Студија хемијских профила и метаболита сирове и прерађене Цистанцхе Десертицола код пацова од стране УПЛЦ-К-ТОФ-МСЕ

Контакт имејлtina.xiang@wecistanche.comза више информација

Апстрактан

Позадина: Кинеска материа медица обрада је истакнута и јединствена фармацеутска техника у традиционалној кинеској медицини (ТЦМ) која се користи за смањење нежељених ефеката и повећање или чак промену терапеутске ефикасности сировог биља. Промене у есенцијалним компонентама изазване оптимизованим поступком прераде првенствено су одговорне за повећану ефикасност лековитог биља. Окрепљујући ефекат пиринчаног вина на париЦистанцхе десертицола(Ц.десертицола) је била јача од сирове Ц.десертицола (ЦД).

Методе: Урађена је упоредна анализа коришћењем УПЛЦ-К-ТОФ-МС' са УНИФл информатичком платформом да би се утврдио утицај обраде. Ин витро студије су спроведене за карактеризацију састојака као иметаболитиин виво. Хемијске компоненте су одређене у ЦД-у и његовим прерађеним производима. Мултиваријантне статистичке анализе су спроведене да би се процениле варијације између њих, док је ОПЛС-ДА коришћен за упаривање у пару.

Резултати: Резултати ове студије открили су значајне варијације у фенилетаноидним гликозидима (ПхГс) ииридоидипосле обраде. У екстрактима ЦД-а и његових прерађених производа откривено је укупно 97 једињења. ПхГ који имају 4-О-кафеоил групу у 8-О- -Д-глукопиранозилном делу, као што су актеозид, цистанозид Ц, кампнеозид Ил, османтузид су се смањили након обраде, док су ПхГ са 6' -О-кафеоил група у 8-О- -Д-глукопиранозилном делу, као што су изоацетозид, изоцистанозид Ц, изокампнеозид л, изомартинозид повећана, посебно у ЦД-НП групи. Повећан је и интензитет ехинакозида и цистанозида Б чија структура поседује 6'-О- -Д-глукопиранозилну групу. У ин виво студији, 10 компоненти прототипа и 44 метаболита откривено је у плазми пацова, фецесу и урину. Добијени резултати су открили да обрада доводи до значајних варијација у хемијским састојцима ЦД-а и утиче на диспозицију једињења ин виво, а метаболички процеси фазе Ⅱ су кључне каскаде сваког једињења, а већина метаболита је повезана са ехинакозидом или актеозид.

Закључци: Ово је прво глобално упоредно истраживање сировог и прерађеног ЦД-а. Ови налази доприносе нашем разумевању утицаја обраде ЦД-а и дају важне податке за будућа истраживања ефикасности.

Кључне речи: Цистанцхе десертицола, Обрада, УПЛЦ-К-ТОФ-МС5, Хемијски профили, Метаболити ин виво

Увод

Кинеска материа медица (ЦММ) обрада је показала значајну применљивост у клиничкој пракси традиционалне кинеске медицине (ТЦМ) и неколико векова се сматрала одрживим третманом. Ово је јединствена фармацеутска технологија која је изведена из теорије ТЦМ. Након обраде, идентификоване су значајне разлике у изгледу, хемијским састојцима, карактеристикама и медицинском значају свих типова ТЦМ, што је довело до претпоставке да би обрада могла побољшати ефикасност или смањити токсичне ефекте ТЦМ.

стотинама година,Цистанцхе десертицола(Роу Цонг Ронг на кинеском, ЦД) се обично користи у клиничкој пракси ТЦМ за допуну функција бубрега. Такође помаже у влажењу црева што доводи до опуштања црева [1].Цистанцхеје први пут снимљен у СхенНонгБенцаоЈинг. Обично се налази у сушним и полусушним стаништима широм Евроазије и северне Африке, укључујући Иран, Кину, Индију и Монголију [2]. Обрада ЦД-а је обављена парењем са пиринчаним вином под нормалним притиском, што је метода припреме документована у кинеској фармакопеји (Јиуцонгронг на кинеском, у даљем тексту „ЦД-НП“). А ЦД парење са пиринчаним вином под високим притиском је ефикаснији метод припреме (у даљем тексту „ЦД-ХП“) [3, 4]. Неколико студија је откривено да се фармаколошки ефекти ЦД-а разликују од његових прерађених производа [5]. ЦД може тонизирати бубрежни-јанг и опустити црева, док би након парења пиринчаним вином ефекат обнављања јанга бубрега био појачан. У нашој ранијој студији, откривено је да ЦД-НП може побољшати тонификацију бубрега и подржати јанг, и ублажити ефекат влажења црева и дефекације [6–8]. У клиничкој пракси, прерађени производи су најчешће коришћени облик.

До данас, неколико студија је анализирало хемијске компоненте ЦД-а, праћено изолацијом и идентификацијом више од 100 једињења [9–11], као што су фенилетанол гликозиди (ПхГ),иридоиди, лигнани и олигосахариди као његови главни хемијски састојци. Такође је пријављено да постоји много фармаколошких активности ПхГ укључујући имуномодулаторно, неуропротективно, хепатопротективно, антиинфламаторно, антиоксидативно, итд.[12–14]. Иридоиди поседују антиинфламаторне активности [15, 16]. Ранијим студијама је такође откривено да су неке хемијске компоненте показале варијације током обраде [17–20]. На основу ових извештаја, може се претпоставити да накнадна обрада, варијације у хемијском саставу доводе до различитих фармаколошких ефеката, које треба даље истражити.

У тренутној студији, осетљива и ефикасна метода, тј. течна хроматографија ултра високих перформанси у комбинацији са ТОФ-МСЕ (УПЛЦ-К-ТОФ-МСЕ) је урађена за компаративну анализу, а ин витро студије су спроведене да би се квалитативно анализирали екстракти. ЦД, ЦД-НП и ЦД-ХП за разјашњавање њихових хемијских профила. Генерално, егзогене хемикалије са високом изложеношћу у циљним органима сматране су ефикасним компонентама. Према томе, код пацова, ЦД и његови прерађени производи су давани орално, након чега је уследила њихова карактеризација. Постојећа студија по први пут открива компаративну студију (и ин витро и ин виво) сировог и прерађеног ЦД-а. Добијени резултати би проширили наше разумевање о ефекту обраде ЦД-а, што би могло бити од помоћи за даља истраживања.

материјали и методе

Материјали

Стандардна једињења ајугола (180120) и 2'-ацетил-ацетозида (М0601АС) обезбедила је Цхенду Пуре Цхем-Стандард Цо., Лтд (Ченгду, Кина). Цистанозид Ф(МУСТ-17022620), ехинакозид (Д1105АС), цистано-сиде А(М0906АС) и изоактеозид(М0106АС) је обезбедила компанија Муст (Сицхуан Кина); актеозид (О0618АС), салидрозид (Ј0526АС), каталпол (С0728АС), генипозид (А0407АС) и генипосидна киселина (МБ{{15}С) су набављени од Далиан Меилун Био.Цо., Лтд (Далиан, Кина).8-Епидна оксилоганска киселина (Б31123) је била добијено од Схангхаи Иуание Биологицал Тецхнологи Цо., Лтд, Кина. Метанол и ацетонитрил су били МС квалитета и добијени су од Мерцк КГаА, Дармстадт, Немачка. Метанска киселина (ЦХ, О,) ХПЛЦ разреда је обезбедила Мерцк КГаА (Дармстадт, Немачка). Вода која је коришћена у постојећој студији прерађена је преко Милли-К система (18,2 МК, Миллипоре, Ма, САД). Пиринчано вино је обезбедио Бранд Товер Схаокинг Вине Цо., Лтд. (Зхејианг, Кина).

Цистанцх десертицола је сакупљена од Неименггу вангиеди ​​цистанцхе Цо.Лтд. Узорке је идентификовао проф. Иањун Зхаи (фармацеутска школа, Универзитет Лиаонинг ТЦМ). Узорци су достављени Универзитету традиционалне кинеске медицине Лиаонинг.

Животиње

Спрагуе–Давлеи мужјаци пацова (СПФ степен) са 180–220 г укупне телесне тежине обезбедили су Лиаонинг Цхангсхенг биотецхнологи Цо. Лтд. (Лабораторијски центар за ресурсе животиња провинције Лиаонинг, број лиценце: СЦКСК-2015–0001). Ови пацови су били смештени у просторији за узгој са добро одржаваном температуром и влажношћу, тј. 20–26 степени, 50–70 процената током једне недеље. Пацови су храњени уобичајеном лабораторијском храном и водом пре експериментисања. Животиње су постиле преко ноћи, међутим, вода је давана ад либитум пре експеримента. Пацови су погубљени са 10% анестетика хлорал хидрата. Институционални комитет за етику животиња у провинцијској болници кинеске медицине Лиаонинг одобрио је све експерименталне протоколе (2019.3.25, 2019015).

Припрема екстракта ЦД-а, ЦД-НП и ЦД-ХП

ЦД-НП, ЦД-ХП су обрађени из исте серије Цистанцх десертицола. Да би се припремио ЦД-НП, суви комади ЦД-а (дебљине 5 мм, 100 г) су навлажени пиринчаним вином (30 мЛ) и кувани на пари на 100 степени током 16 х, након чега је уследило сушење на 55 степени преко сушаре. Док је ЦД-ХП припремљен инфилтрацијом сувих ЦД комада (дебљине 5 мм, 100 г) са пиринчаним вином (30 мЛ), праћено паром на 1,25 атмосферског притиска током 4 х. а затим сушена у сушници на 55 степени.

У мерну посуду од 100 мл, један грам праха је просејан кроз сито бр. 4, након чега је додато 50 процената метанола (50 мЛ), а затим је добро поклопљен и измешан. Ова смеша је измерена, а затим пола сата. мацерација. После мацерације, смеша је ултразвучна (снага 250 В, фреквенција 35 кХз) током 40 мин, након чега је уследило хлађење и поновно вагање. Губитак тежине је допуњен са 50 процената метанола, прописно помешан и остављен да стоји, након чега је уследило филтрирање супернатанта и затим коришћење добијеног филтрата као тест раствора.

МСЕ анализа активних компоненти

Припрема стандардних супстанци: тубулозид-А (3.02 мг), ехинакозид (3.00 мг), 2'-ацетилактеозид (2,34 мг), актеозид (2,45 мг), изоактеозид (0,61 мг). мг), цистанозид-Ф (2,14 мг), салидрозид (3,39 мг), гени позид (2,84 мг), ајугол (1,58 мг), катапол (2,39 мг), генипосидна киселина (2,56 мг) и 8-епидеоксилоганска киселина киселина (2,34 мг) је додата у волуметријску посуду од 10 мЛ, додата константна запремина метанола на скалу, конфигурисана у одговарајући референтни раствор концентрације. Сваки од 100 μЛ је конфигурисан у мешани референтни раствор.

Услови МС анализе: Те масена вредност је коригована пре експеримента и коришћен је режим негативних јона. Опсег масе је био 50–1200 Да, а узорак је убризгаван кроз проточну ињекциону пумпу. Брзина конуса је била 100 Л/х, брзина протока растварача је подешена на 800 Л/х. Капиларни и конусни напон су фиксирани на 2500 и 40 В, сходно томе. Температура извора јона и гаса растварача била је 100 степени и 400 степени респективно, а фреквенција аквизиције сигнала је била 0,5 С−1.

УПЛЦ-К-ТОФ-МС анализа ЦД екстракта (15–16 мин), 65 до 55 процената А (16–18 мин). Брзина протока је била 0.3 мЛ мин−1, док је температура просторије за аутоузорковање и колоне била 30 степена и 8 степени одвојено. Запремина ињекције била је 1,0 μЛ.

Масена спектрометријска евалуација је спроведена преко Ватерс КСЕВО Г{{0}}КСС КТОФ МС (Ватерс Цорпоратион, Милфорд, МА, САД), који садржи ЕСИ извор. Брзина протока азотног гаса је фиксирана на 800 Л·хрс−1 са температуром од 400 степени, температура извора је фиксирана на 100 степени, а конусни гас је подешен на 50 Л х−1. Напон конуса и капиларе је подешен на 40 и 2000 В, сходно томе. Енергија судара рампе је коришћена у опсегу од 20–30 В. Тецентроидни подаци за све узорке су добијени од 50 до 1200 Да, са 5- временом скенирања од 0,5 с током времена анализе од 10 мин. . ЛоцкСпраи ТМ је коришћен за валидацију прецизности масе. Те [М–Х]− јон леуцин енкефалина (200 пг·μЛ−1 брзина протока инфузије 10 μЛ мин−1) на м/з 554,2615 коришћен је као запорна маса. Софтвер МассЛинк В4.1 (Ватерс Цо., Милфорд, САД) је коришћен за тачну масу, састав прекурсора јона и прорачун јона фрагмената.

Анализа података у Масслинк платформи

Штавише, интерна библиотека која садржи назив једињења, његову структуру и молекулску формулу (у мол.) је постављена на основу литературе. Сва једињења су забележена у посебном шаблону, направљеном у Екцел-у. Поред тога, мол датотеке (Цхемдрав Ултра 8.0, Цам-бридге софт, САД) и Екцел датотеке свих појединачних сложених структура су такође сачуване на локалном рачунару. Успостављени Екцел лист са важним подацима директно је увезен у научну библиотеку у УНИФИ

УНИФИ 1.8.2, Ватерс, Манцхестер, УК је коришћен за процену структурних карактеристика, посебно за карактеристичне фрагменте и МС фрагментацију. Минимална површина врха од 500 је постављена за 2Д детекцију врха. Током откривања 3Д пикова, изабрани су ниски енергетски вршни интензитет од више од 300 бројева и повишени енергетски вршни интензитет од више од 80 тачака. Утврђено је да је грешка масе до ±10 ппм за позната једињења, а толеранција времена задржавања постављена је у опсегу од ±0,1 мин. Изабрали смо негативне адукте који садрже -Х, плус ХЦООХ. Обрада сирових података добијених од МС-а је обављена путем модернизованог софтвера УНИФИ да би се брзо одредиле хемијске компоненте које су испуниле стандарде са самоизграђеном базом података и интерном библиотеком традиционалне медицине.

Затим, да би се верификовала хемијска структура сваког циљног једињења, изомери су се разликовали по њиховим карактеристичним обрасцима МС фрагментације који су откривени у пријављеним студијама, и поређењем времена задржавања референтних стандарда.

Метаболомска анализа заснована на мултиваријантној статистичкој анализи

Пре обраде необрађених података, подешени су параметри, као што су маса у распону од 150 до 1200 Да, опсег времена задржавања (0 до 20 мин), гранични интензитет ( 2000 цоунтс), толеранција масе тј., 5 МДА, док су маса и временски оквир задржавања били 0,20 мин и 0,05 Да, респективно. У следећој листи базе података, идентификатор јона је био РТ-м/ парови у односу на њихова времена елуирања. Исте вредности за РТ и м/з у различитим серијама узорака сматране су истим једињењем.

Мултиваријантна статистичка анализа је спроведена да би се проценили ефикасни биомаркери који су значајно допринели варијацијама међу различитим групама. Током анализе коришћена је анализа главних компоненти (ПЦА) да би се указале на максималне разлике и препознавање образаца за добијање прегледа и класификације. ОПЛС-ДА је алатка за моделирање која обезбеђује визуализацију предиктивног учитавања компоненти ОПЛС-ДА како би се помогло у евалуацији модела. Варијабилни значај за пројекцију (ВИП) коришћен је за процену евалуације различитих компоненти, и тометаболитиwith VIP values>1.0 и П-вредност<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Експерименти на животињама пацови су насумично категорисани у четири групе (н=6 за сваку групу), након чега је уследила орална примена различитих екстраката: (1) Празна контролна група: пацовима је дат нормалан физиолошки раствор (2 мЛ/100 г) ; (2) ЦД група: пацовима је дат ЦД екстракт (2 мЛ/100 г); (3) ЦД-НП група: пацовима је дат екстракт ЦД-НП (2 мЛ/100 г); (4) ЦД-ХП група: пацовима је дат ЦД-ХП екстракт (2 мЛ/100 г). Даља категоризација свих група извршена је у три подгрупе за плазму, урин и фецес. Два сата касније, сваком пацовима је орално примењена иста и једнака количина екстракта.

Након примене, узимање узорака крви је обављено у 1.0 х, 2.0 х и 4.0 х у хепаринизованим полиетиленским епруветама од 1,5 мЛ (из орбиталних вена) , након чега је уследило центрифугирање (на 4500 рпм) свих узорака током 15 мин.

За узорке урина и фецеса, пацови су држани у кавезима за метаболизам, а затим је прикупљање узорака урина и фецеса обављено 24 сата након примене. Центрифугирање узорака урина је вршено на 4500 о/мин у трајању од 15 минута, док су узорци фецеса сушени у хладу, млевени у прах, затим је узето 0,2 г и додато у 0,5 мЛ физиолошког раствора. раствор, ултразвук 5 мин и центрифугиран на 12,000 о/мин 15 мин. Сви биоузорци су држани на -80 степени до анализе.

Припрема биолошких узорака. Додавање узорака плазме, урина и фецеса извршено је са 3 запремине метанола, након чега је уследило вортексирање током 3 мин. Затим је извршено центрифугирање (на 12,000 рпм) смеше током 10 мин, након чега је супернатант пребачен у ЕП епрувету, а затим осушен азотом на 37 степени. Поред тога, извршено је додавање 200 μЛ раствора ХЦН–Х2О (50 процената). Десет, вортекс је коришћен за мешање (1 мин), након чега је уследило центрифугирање (на 12,000 о/мин) током 5 мин. Супернатант (5 μЛ) третираних узорака је убризган у УПЛЦ-К-ТОФ-МСЕ систем.

Стање течне хроматографије и масене спектрометрије Анализа заметаболитије такође изведен од стране Ватерс УПЛЦ инструмента преко ЕСИ интерфејса. Одвајања су обављена коришћењем Ацкуити УПЛЦ ХСС Т3 колоне (100 мм×2,1 мм, 1,8 µм), мобилна фаза је била 0,1 проценат мравља киселина (А): ацетонитрил (Б), Градијент елуирања је био 0-3 мин (99,8 процената →98 процената А).3-5 мин(98 процената →95 процената А),5-8 мин(95 процената →90 процената А), { {18}} мин (90 процената →85 процената А),12-17 мин(85 процената →70 процената А), 17-22 мин (70 процената →60 процената А), 22-23 мин (60 процената →58 процената А), 23-25 мин (58 процената А), 25-32 мин (58 процената →45 процената А) и 32-37 мин (45 процената →35 процената А ),0,4 мЛ мин-1 је била брзина протока. Температура за колону и просторију за узорковање је подешена на 40 степени и 8 степени респективно. Коришћени су горе наведени услови масене спектрометрије.

За обраду података коришћена је стратегија за систематску анализу метаболита у био-узорцима УНИФИ (1.8.2). За идентификацију ефикасних метаболита коришћена је функција бинарног поређења. Процењени метаболити нису постојали у еквивалентном контролном узорку или постоје при ниским интензитетима јона. Праг релативног интензитета је постављен на 3 или 5, а метаболити који испуњавају подвучене критеријуме могли су да се процене. Уобичајени и предвидљиви метаболити су затим одређени ЕИЦ-ом. За претрагу двофазних метаболита примењена је НЛФ функција. На пример, у софтверу УНИФИ, параметри се могу подесити на 176,0321 за тражење могућих коњугата глукуронске киселине. Након обраде, неутрални губитак се може поставити у методу или идентификовати. МассФрагмент је коришћен за одређивање или карактеризацију откривених структура метаболита, УНИФИ-јева функција спектралне интерпретације је главна функција која се користи за анализу секундарне фрагментације родитељских компоненти. Ова функција се може користити за брзу верификацију путање фрагментације да ли је то разумно.

Резултати

Правило масовне фрагментације фенилетаноидних гликозида и иридоида

Фенилетаноидни гликозиди су главни хемијски састојци ЦД-а. Стандардни раствори изоактеозида,

Узимани су цистанозид Ф, тубулозид А, ехинакозид, актеозид и 2'-ацетил-актеозид, након чега је дат другачији ниво енергије судара (Табела 1), а затим су добијене одговарајуће МС2 мапе (Сл. 1).

Масена спектрометријска анализа је открила да фенилетаноидни гликозиди имају сличне обрасце фрагментације спектра масе, путеви цепања у режиму негативних јона углавном укључују (1) цепање естарске везе: губитак неутралне кафеоил групе (Ц, Х, О162.03) и неутралног ацетила група (Ц, Х, О,42.00); (2) Гликозидно цепање: губитак неутралних остатака рамнозе (Ц.ХИО, 146.05) и неутралног остатка глукозе (ЦгХО, 162.05). Из масене спектрометрије високе резолуције, могу се разликовати кофеоил (162.03) и остатак глукозе (162.05).

Узети су стандардни раствори иридоида ајугола, катапола, генипосидне киселине, генипосида и 8-епиде оксилоганске киселине, након чега су дате различите енергије судара и добијене су одговарајуће МС'мапе (слика 2).

Иридоидни гликозиди имају сличне обрасце фрагментације спектра масе, путеви цепања у режиму негативних јона углавном укључују (1) гликозидно цепање: губитак неутралног остатка глукозе (ЦХоО, 162,05); (2) губитак неутралног ЦО (43,99) и Х , О(18.01).

Идентификација једињења у екстрактима ЦД, ЦД-НП и ЦД-ХП

УПЛЦ-КТОФ-МСЕ анализа

Извршена је оптимизација хроматографских услова. Затим су једињења ЦистанцхеХерба процењена иу негативним иу позитивним јонским модовима са високим и ниским ЦЕ. Добијени резултати су открили да је компатибилност негативног модуса већа у односу на позитиван мод за ова једињења. На слици 3 приказан је хроматограм МС основног пика јона (БПИ) праћен нумерисаним пиковима. Интензитет сваког детектованог јона у УПЛЦ-К-ТОФ-МС анализи је нормализован у односу на цео број јона за генерисање матрице података која се састоји од м/з вредности, нормализоване површине пика и времена задржавања.

Евалуација компоненти са ЦД-а и његових обрађених производа на УНИФл платформи

Укупно 97 једињења је идентификовано са -СЕМ (н=6) начином из ЦД-а и његовог прерађеног производа (Табела 2), укључујући фенилетаноидне гликозиде (ПхГ), иридоиде, лигнане и олигосахариде. Компоненте 95, 91 и 94 су детектоване у ЦД, ЦД-НП и ЦД-ХП. Међу њима, 64 су били фенилетаноиди, 13 иридоиди, а утврђено је 20 других врста једињења. Постојала је сличност у хемијском саставу ЦД-а и његовог прерађеног производа, међутим, утврђено је да је количина компоненти различита између ЦД-а и његовог прерађеног производа.

Варијације у хемијским компонентама прерађених производа Софтвер Симца-П 13.0 је коришћен за анализу мултиваријантне матрице података. Пре ПЦА, све варијабле су биле средње центриране и Парето-скале, након чега је следила идентификација потенцијалних дискриминантних варијабли. У графикону ПЦА резултата, свака тачка је показала појединачни узорак. Узорци који су показали сличност у својим хемијским компонентама били су разбацани један поред другог, док су они који су показивали варијације у компонентама подељени. Као што се види на ПЦА (слика 4), група ЦД-ХП је одвојена од група ЦД и ЦД-НП.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 и П<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

На слици 8, ​​нашли смо интензитет актеозида(54), цистанозида Ц(74), кампнеозида И(43), османтузида (75) и 2'-актилактеозида(80) који имају 4'-О-кафеоил групу у 8-О- -Д-глукопиранозил део (види слику 9) се смањио након обраде пиринчаним вином, док је интензитет изоацетозида (60) кастанозид (71), изокампнозид И (69), изомартинозид (86) који има 6'-О-кафеоил групу (видети слику 9) је повећан, посебно за ЦД-НП групу. Иако тубулозид Б (72) има 6'-О-кафеоил групу, исту као и изоактеозид, интензитет је смањен због његове 2'-ацетил групе. Интензитет ехинакозида(38) и цистанозида Б који имају 6'-О- -Д-глукопиранозил групе је повећан, али је интензитет тубулозида А (55) смањен и због његове 2'-ацетил групе.

Наш истраживачки тим је такође проучавао термичку стабилност актеозида и изоактеозида и открио да је актео-страна нестабилна у води, метанолу и раствору жутог пиринчаног вина и да се може делимично претворити у изоактеозид под условима загревања. Али термостабилност изоактеозида је била боља, посебно у раствору жутог пиринчаног вина. Слика 10 је показала могуће промене ПхГс у ЦД-у током обраде:

Идентификација метаболита код пацова Из података масене спектрометрије високе резолуције анализирани су и упоређени тачна молекулска тежина и елементарни састав за метаболите и протомолекулска једињења. Како су исте врсте једињења у ТЦМ-у показале сличност у метаболичким модификацијама, корелације фитокемијских састојака ин витро могу се проширити на њихове метаболите ин виво. У међувремену, на основу конвенционалних путева биотрансформације, закључена је разумна промена молекулске тежине. Коначно, метаболити су идентификовани анализом МСЕ масеног спектра метаболита и пута фрагментације прото-једињења у спектру масе [21, 22]. У поређењу са слепим узорком, његове компоненте су идентификоване ин виво на основу информација добијених спектром масе хроматограма, могућности метаболичке реакције, карактеристикама структуре једињења и правилом фрагментације његовог масеног спектра. Видети табелу 3.

Идентификација метаболита повезаних са фенилетанол гликозидима

За обраду је коришћена УНИФИ платформа. Слика 11 приказује ТИЦ хроматограф урина, фецеса и плазме за ЦД и његове прерађене производе. У поређењу са празним узорцима, код пацова је идентификовано укупно 54 метаболита, укључујући 10 компоненти прототипа и 44 метаболита, од којих је 24, 49 и 6 било у фецесу, урину и плазми, сходно томе.

На основу тачне масе, каскаде фрагментације и предвидљивих неутралних губитака биотрансформацијом, пробно је процењено укупно 35 метаболита повезаних са фенилетаноидним гликозидима. Сродни метаболити фенилетаноидних гликозида имају сличне обрасце фрагментације спектра масе, попут типичног декафеоилног фрагмента м/з 461.1605, који се затим даље хидролизује гликозидним и естарским везама ин виво, и метаболише у хидрокситирозол (ХТ)(м/ з153.0504, Ц.ХО.4.73 мин) и кафеинске киселине(ЦА)(м/з179.0389, ЦХ, О0.77 мин), видети слику 12А.

М11 је назначено [МХ]~ на м/ 153,0504 са формулом тј, Ц.ХО, и идентификовано као ХТ. М16 је приказао [МХ]- на м/з 329,0851, што је било 176 Да повишено у односу на ХТ, откривајући да би то могао бити глукуронизовани метаболит ХТ. [МХ]-од М26 је био на м/з 343.1037,14 Да већи од оног код ХТ-глукуронида. Стога је М26 идентификован као ХТ-метиловани глукуронид. М17 је идентификован као ХТ-сулфат на основу његовог [МХ]-на м/з 233,0112,80 Да преко ХТ, који је могао бити даље метилиран, а затим произведен М22, који је показао м/з 247,0278, што указује да је ХТ- метиловани сулфатни метаболит. М7 (м/167,0335) и М5 (м/з 167,0762) су разматрани као производи оксидације и метиловани ХТ, респективно (Слика 12Б).

М1 је указивао на [МХ]- на м/з 179.0389, разјашњена молекулска формула је била ЦХ-О и идентификована као кафеинска киселина (ЦА). М25 је открио [МХ]- на м/ 355.0704, који је био повишен за 176 Да од ЦА, показује да би то могао бити глукуронидовани метаболит ЦА. М27 је имао м/з 258,994, што је било 80 Да више од ЦА, па смо га разјаснили као ЦА сулфат, и могао је да произведе М35 (м/з 273,0064). Како М4 даје [МХ]7 при м/з 193,0524,14 Да више од ЦА, идентификован је као метиловани метаболит ЦА. М39 је био метаболит дехидроксилације ЦА, са м/з 163,04, и могао је бити сулфатиран у М32 (м/з 242,9951).

М33(м/з 181.0491, Ц.ХО, 9,06 мин) је био редукциони производ ЦА, односно 3,4-дихидрокси-бензенпропионске киселине, која је могла бити метилована у М19 (м /з 195,0623, Ц10Х12О4, 0,93 мин). М33 се може дехидрирати у М43, односно 3-ХПП (м/з 165,0558, Ц9Х10О3, 11,29 мин), и М31 (м/з 341,0942, Ц15Х17О9, 8,90 мин) и М249 (м/з, 120 мин) 8,52 мин) су глукуронизовани и сулфатирани производи (слика 12Ц).

За метаболите повезане са фенилетаноидним гликозидима, кључне метаболичке каскаде биле су метаболичке реакције фазе ИИ, тј. глукуронидација, метилација и сулфатација. Предложене метаболичке каскаде фенилетаноида су приказане на слици 13.

Идентификација метаболита сродних иридоидима

Анализом елементарног састава метаболита, МСЕ фрагментације и повезане литературе, пробно је процењено укупно 19 метаболита повезаних са иридоидом. Иридоидни гликозиди су хидролизовани гликозидним везама да би се формирали њихови одговарајући агликони. М/з 185,117 је био за М8, 162 Да мање од ајугола, што је настало губитком остатка глукозе.

М40 (м/з 199,0641, Рт 10,91 мин) је био дегликозиловани производ катапола. М45 м/з 169,0487, Рт 12,15 мин) био је мањи од 30 Да од дегликозилованог метаболита катапола и идентификован је као уклањање молекула ЦХ, О метаболита. М34 (м/з 151,0352, Рт 9,08 мин), био је даљи губитак Х, О метаболита.

М44(м/з 211,0665, Рт 11,31 мин) је био дегликозиловани метаболит генипозида, а М37(м/з 197,0833, Рт 15,03 мин) је дегликозилација 8-епидеоксилоганске киселине. Метаболичке реакције за иридоиде могу се открити као фаза И метаболизма дегликозилације (слика 12Д).

Поређење метаболичког профилисања у плазми, урину и фецесу између ЦД-а и његових прерађених производа

Упоређена су 2 прототипа у плазми, 7 у урину и 3 у фецесу. Било је 7 прототипова апсорбованих у ЦД, 7 прототипова апсорбованих у ЦД-НП и 8 прототипова у ЦД-ХП. М21 је откривен само у фецесној групи ЦД-НП, а М38 и М51 су откривени само у уринским групама ЦД-ХП. У поређењу са метаболитима, идентичних метаболита у плазми, урину и фецесу било је 4, 42 и 21, респективно. Било је 34 метаболита апсорбовано у ЦД групи, 39 у ЦД-НП и 40 у ЦД-ХП групи. М5, М7, М40 и М52 су откривени само у ЦД-НП групама, док су М24, М4л и М48 тек откривени у ЦД-ХП групама.

Уочене су варијације у апсорпцији као и у метаболизму активних једињења у различитим прерађеним производима ЦД-а. Са слике 14, открили смо да је интензитет коњугације ХТ-сулфата (М17) највећи у урину, затим 3-ХПП сулфатна коњугација (М29), метилована ХТ сулфатна коњугација (М22), дехидроксиловани ЦА сулфат коњугација (М32) и 3,4-дихидрокси бензен пропионска киселина сулфат коњугација (М19). Садржај метаболичких продуката у обрађеној групи био је већи него у групи ЦД, посебно за М22, М29, М27, М16, М19, М1, М2. Њихов прекурсор 6'-О-кафеоил група у 8-О- -Д-глукопиранозилном делу, једињења, као што је хидрокситиросол, имају антитуморска, антиинфламаторна, антибактеријска, антивирусна и антифунгална својства [ 23]. Кафеинска киселина има антиинфламаторно, антиканцерогено и антивирусно дејство [24]. Био је у складу са клиничком употребом ЦД-а и његових прерађених производа.

Дискусија

ЦД је ТЦМ, а његове главне биоактивне компоненте, укључујући ПхГ, иридоиде, полисахариде, документоване су различитим истраживачким студијама. У клиничкој пракси ТКМ-а, прерађени производи ЦД-а су широко коришћени у односу на сирове. Хемијски састав ће се током обраде мењати, што може довести до промена у лековитим ефектима (Сл. 14).

ПхГ су тип фенолног једињења које карактерише -глукопиранозидна структура која носи хидрокси-фенилетил део као агликон. Ова једињења често садрже кафеинску киселину и рамнозу везану за остатак глукозе преко естарских или гликозидних веза. У тренутној студији, квалитативне анализе ЦД, ЦД-НП. и ЦД-ХП, а идентификовано је укупно 97 једињења, укључујући фенилетаноидне гликозиде (ПхГ), иридоиде итд. Добијени резултати су показали варијације у хемијском саставу пре и после обраде. Интензитет ПхГ-а који имају 4'-О-кафеоил групу у 8-О- -Д-глукопиранозилном делу, као што су актеозид, цистанозид Ц, кампнеозид ИИ, османтус-страна се смањио након обраде, док је ПхГс са

као што су изоацетозид, изоцистанозид, изокампнеозид И, изомартинозид повећан, посебно у групи ЦД-НП. Повећан је и интензитет ехинакозида и цистанозида Б чија структура поседује 6'-О- -Д-глукопиранозилну групу. ПхГс који имају 2'-ацетил групу често се смањују због реакције хидролизе током процеса, попут тубулозида Б, 2-ацетилактеозида.

Испитивање метаболита апсорбованих ин виво спроведено је након оралне примене ЦД-а и његових прерађених производа. Метаболички процеси фазе ИИ били су кључне каскаде и већина метаболита су били сулфатни, глукуронидни и метиловани коњугати. Фенилетанол гликозиди имају ниску оралну апсорпцију и искоришћеност. Тешко се апсорбују у крв и делују као прогенитори да би одиграли своју улогу након метаболичке активације ин виво. Фенилетаноиди произведени у фенилета-нолагликон, као што су хидрокситиросол (ХТ) и кафеинска киселина (ЦА) и њен дериват 3-хидроксифенилпропионска киселина (3-ХПП), ови метаболити се могу лакше апсорбовати у плазму и имати бољи лековити ефекат.

ЦД и његови прерађени производи. ХТ-сулфатна коњугација (М17) има највећи интензитет у урину, затим 3-ХПП сулфатна коњугација (М29), метилована ХТ сулфатна коњугација (М22), дехидроксилована ЦА сулфатна коњугација (М32) и 3,{{ 7}} коњугација сулфата дихидрокси бензенпропионске киселине (М19). Садржај метаболичких продуката у обрађеној групи био је већи него у групи ЦД, посебно за М22, М29, М27, М16, М19, М1, М2.

Генерално, компоненте које имају велику изложеност у циљним органима могу бити ефикасне. Ин витро је процењена и одређена довољна количина фенилетаноида и њихових деривата. Актеозид је карактеристично једињење чији се садржај смањио након прераде пиринчаним вином, а сходно томе се повећао садржај изоактеозида, изоцистанозида Ц, изокампнеозида И. Производи разградње ПхГ, као што су деривати ЦА и ХТ, могу се проценити у био-узорцима, а обрада пиринчаног вина може побољшати апсорпцију метаболита ин виво.

Закључак

У овој студији, 97 једињења је откривено у екстрактима ЦД-а и његових прерађених производа. До разградње неколико гликозида дошло је под повишеном температуром и као резултат тога, неки нови изомери и комплекси су синтетизовани. У ин виво студији, компоненте прототипа (10) и метаболити (44) су одређене или условно процењене у плазми, фецесу и урину пацова. Метаболички процеси фазе ИИ били су кључне каскаде, већина метаболита је била повезана са ехинакозидом или актеозидом, као што су ХТ, ЦА и њихови деривати 3-хидроксифенилпропионска киселина 3-ХПП. Ови метаболити се могу лакше апсорбовати у плазму и имати бољи медицински ефекат. Добијени резултати су показали да је хемијски састав ЦД-а различит и да утиче на диспозицију једињења ин витро и ин виво.

Скраћенице

ПхГс: фенилетаноидни гликозиди; ЦД: Цистанцхе десертицола; ЦММ: Кинеска Материа Медица; ТЦМ: традиционална кинеска медицина; ЦД-НП: Гистанцхе десертицола Обрађен паром са пиринчаним вином под нормалним притиском; ЦД-ХП: Цистанцхе десертицола Прерађена на пари са пиринчаним вином под високим притиском; УПЛЦ-К-ТОФ-МС: течна хроматографија ултра високих перформанси у комбинацији са ТОФ-МС; ПЦА: Анализа главних компоненти; ВИП: Променљиви значај за пројекцију;ЦА: Цаффеицацид; ХА: Хидрокситиросол.

Признања

Није применљиво.

Прилози аутора

У изради, писању рукописа учествовали су ЛЗ, ЛБН, СЈ. РЈ, ЛПП су помогли у експериментима на животињама и израдили и финализирали све слике и табеле. ЗЦ, ХИ. ИТЗ је помогао у дизајну и извођењу ове студије и прегледао рукопис. Сви аутори су прочитали и одобрили коначни рукопис.

Финансирање

Овај рад су подржале Национална фондација за природне науке Кине (Број гранта: 81874345) и Фондација за природне науке провинције Лиаонинг (Број гранта: 2020-МС-223).

Доступност података и материјала

Скупови података који су коришћени и/или анализирани током текуће студије доступни су од одговарајућег аутора на разуман захтев.

Декларације

Етичко одобрење и сагласност за учешће

Етичко одобрење за коришћење експерименталних животиња за ову студију је добијено од Комитета за медицинску етику Универзитета традиционалне кинеске медицине у Лиаонингу (број одобрења: 2018ИС(ДВ)-044-01). Све експерименталне процедуре у овој студији биле су у складу са етичким стандардима комитет медицинске етике Универзитета традиционалне кинеске медицине Лиаонинг.

Сагласност за објављивање

Није применљиво.

Такмичарски интереси

Аутори изјављују да немају сукоб интереса који треба да открију.

Детаљи о аутору

„Фармацеутски одсек, Универзитет традиционалне кинеске медицине Лиаонинг, Далиан, Лиаонинг, Кина.“ Институт за истраживање лекова Монос групе, Улан Батор 14250, Монголија.

Примљено: 31. маја 2021. Прихваћено: 17. септембра 2021. Објављено на мрежи: 28. септембра 2021.

Зхе Ли1, Лкхаасурен Риенцхиндорј2, Бонан Лиу1, Ји Схи1*, Цхао Зханг1, Иуе Хуа1, Пенгпенг Лиу1, Гуосхун Схан1 и Тианзху Јиа1

Референце

1. Кинеска фармакопејска комисија. Фармакопеја Народне Републике Кине, вол. И. Пекинг: Цхина Медицал Сциенце Пресс; 2020. п. 140.
2. Ли З, Лин Х, Гу Л, Гао Ј, Тзенг ЦМ. Херба Цистанцхе (Роу Цонг-Ронг): један од најбољих фармацеутских дарова традиционалне кинеске медицине. Фронт Пхармацол. 2016;7:41.
3. Лиу БН, Схи Ј, Зханг Ц, Ли З, Хуа И, Лиу ПП, Јиа ТЗ. Ефекти различитих метода прераде сушења за Фресх Цистанцхе десертицола на садржај његових компоненти. Ј Цхин Мед Матер. 2020;10:2414–8.
4. Лиу БН, Схи Ј, Јиа ТЗ, Лв ТТ, Ли З. Оптимизација процеса парења под високим притиском за Цистанцхес Херба. Цхин Трад Патент Мед. 2019;11:2576–80.
5. Фан ИН, Хуанг ИК, Јиа ТЗ, Ванг Ј, Ла-Сика, Схи Ј. Ефекти Цистанцхес херба пре и после обраде на функцију против старења и имунолошку функцију пацова изазваних старењем Д-галактозом. Цхин Арцх Трад Цхин Мед, 2017; 11:2882–2885.
6. Гао ИЈ, Јианг И, Даи Ф, Хан ЗЛ, Лиу ХИ, Бао З, Зханг ТМ, Ту ПФ. Студија о састојцима лаксатива у Цистанцхе десертицола ИМЦА. Модерн Цхин Мед. 2015;17(4):307–10.
7. Лиу БН, Схи Ј, Ли З, Зханг Ц, Лиу П, Иао В, Јиа Т. Студија о неуроендокрино-имуној функцији Цистанцхе десертицола и њених производа за кухање пиринчаног вина у моделу пацова изазваног глукокортикоидима. Евид Басед Цомплемент Алтернат Мед. 2020;22:5321976.
8. Гуо И, Ванг Л, Ли К, Зхао Ц, Хе П, Ма Кс. Побољшање оснажујуће функције бубрега у моделу миша помоћу Цистанцхес херба који се брзо осуши на средњој и високој температури. Ј Мед Фоод. 2019;22(12):1246–53.
9. Ванг Т, Зханг Кс, Ксие В. Цистанцхе десертицола ИЦ Ма, "Десерт гинсенг": рецензија. Ам Ј Цхин Мед. 2012;40(6):1123–41.
10. Фу З, Фан Кс, Ванг Кс, Гао Кс. Цистанцхес Херба: Преглед њене хемије, фармакологије и фармакокинетике. Ј Етхнопхармацол цол. 2018;219:233–47.
11. Леи Х, Ванг Кс, Зханг И, Цхенг Т, Ми Р, Ксу Кс, Зу Кс, Зханг В. Херба Цистанцхе (Роу Цонг Ронг): преглед њене фитохемије и фармакологије. Цхем Пхарм Булл. 2020;68(8):694–712.
12. Генг Кс, Тиан Кс, Ту П, Пу Кс. Неуропротективни ефекти ехинакозида у мишјем МПТП моделу Паркинсонове болести. Еур Ј Пхармацол. 2007;564:66–74.

13. Денг М, Зхао ЈИ, Ју КСД, Ту ПФ, Јианг И, Ли ЗБ. Заштитни ефекат тубулозида Б на апоптозу изазвану ТНФ алфа у неуронским ћелијама. Ацта Пхармацол Син. 2004;25(10):1276–84.
14. Нан ЗД, Зхао МБ, Зенг КВ, Тиан СХ, Ванг ВН, Јианг И, Ту ПФ. Анти-инфламаторни иридоиди из стабљика Цистанцхе десертицола узгајаних у пустињи Тарим. Цхин Ј Нат Мед. 2016;14(1):61–5.
15. Нан ЗД, Зенг КВ, Схи СП, Зхао МБ, Јианг И, Ту ПФ. Фенилетаноидни гликозиди са антиинфламаторним дејством из стабљика Цистанцхе десертицола узгајаних у пустињи Тарим. Фитотерапиа. 2013;89:167–74.
16. Морикава Т, Пан И, Ниномииа К, Имура К, Иуан Д, Иосхикава М, Хаиакава Т, Мураока О. Иридоидни и ациклични монотерпенски гликозиди, канканозиди Л, М, Н, О и П из Цистанцхе тубулоса. Цхем Пхарм Булл. 2010;58(10):1403–7.
17. Ли СЛ, Сонг ЈЗ, Киао ЦФ, ет ал. Нова стратегија за брзо истраживање потенцијалних хемијских маркера за дискриминацију између сировог и прерађеног Радик Рехманниае помоћу УХПЛЦ-ТОФ-МС са мултиваријантном статистичком анализом. Ј Пхарм Биомед Анал. 2010;51(4):812–23.
18. Пенг Ф, Цхен Ј, Ванг Кс, Ксу ЦК, Лиу ТН, Ксу Р. Промене нивоа фенилетаноидних гликозида, антиоксидантне активности и других особина квалитета у резовима Цистанцхе десертицола обрадом паром. Цхем Пхарм Булл. 2016;64:1024–30.
19. Ма ЗГ, Тан ИКС. Промене садржаја шест фенилетаноидних гликозида у временском периоду парења са вином у Десертливинг Цистанцхе. Цхин Трад Пат ент Мед. 2011;33(11):1951–4.
20. Пенг Ф, Ксу Р, Ванг Кс, Ксу Ц, Лиу Т, Цхен Ј. Ефекат процеса парења на квалитет цистанцхе десертицола после жетве за медицинску употребу током сушења на сунцу. Биол Пхарм Булл. 2016;39(12):2066–70.
21. Цуи К, Пан И, Зханг В, Зханг И, Рен С, Ванг Д, Ванг З, Лиу Кс, Ксиао В. Метаболити дијететских актеозида: профили, изолација, идентификација и хепатопротективни капацитети. Ј Агриц Фоод Цхем. 2018;66(11):2660–8.
22. Цуи К, Пан И, Баи Кс, Зханг В, Цхен Л, Лиу Кс. Систематска карактеризација метаболита ехинакозида и актеозида из Цистанцхе тубулоса у плазми, жучи, урину и фецесу пацова на основу УПЛЦ-ЕСИ-К-ТОФ -ГОСПОЂА. Биомед Цхроматогр. 2016;30(9):1406–15.
23. Бертелли М, Киани АК, Паолацци С, Манара Е, Курти Д, Дхули К, Бусхати В, Миертус Ј, Пангалло Д, Багливо М, Беццари Т, Мицхелини С. Хидрокситиросол: природно једињење са обећавајућим фармаколошким активностима. Ј Биотецхнол. 2020;309:29–33.
24. Тоуаибиа М, Јеан-Францоис Ј, Доирон Ј. Цафеиц Ацид, а версатиле пхармацо пхоре: ан овервиев. Мини Рев Мед Цхем. 2011;11(8):695–713.

Напомена издавача

Спрингер Натуре остаје неутралан у погледу јурисдикцијских захтева у објављеним мапама и институционалним везама.