50 дана. Као што је приказано на сликама 3Е-3Г, нивои експресије мРНА одређених гена, укључујући диптерицин, атацин и цекропин А1, су значајно смањени (за скоро 35,9 процената -66.6 процената) код третираних ТФс остарела црева. Заједно, наши подаци су открили да ТФ потенцијално антагонизују активацију Имд сигналног пута у ћелијама црева Дросопхила током старења.

Теафлавини су неопходни за регулацију транскрипције Имд пута или убиквитинацију Имд-а

Покушали смо да испитамо повезаност између ТФ-а и Имд-а и извели смо тест површинске плазмонске резонанце (СПР) као што је претходно описано (Лан ет ал., 2020). Као што је приказано на слици 4А. ТФ-ови су показали умерени афинитет везивања са пречишћеним Имд протеином при процењеној Кп константи од 8,078 уМ. Затим тежимо да одредимо како ТФ контролишу интестинални Имд сигнални пут. На основу резултата анализе транскриптома из РНА-сек података, открили смо да нивои експресије кључних регулаторних фактора у сигналном путу Имд, као што су ПГРП-ЛЦ, Имд и Релисх, једва да су промењени третманом ТФс (слика С3А ). Даље смо прикупили узорке црева од мува које су биле подвргнуте додатку исхрани са или без ТФ-а у различитим узрастима и извели кРТ-ПЦР експерименте да бисмо специфично открили обрасце експресије ових гена. Као што је приказано на слици С3Б, нивои мРНА одређених гена, укључујући еффете, фадед, так1, пгрп-Ица, уев1а, бендлесс, релисх, имд, пгрп-сц2, таб2, ирд5 Кенни и диап2, били су слични између контролних група и интервентне групе ТФ-а, што сугерише да ТФ-ови нису укључени у регулисање Имд сигнала на нивоу транскрипције.

Затим смо испитали профиле убиквитинације Имд-а јер су претходне студије сугерисале да је убигуитинација Имд-а од суштинског значаја за низводну трансдукцију сигнала у Имд путу (Миллимаки ет ал., 2014; Зхоу ет ал., 2005). Прво смо извршили ин витро тест промене Е1 и открили да третман са ТФ нема очигледан утицај на ензимске реакције Е1 и убиквитина да формирају коњуговани Е1/Уб (слика С4А). Штавише, трансфектовали смо ћелије Дросопхила С2 плазмидима који експримирају Имд са ознаком Флаг заједно са Уб означеним са ХА, а затим третирали ћелије са или без ТФ. Даљи тестови убиквитинације сугеришу да суплементација ТФс једва утиче на нивое убиквитинираног Имд у култивисаним ћелијама (Слике С4Б и С4Ц). Да бисмо утврдили односе између ТФ-а и убиквитинације Имд ин виво, користили смо трансгену муву П {НП1-Гал4}/П{Уасп-Миц-Имд};П{Туб-Гал80*} (названу НП1* с > Миц-Имд), у којој је Имд протеин означен са Миц био високо експримиран у ћелијама црева (слика С4Д). Наши експерименти са убиквитинацијом су показали да је додатак исхрани са ТФ неопходан за модулацију убиквитинације Имд у ткивима црева (слике С4Д и С4Е). Узети заједно, наши резултати су показали да ТФ негативно управљају Дросопхила Имд сигналима тако што не утичу на образац убиквитинације Имд-а.

Теафлавини спречавају склапање кондензата Имд

Недавна студија сугерише да је агрегација Имд-а од суштинског значаја за активацију низводних гена у Имд путу (Клеино ет ал., 2017). Затим смо покушали да испитамо да ли ТФ регулишу процес

Слика 5. Наставак

(Ф и Г) Женке в18 (који се називају имд плус / плус), имд' хетерозиготни и хомозиготни мутанти (који се називају имд плус /- и имд-/-, респективно) узгајани су стандардном храном за Дросопхила (названом Басал) или дијететски суплемент са 2,5 мг/мЛ (који се назива ТФ) и затим су подвргнути тесту животног века. Крива преживљавања (Ф) и средња дуговечност (Г) су анализирани и приказани.

У и Ф, за статистичку анализу је коришћен тест Лог Ранк. У БЕ, и, двострани Студентов т-тест је коришћен за статистичку анализу, а подаци су сх као средња вредност ± СЕМ. НС, није значајно, *стр<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

Имд формирање агрегата. Прво смо пречистили Миц-означене Имд протеине из култивисаних С2 ћелија и инкубирали протеине са различитим концентрацијама ТФ (слика 4Б). Занимљиво је да смо открили да су ТФ значајно спречили агрегацију Имд (смањено за 81,7 процената -89, 7 процената, слике 4Б и 4Ц), као што сугеришу наши тестови електрофорезе у агарозном гелу са полу-детерџентима (СДД-АГЕ). Да бисмо потврдили овај налаз, даље смо извршили тестове везивања тиофлавина-Т и добили конзистентне резултате (Слика 4Д). На крају, подигли смо НП1тс > Миц-Имд трансгене мушице које су биле подвргнуте додатку исхрани са или без ТФ и сакупили узорке црева од старијих одраслих особа. Експерименти СДД-АГЕ сугеришу да је агрегација Имд у великој мери смањена ТФ у цревним ћелијама (смањена за 16,7 процената -22 процената, слике 4Е и 4Ф).

Да бисмо утврдили како ТФ доприносе контроли склопа кондензата Имд, подвргли смо ТФ ХПЛЦанал-изи и открили да углавном садрже четири врсте мономера (слика 4Г), наиме, теафлавин (ТФ1), теафлавин 3-О-галат ( ТФ2а), теафлавин 3'-О-галат (ТФ2б) и теафлавин 3,3'-ди-О-галат (ТФ3), који су били у складу са претходним извештајима (Ли ет ал., 2013; Такемото и Такемото, 2018) . Затим смо сваку од ових хемикалија инкубирали са пречишћеним Имдпротеином и извели СДД-АГЕ експерименте. Као што је приказано на сликама 4Х и 4л, третман свих ових ТФмономера резултирао је значајним смањењем (за 59,5 процената, 60,9 процената, 58,4 процената, 58,2 процената и 55,8 процената за ТФ, ТФ1, ТФ2а, ТФ2б и ТФ3, респективно) Имд агрегатни нивои. Заједно, наши резултати сугеришу да ТФ негативно регулишу сигнални пут Дросопхила Имд вероватно контролисањем понашања кондензата Имд.

Тхеафлавини продужавају животни век Дросопхиле на начин који зависи од Имд-а

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>плус )муве. јер је Релисх кључни фактор транскрипције одговоран за експресију Имд-низводног АМП гена (Миллимаки ет ал., 2014). Као што је приказано на Фикурес С5Ц и С5Д. додатак исхрани ТФ-а значајно је продужио животни век контролних мува, а ово продужење животног века је значајно спречено код Релисх РНАи мува. Наши подаци су заједно показали да додатак исхрани ТФ позитивно доприноси животном веку Дросопхила вероватно у зависности од интестиналних Имд сигнала.

Да бисмо видели да ли се продужење животног века од стране ТФ и даље дешава у аксенској позадини, извршили смо тестове животног века користећи в1118 женке у аксенским условима. Као што је приказано на сликама С5Е и С5Ф, додавање различитих концентрација ТФ-а (1 мг/мЛ и 2,5 мг/мЛ) тешко је утицало на однос морталитета и средњег животног века код одраслих са 18 година. Пошто услови аксенског узгоја могу у великој мери спречити обиље микробиоте, ограничавајући тако Имд сигнале у резовима (Цларке ал., 2015), наши подаци сугеришу да ТФ-ови продужавају животни век дрозофиле можда кроз модулацију урођених имуних сигнала регулисаних микробиотом црева.

Слика 6. Теафлавини ублажавају колитис изазван ДСС код ЦД-1 мишева

(А) Третман ТФ није утицао на потрошњу воде у различитим групама ЦД-1 мишева.

(БД) Примена различитих концентрација ТФ-а (1 мг/мЛ, 2,5 мг/мЛ, и 5 мг/мЛ), респективно, помоћу сонде, побољшала је скраћивање дебелог црева и повећање слезине изазвано ДСС код ЦД-1 мишева. Приказане су репрезентативне слике (Б) и статистичке анализе дебелог црева (Ц) и слезине (Д). (Е) Примена различитих концентрација ТФ-а (1 мг/мл, 2,5 мг/мл и 5 мг/мл, респективно) спречила је цурење црева изазвано ДСС код ЦД-1 мишева. (Ф и Г) Дебело црево је сакупљено од назначених група мишева. Укупна РНК је екстрахована и подвргнута кРТ-ПЦР тестовима да би се открили нивои експресије мРНК ТНФа(Ф) и ИЛ-6 (Г).

(ХЛ) Дебела црева из различитих група мишева су сакупљена уздужно и подвргнута ХЕ тестовима бојења. Узорци су прегледани микроскопски, а добијене су и приказане репрезентативне слике назначених узорака (ХЛ). Скала шипки, 40 μм. (М-К') СЕМ слике које показују микротрихоме дебелог црева из различитих назначених узорака. Скала траке, 50 ум (МК) и 4 ум (М'-К').

У ЦГ, подаци су анализирани двостраним Студентовим тестом и приказани као средња вредност ± СЕМ.НС, није значајно, *п<><><0.001. see="" also="" figure="">

Теафлавини ублажавају колитис изазван ДСС код ЦД-1 мишева

Да би се даље истражила потенцијална улога ТФ-а у одржавању цревне хомеостазе код сисара, ЦД-1 мишеви су коришћени да индукују колитис натријум-декстран сулфатом (ДСС). Мишевима су интрагастрично даване различите концентрације ТФ (1 г/Л, 2,5 г/Л или 5 а/Л) или воде као контрола током четири недеље, након чега је уследио третман са 2 процента ДСС у води за пиће током 7 дана. Да бисмо видели да ли ТФ утичу на количину ДССа за пиће у различитим групама мишева, пратили смо свакодневно пијење мишева. Као што је приказано у Фикуре6А, третман ТФ-ом је неопходан да утиче на потрошњу пића код мишева са колитисом изазваним ДСС-ом, мишеви третирани ДСС-ом су имали синдром колитиса са дијарејом и/или хематохезијом, који су спречени третманом ТФ-ом зависним од дозе (Слике С6А-С6Е).цистанцхе АустралиаШтавише, интервенција са ТФ је спасила смањење дужине дебелог црева изазвано ДСС и побољшала повећање слезине (Слике 6Б-6Д).

Затим смо користили декстран-4000-ФИТЦ (ФИТЦ-ДКС) да бисмо испитали функцију цревне баријере ових мишева. Као што је приказано на слици 6Е, мишеви из група третираних ДСС-ом показали су високу концентрацију ФИТЦ-ДКС у узорцима крви, што указује на цурење црева код ових животиња. Међутим, интервенција са ТФ значајно је спречила транспорт ФИТЦ-ДКС из органа за варење у циркулаторни систем (смањено за 56,1 процената -77.5 процената, слика 6Е). Приметно је да примена ТФ није променила пропусност црева мишева у нормалним условима (слика С6Ф). Пошто запаљење игра кључну улогу у развоју колитиса код модела миша, ми смо даље извели кРТ-ПЦР експерименте, показујући да третман ТФс значајно смањује експресију ИЛ-6 и ТНФ у цревима мишева третираних ДСС (Слике 6Ф и 6Г).

Да бисмо даље анализирали патолошке промене у дебелом цреву, урадили смо тестове бојења хематоксилин-еозином (ХЕ). Као што је приказано на сликама 6Х-6Л и С6Г-С6Ј, тешко оштећење епитела изазвано ДСС-ом је значајно побољшано третманом ТФс на начин који зависи од дозе. Снимање ових цревних узорака скенираном електронском микроскопом је даље дало конзистентне резултате (слике 6М-6К' и С6К-С6Н'). Узети заједно, наши налази су показали да ТФ играју корисну улогу у заштити функције цревне баријере и код инсеката и код сисара.

ДИСКУСИЈА

У овој студији смо истраживали физиолошке функције ТФ-а у модулацији цревне хомеостазе и дуговечности и молекуларне механизме у основи. Показали смо да дијететска суплементација са ТФ позитивно доприноси превенцији старосне дисбиозе цревне микробиоте и одлагању дисфункције епитела црева, чиме се продужава животни век Дросопхиле. Наше ин витро и ин виво механичке студије откриле су да ТФ вероватно играју негативну улогу у контроли сигналног пута Имд блокирањем спајања Имд. Штавише, открили смо да се колитис изазван ДСС може ефикасно ублажити суплементацијом ТФ код ЦД-1 мишева. Наши резултати подржавају идеју да ТФ повољно доприносе цревној хомеостази и код бескичмењака и код кичмењака.

Додатак исхрани са теафлавинима продужава животни век Дросопхиле

Конзумација чаја је популарна широм света и друга је после потрошње воде (Ротхенберг и Зханг, 2019). Бројне студије су се фокусирале на физиолошке функције често путем експерименталних и клиничких приступа (Цамерон ет ал., 2008; Ниу ет ал., 2013; Пенг ет ал., 2009; Ротхенберг и Зханг. 2019; Спиндлерет ал., 2013; Такемото и Такемото, 2018; Унно ет ал., 2020; Зхоу ет ал., 2020. Опширно је показано да чај користи здрављу снижавањем нивоа липида и ефектима против гојазности, а главна функционална једињења у чају су катехини, посебно епигалокатехин галат (ЕГЦГ) (Аббас и Винк, 2009; Модернелли ет ал., 2015; Ниу ет ал., 2013; Вагнер ет ал., 2015; Ксионг ет ал., 2018). Претходне студије су такође показале да зелени чај и црни чај може повећати здравствени век и животни век воћних мушица (Сите ал., 2011; Вагнер ет ал., 2015), црва (Феи ет ал., 2017; Ксионг ет ал., 2018) и пацова (Имран ет ал., 2018). .,2018; Ниу етал.2013), а главни регулаторни механизам је ефикасна превенција оксидативног стреса од стране ЕГЦГ преко модулације РОС сигнала.Цистанцхе предности,Међутим, остаје углавном непознато да ли ТФ, као карактеристична „златна“ једињења у црном чају, играју улогу у регулисању старења и животног века. Ова студија пружа убедљиве доказе који указују на то да је интервенција ТФ-а неопходна за утицај на унос хране, а дуготрајно узимање ТФ-а путем исхране значајно продужава животни век и мушких и женских воћних мушица. Ови налази дају смернице за даље студије о функцијама ТФ у дуговечности сисара.

Теафлавини побољшавају дисбиозу микробиоте која се јавља у узрасту и промовише хомеостазу црева. Прогресивна неравнотежа пролиферативне хомеостазе и регенеративног капацитета је обележје старења и болести које почињу са старењем (Цларк ет ал., 2015; Хеинтз и Маир, 2014; Маинард и Веинкове, Ре и др. 2012). Хронична упала је повезана са губитком хомеостазе и повећаном инциденцом рака код организама који старе (Бартке ет ал., 2019; Капахи ет ал., 2017; Ксиао ет ал., 2020). Ово је посебно значајно код баријерног епитела као што је цревни епител (Гуо ет ал., 2014; Маинард и Веинкове, 2018). Са моделом за развој дисплазије повезане са старењем у цревима која старе, показали смо да побољшање интеракција домаћина и комензала у епителу баријере старења може унапредити здравље и животни век. Користили смо бројне неинвазивне приступе за испитивање функције црева и динамике микробиоте током старења. Прво, Штрумпфов тест је показао позитивну улогу ТФ-а у регулисању дисфункције епителне баријере током старења. Затим, тест имунолошког бојења помоћу неколико трансгених мува открио је да ТФ одлажу прекомерну пролиферацију ИСЦ и промет диференцираних ћелија. Коначно, секвенцирање микробиома је сугерисало да ТФ смањују експанзију цревне комензалне микрофлоре са почетком старења. Ови резултати снажно указују да ТФ играју кључну улогу у одлагању процеса старења домаћина одржавањем хомеостазе црева.

Теафлавини ублажавају прекомерне имуне одговоре у цревима негативно регулишући Имд сигнализацију

Предложено је да се деликатна равнотежа између имунолошке функције црева и микробиоте мора одржати како би се осигурала дугорочна хомеостаза баријерног епитела (Гуо ет ал., 2014; Маинард и Веинкове, 2018). Претходне студије су такође показале да је хронична прекомерна упала у цревима повезана са дисфункцијом везаном за старење у епителу баријере и да је обележје старења (Цларк ет ал., 2015; Гуо ет ал., 2014; Ји ет ал., 2019) . Дакле, одржавање здраве комензалне популације очувањем урођене имунолошке хомеостазе у таквом епителу је обећавајући приступ унапређењу здравља и дуговечности (Бонфини ет ал., 2016; Бродерицк, 2016; Цларк ет ал., 2015). који ТФ одлажу старење, извршили смо РНА-сек анализу користећи сецирана црева са или без третмана ТФ. Наши подаци сугеришу да је група гена високо експримираних у цревима контролних воћних мушица у поређењу са оном код животиња третираних ТФс обогаћена генима класификованим као гени „имуног одговора“. Даља биоинформатичка анализа и гет-ПЦР тестови су открили да је експресија АМП гена повезаних са Имд драматично инхибирана додатком ТФ у исхрани. Резултати ЦД{14}} експеримената на мишевима који користе ДСС за изазивање абнормалних имуних одговора у цревима додатно су потврдили идеју да ТФ функционишу као заштитници против цревне инфламације.

Теафлавини потискују сигнале одређивањем амилоидног склопа Имд

Како ТФ негативно регулишу Имд сигнални пут? На основу резултата анализе транскриптома, открили смо да су ТФ-ови неопходни за регулацију транскрипције кључних фактора у Имд сигналном путу. Од интереса, приметили смо очигледан афинитет везивања ТФ-а са пречишћеним Имд протеином помоћу СПР теста, што је сугерисало вероватноћу да ТФ-ови могу играти улогу у контроли понашања протеина Имд или његовог пост-транслационог процеса модификације. Претходне студије су истакле кључну улогу убиквитинације у трансдукцији Имд сигнала (Клеино и Силверман, 2014; Миллимаки ет ал., 2014), а превенција убиквитинације Имд резултира дубоким гашењем Имд сигнализације (Миллимаки ет ал., 2014; Тхевенон ет ал., 2009). Међутим, наши тестови ин витро и ин вивоубиквитинације показали су да ТФ једва утичу на образац убиквитинације Имд. Недавна студија је показала да је формирање амилоида потребно за активацију пута Дросопхила Имд након препознавања бактеријских пептидогликана (Клеино ет ал., 2017). Занимљиво је да су наши СДД-АГЕ и ТхТбиндинг тестови сугерисали да ТФ спречавају спајање Имд-а. Превенција агрегације Имд уништавањем или мутацијом Имд у ћелијама црева очигледно је преокренула корисне ефекте ТФ-а на продужење животног века. Да бисмо додатно потврдили наше откриће, било би интересантно испитати да ли ТФ-ови више нису функционални да продуже животни век воћних летача када је очувани криптични РХИМ (цРХИМ, аминокиселине од 118. до 121. х) мотив Имд-а специфично уништен, на основу налаза да је злочин у Имд-у од суштинског значаја за његову агрегацију и формирање амилоида (Клеино ет ал., 2017). Ипак, наша студија наглашава кључну улогу ТФ-а у контроли цревне хомеостазе и процеса старења, можда кроз модулацију Имд коалесценције. Будуће студије треба да се фокусирају на истраживање које остатке или регионе Имд везују ТФ и како ово везивање доводи до превенције кондензације Имд. Штавише, наши налази у систему сисара су показали да ТФ могу ефикасно заштитити дебело црево од упале изазване егзогеном отровном хемикалијом ДСС, што сугерише очувану регулаторну улогу ТФ-а у одржавању цревне хомеостазе. Вреди истражити да ли ТФ играју улогу у управљању састављањем протеина у ткивима сисара.

Овај чланак је извучен из zhongwenxie@ahau.edu.cn