Апоптотички ефекат полисахарида Цистанцхе на леукемију

Аутор:

ЛИ Иан,ЗХАНГ Јин,ЗХАНГ Јинг-Нан,ет ал.

унутрашња Монголија, Кина

Да би се истражио апоптотички ефекатЦистанцхе полисаццхаридес( ЦДП) на људскимакутна леукемијаћелијска линија Јуркат ћелије.МетодеМТТ тест је примењен да би се открио ефекат ЦДП на пролиферацију ћелија, Вестерн блоттинг је коришћен за откривање активације каспазе-9 и каспазе-3, а такође су тестирани и апоптотички сигнални молекули.ＲрезултатиПролиферација Т ћелија је инхибирана са 1 мг/мл и 2 мг/мл ЦДП, Апоптоза Т ћелија је индукована са 5 мг/мл ЦДП, иизрази про-каспасе-9 и про-каспасе-3 су значајно смањени. Експресије рецептора ћелијске површине ЦД45 и ЦД71 су значајно инхибиране са 5 мг/мл ЦДП, Индукована је фосфорилација ЕＲК, и ЈНК фосфорилација је била инхибирана.

Закључци

【Кључне речи】Цистанцхе полисаццхаридес; Апоптоза; Ｒецептор; каспаза-9; каспаза-3

Акутна лимфобластна леукемија (АЛЛ) је малигна клонска болест лимфног система са високим степеном хетерогености имунофенотипа. , лако се рецидив и тако даље. Тренутно, најчешће коришћене методе лечења укључују трансплантацију коштане сржи, индукциону терапију, имунотерапију, комбиновану хемотерапију, итд. Због ограничене способности већине лекова за хемотерапију да циљају и убију туморе, они могу изазвати озбиљна оштећења дигестивног система, крвног система, кардиоваскуларне и цереброваскуларне итд. Док се лечи, често је праћен великим нежељеним реакцијама, од којих су неке чак и фаталне. Како хемотерапија напредује, тело има тенденцију да развије толеранцију на лекове за хемотерапију, повећавајући ризик од рецидива болести.

Стога је потрага за високо ефикасном, ниском токсичношћу и високо циљаном терапијом леукемије или адјувантном терапијом постала фокус тренутне пажње.Цистанцхесе на монголском зове Чагангаоја. Припада породици Ледангацеае и роду Цистанцхе. Паразитира на коренима пустињског дрвећа и има репутацију „пустињског гинсенга“.

Главни активни састојци Цистанцхеа укључују фенилетаноидне гликозиде, лигнане, бетаине, стероле, амино киселине и полисахариде. Анти-инфламаторни, антивирусни, антиоксидативни, имунолошки и други ефекти.

Студије су то открилеЦистанцхе полисахарид (ЦДП),као једна од његових главних активних компоненти,има антитуморски и имуномодулаторни ефекат.Истраживачи су открили да ЦДП има значајан убијајући ефекат на ћелије леукемије К562 и ТХП-1 и сугерисали да ЦДП има одређену улогу упревенција или лечење леукемије. Поред тога, у традиционалној кинеској медицини једињење, цистанцхе, за лечење акутноглеукемија, Цистанцхетакође игра улогу као једна од важних компоненти. Међутим, специфичан механизам деловања одЦистанцхеније познато. У овом раду, изолација и пречишћавање одЦистанцхе ЦДПпроучавани су и убијајући ефекат и повезани механизам ЦДП-а на ћелијској линији хумане акутне леукемије Јуркат.

1.1 Главни реагенси и инструменти

Цистанцхе прах је купљен из Сечуана ВецистанцхеГроуп Цо, Лтд., ћелијска линија хумане акутне леукемије Јуркат је купљена од банке ћелија Шангајског института за биологију ћелије, тиазол плава (МТТ) и натријум додецил сулфат (СДС) су купљени од Беијинг Динггуо Цхангсхенг Биотецхнологи Цо., Лтд., фетални говеђи серум (ФБС) је купљен од Хангзхоу Сијикинг Биоенгинееринг Материалс Цо., Лтд., каспаза која садржи цистеин-3, каспаза-9, ЦД71, ЦД45, фосфорилирана ц-Јун амино-терминална киназа (п -ЈНК) и антитела на фосфорилисана ванћелијска сигнално регулисана киназа (п-ЕРК) купљена су од Целл Сигналинг Тецхнологи, САД, а антитела на актин су купљена од Схангхаи Бииунтиан Биотецхнологи Цо., Лтд. Електрохемија. Научна компанија Сједињених Држава, и други реагенси били су домаће аналитичке квалитете. Гел-Виев 6000 плус интелигентна радна станица за слике (производ Гуангзхоу Болутенг Биотецхнологи Цо., Лтд.), Револве ФЛ наопако флуоресцентни микроскоп (производ Ецхо Лабораториес, САД), ЕПОЦХ читач микроплоча (производ Беијинг Бо Тенг Инструмент Цо., Лтд.).

1.2 Одвајање и пречишћавање ЦДП Узмите 500 гЦистанцхе екстракт у праху, потопити у 95 одсто етанола преко ноћи, филтрирати газом, сакупити остатак филтера, кувати врелом водом на 60 степени 2 х/време, укупно 3 пута. Након завршетка, филтрати су комбиновани три пута, концентровани под сниженим притиском до 2/3 првобитне запремине, додани 3 пута запремине 95 процената етанола, и остављени да стоје на 4 степена преко ноћи. Следећег дана центрифугирати на 4 000 р/мин 10 мин, сакупити талог, уклонити протеин Севаг методом, таложити апсолутним етанолом, осушити замрзавањем да би се добио ЦДП.

1.3 Ћелијска култура Ћелијска линија хумане акутне леукемије чувана је у течном азоту у Јуркат лабораторији. Када су коришћене, ћелије су брзо добијене у воденом купатилу од 37 степени и култивисане у медијуму РПМИ1640 (који садржи 100 У/мл пеницилина и 100 У/мл стрептомицина) са 10 процената ФБС. Ћелије су култивисане у ћелијском инкубатору са 37 степени, 5 процената ЦО2, пасиране свака 2 до 3 дана, а експерименти су изведени када су ћелије ушле у фазу логаритамског раста.

1.4 МТТ експеримент Узете су Јуркат ћелије у логаритамској фази раста, центрифугиране да би се добила ћелијска пелета и избројане на 5×105 ћелија/мл. Узмите 96-плочу са ћелијском културом, инокулирајте 100 ул ћелија у сваки бунар, а затим додајте 100 ул комплетног медијума РП-МИ1640 као контролну групу; експериментална група је подељена у 3 групе, прво коришћењем медијума РПМИ1640 за припрему различитих концентрација ЦДП, а затим додавањем 100 ул медијума РП-МИ1640 у сваки бунар. ул Јуркат ћелија и 100 ул раствора ЦДП коришћени су за добијање коначне концентрације ЦДП од 1, 2 и 5 мг/мл, респективно. Свака група је постављена са 5 дупликата бунара и инкубирана у ћелијском инкубатору од 37 степени током 48 сати. Након инкубације, додајте 20 ул МТТ (концентрација основног раствора је 5 мг/мл) у сваки бунар, вратите га у ћелијски инкубатор и наставите да инкубирате 4 х и на крају додајте 100 ул од 20 процената СДС да се преко ноћи раствори формазан на 37 степени и употреби наредног дана. Апсорбанцију на 570 нм сваке групе детектовао је читач микроплоче, а стопа инхибиције различитих концентрација ЦДП-а на пролиферацију Јуркат ћелија израчуната је формулом.

1.5 Вестерн блоттинг Јуркат ћелије у логаритамској фази раста су узете и засејане у 6-плочу са густином од 2 × 105 ћелија/мл, 500 ул/бунарићу и 500 ул комплетног медијума РПМИ1640 је додато у контролу група. Поставите 3 експерименталне групе, 1, 2 и 5 мг/мл групе за третман полисахарида, ЦДП

Унапред растворено у комплетном медијуму РПМИ1640, 500 ул ћелија и 500 ул раствора ЦДП различитих концентрација је додато на плочу 6- бунара и инкубирано на 37 степени током 48 х. Након културе, ћелијске суспензије сваке групе су сакупљене, центрифугиране на 1 500 р/мин током 5 мин да би се добиле ћелијске пелете и испране два пута претходно охлађеним физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС). После испирања, свакој групи је додато 20 ул пуфера за лизу ћелија, а ћелије су лизиране на леду 30 мин. Укупни протеин је екстрахован и концентрација ћелија је подешена коришћењем Брадфордове методе. Из сваке групе је узето 20 уг протеина за електрофорезу у СДС-полиакриламидном гелу (ПАГЕ), а протеин је електропорацијом пребачен на мембрану поливинилиден флуорида (ПВДФ). Блокирано немасним млеком у праху на собној температури у трајању од 1 х, додато антитела против хумане каспазе-3 и каспазе-9 у размери разблажења 1:1 000, инкубирана на собној температури 1 х, испрано 3 пута са фосфатним Твеен пуфером (ПБСТ) шејкером (10 мин/време), додати секундарно антитело обележено пероксидазом рена (ХРП) (1:1 000), инкубирати 1 х на собној температури, испрати 3 пута са ПБСТ, исперите 1 пут са ПБС, додајте ЕЦЛ супстрат и користите. Интелигентна радна станица за слике је коришћена за снимање, а промене опсега сваке групе су упоређене да би се проучавала апоптоза Јуркат ћелија изазвана ЦДП. За детекцију протеина везаних за пут апоптозе, ћелијска култура и услови третмана ЦДП су били исти као горе. После реакције, ћелије су лизиране за квантификацију протеина. Протеин је пренет на ПВДФ мембрану помоћу СДС-ПАГЕ и електропорације. Након блокирања са обраним млеком у праху током 1 х, додата су анти-ЦД71, ЦД45, п-ЈНК и п-ЕРК антитела (1:1 000) и инкубирана на собној температури 1 х. Секундарно антитело обележено ХРП-ом (1:1 000) је инкубирано 1 х, и коначно, интелигентна радна станица за снимање је коришћена за снимање за проучавање сродних сигналних молекула апоптозе Јуркат ћелије изазване ЦДП-ом. Добијене експерименталне траке су у сивој скали са Сликом Ј (1.8.0).

Кликните овде да бисте сазнали ефекат Цистанцхеа на антитуморски и антиканцерогени ефекат

1.6 Статистичка анализа СПСС21.0 софтвер је коришћен за т-тест и анализу варијансе

2 резултата функције Цистанцхе укљученалеукемија

2.1 Ниво пролиферације ћелија

ЦДП је успешно изолован, са више од 9{{20}} процената садржаја шећера и мање од 5 процената садржаја протеина. Стопа инхибиције пролиферације ћелија у групи са 1 мг/мл ЦДП била је (19,1 ± 2,1) процената, док је она у групама са 2 мг/мл и 5 мг/мл ЦДП била (44,2 ± 5,2). ) ) проценат и ( 47, 8 ± 4, 4) проценат , што указује да ЦДП може значајно инхибирати пролиферацију Јуркат ћелија на начин који зависи од дозе. 2.2 У поређењу са контролном групом (0.62±0.04, 0.56±{{40}}.{{49 }}7), ниво апоптозе у Јуркат ћелијама третираним са 5 мг/мл ЦДП резултирао је ензимима каспазе-9 и каспазе{{30}}. Про-форм про-цаспасе-9 (0. 09 ± 0. 02) и про-цаспасе-3 ({{ 63}}. 12 ± 0. 01) су значајно смањене, а групе од 1 мг/мл и 2 мг/мл ЦДП су биле значајно мање ефикасне за про-капазу-3 у ћелијама. Садржај каспазе-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) и прокаспазе-3 (0,48±0,04, 0,44±0,05) није имао значајан ефекат, односно низак. Концентрација ЦДП није индуковала апоптозу Јуркат ћелија, али углавном инхибирају пролиферацију ћелија, као што је приказано на слици 1.

1-4: референтна група,

1 мг/мл ЦДП група, 2 мг/мл ЦДП група, 5 мг/мл ЦДП група; исто као на следећој слици

Слика 1. Ефекат ЦДП на каспазу-9 и каспазу-3 у Јуркат ћелијама

Утицај полисахарида Цистанцхе Ефекат на леукемију

2.3 Релативни нивои експресије ЦД71 и ЦД45 у контролној групи рецептора апоптозе били су 1.00±0.04, {{10}}.54± 0.{{20}}2. Група ЦДП од 5 мг/мл могла би значајно да инхибира ЦД71 (0.05±0.02). 01) и ЦД45 (0. 13 ± {{40}}. 03); Групе од 1 мг/мл и 2 мг/мл ЦДП су могле да инхибирају експресију ЦД71 (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07) до одређене мере Није било значајног ефекта на експресију ЦД45 (0,51 ±0,01, 0,48±0,02). Види слику 2.

Слика 2. Ефекат ЦДП-а на експресију рецептора на површини ћелијске мембране

2.4 Путеви повезани са апоптозом

Релативни нивои експресије п-ЈНК и п-ЕРК у референтној групи били су 1,20±0.08 и 0.21±0 .03, респективно. Група од 5 мг/мл ЦДП индуковала је апоптозу и значајно смањила ниво фосфорилације ЈНК. (0. 32 ± 0. 04), значајно је повећао ниво фосфорилације ЕРК (1,13 ± 0. 05); 1 мг/мл, 2 мг/мл ЦДП је повећао ниво фосфорилације ЈНК ( 1. 12 ± 0. 06 , 1. 06 ± 0. 06) није имао значајан ефекат, али је ипак повећао ниво фосфорилације ЕРК (0,54 ± 0,04, 0,63 ± 0,02). Види слику 3.

Слика 3. Ефекат ЦДП-а на фосфорилацију ЈНК и ЕРК

3 Дискусија

Последњих година, студије су откриле да ЦДП има одређени инхибиторни ефекат на ћелијске линије леукемије, али специфичан механизам деловања још није познат.

У процесу апоптозе, каспаза-9 је један од узводних сигналних молекула у процесу апоптозе зависне од каспазе. Након стимулације сигнала, про-капаза-9 се масовно хидролизује да би се произвела активирана форма цепане-капазе-9, која наставља да преноси апоптотичке сигнале наниже да би промовисала процес апоптозе. Каспаза-3 је молекул каспазе ефекторског типа и кључни је сигнални молекул у процесу апоптозе зависне од ћелијске каспазе. Такође постоји у облику про-ензима (про-каспазе-3) у нормалним условима. Када се активира хидролизом, производи се велика количина расцепљене каспазе. -3, он ће лизирати различите кључне протеинске молекуле у ћелијама и на крају изазвати апоптозу. ЦДП припада активним полисахаридима биолошких макромолекула и не може слободно да уђе у ћелије кроз ћелијску мембрану. Стога, ЦДП индукује апоптозу утичући на експресију и дистрибуцију рецептора на површини ћелијских мембрана Јуркат, чиме преноси сигнале у унутрашњост ћелија и на крају активира породицу каспаза. протеина, што доводи до апоптозе ћелије. Ова студија показује да ниска концентрација ЦДП не индукује апоптозу Јуркат ћелија, већ углавном инхибира пролиферацију ћелија. ЦД71, такође познат као рецептор трансферина, је трансмембрански гликопротеински рецептор типа ИИ који је укључен у апсорпцију гвожђа и регулацију раста и развоја ћелија. ЦД71 је високо изражен код пацијената са акутном леукемијом и повезан је са примарном резистенцијом на лекове, односно експресијом ЦД71. Што је већа вредност, то је лошији ефекат прве хемотерапије. Стога је ЦД71 један од маркера за помоћну дијагнозу. ЦД45 се експримује на површини свих врста леукоцита, такође познат као леукоцитни заједнички антиген. Припада трансмембранском гликопротеину типа И и уско је повезан са развојем и диференцијацијом Т ћелија. ЦД45 има различите нивое експресије и алостеричне типове код различитих типова леукемије, па се може користити као један од маркера за диференцијалну дијагнозу и имунофенотипизацију леукемије. ЦД45 моноклонско антитело се широко користи у лечењу леукемије, посебно леукемије отпорне на лекове. Фриесен ет ал. утврдили да радионуклиди

Означена ЦД45 мАб може индуковати апоптозу у ћелијским линијама леукемије отпорне на лекове активирањем протеина породице каспаза (укључујући каспазу-3, каспазу-8 и каспазу-9). ЦДП индукује апоптозу Јуркат ћелија, прво делујући на површинске рецепторе ћелијске мембране ЦД45 и ЦД71, утичући на експресију и дистрибуцију ова два, преносећи сигнале апоптозе у ћелије и на крају активирајући каспазу-9 и каспазу{{8 }}, покрећући апоптозу. Међутим, и каспаза-9 и каспаза{10}} се налазе низводно од апоптотичког пута, а узводне сигналне молекуле треба даље истражити. У овој студији, ЦДП у концентрацији од 5 мг/мл индуковао је апоптозу Јуркат ћелија док је инхибирао експресију ЦД45, која је била слична оној код моноклонског антитела ЦД45 описаног изнад. Стога, из перспективе рецептора ЦД45 и ЦД71 повезаних са апоптозом,Цистанцхеима одређени потенцијал за лечење или помоћно лечење леукемије.Системи протеин киназе активирани митогеном (МАПК) су експримирани у свим еукариотским ћелијама.

Цистанцхе таблете за побољшање имунолошког система у лечењу леукемије

То је веома важан пут преноса информација који спроводи трансдукцију сигнала екстрацелуларне стимулације у интрацелуларну и састоји се од серин/треонин протеин киназа, укључујући ЕРК, ЈНК и п38МАПК. Његова фосфорилација и дефосфорилација су прекидачи животних активности ћелије и укључени су у И регулишу процес ћелијског раста, пролиферације, диференцијације, активације и апоптозе. Ова студија сугерише да је ЈНК дефосфорилација укључена у апоптозу Т ћелија изазвану ЦДП, док је фосфорилација ЕРК укључена у два процеса у томе да ЦДП инхибира пролиферацију ћелија и индукује апоптозу.

У закључку,Цистанцхе ЦДПима цитотоксични ефекат на ћелијску линију Т-лимфоцитне леукемије Јуркат, показујући да ниске концентрације (испод 2 мг/мл) инхибирају пролиферацију ћелија, док високе концентрације (5 мг/мл) индукују апоптозу.Цистанцхе ЦДПиндукује апоптозу у Јуркат ћелијама углавном утичући и мењајући ћелије.

Експресија рецептора ЦД71 и ЦД45 повезаних са апоптозом на површини мембране преноси сигнале у унутрашњост ћелија, даље изазивајући ЕРК фосфорилацију и ЈНК дефосфорилацију, и коначно активацију каспазе-9, која заузврат активира каспазу{{4} } да изазове апоптозу.