Хронична болест бубрега повећава церебрална микрокрварење код миша и човека

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Веи Линг Лау1,2 & Ане ЦФ Нунес 1 & Витали Василевко3 & Давид Флориолли4 & Лонг Лертпанит 1 & Јавад Савој 1 & Мариа Бангасх 1 & Зхихуи Иао 1,5 & Крунал Схах6 & Самеен Накви 1 & Аннлиа Паганини-Хилл Д & Аннлиа Паганини-Хилл Д. Вазири 1 & Давид Х Цриббс3 & Марк Фисхер6,7

Примљено: 25. августа 2018. / Ревидирано: 28. јануара 2019. / Прихваћено: 22. фебруара 2019. / Објављено на мрежи: 4. маја 2019.

# Аутор(и) 2019

Цистанцхеможе олакшатиобољење бубрега

Апстрактан

Микрокрварења у мозгу су повећанахроничнабубрегаболест(ЦКД) и њихово присуство повећава ризик од когнитивног пада и можданог удара. Испитивали смо интеракцију између ЦКД и микрохеморагија у мозгу (неуропатолошки супстрат микрокрварења) на моделима мишева и ћелијске културе и проучавали прогресију оптерећења микрокрварење на серијском снимању мозга код људи. Студије на мишевима: Истражена су два модела ЦКД: тубулоинтерстицијски нефритис изазван аденином и хируршка 5/6 нефректомија. Студије ћелијске културе: бЕнд.3 ендотелне ћелије мозга миша су узгајане до конфлуенције, а интегритет монослоја је мерен након излагања 5–15 процената хуманог уремичног серума или повећане концентрације урее. Студије на људима: Прогресија микрокрварења у мозгу је процењена на серијској магнетној резонанцији код контролних, предијализних ЦКД и пацијената на дијализи. Микрохеморагије су повећане 2–2.5-пута код мишева са ЦКД независно од вишег крвног притиска у моделу нефректомије 5/6. Бојење ИгГ је повећано код ЦКД животиња, у складу са повећаном пропустљивошћу крвно-мождане баријере. Инкубација бЕнд.3 ћелија са уремичним серумом или повишеном уреом довела је до дозно-зависног пада електричног отпора транс-ендотела. Повишена уреа је изазвала поремећаје актинског цитоскелета и смањену експресију клаудина{16}}. Код људи, преваленција микрокрварења била је 50 процената у обе кохорте са ЦКД у поређењу са 10 процената у контролној групи одговарајућег узраста. Више пацијената у дијализној кохорти имало је повећана микрокрварење на МРИ праћењу након 1,5 године. ЦКД нарушава крвно-мождану баријеру и повећава микрохеморагије у мозгу код мишева и микрокрварење код људи. Повишена уреа мења актински цитоскелет и протеине чврстог споја у култивисаним ендотелним ћелијама, што сугерише да овај механизам објашњава (бар делимично) микрохеморагије и микрокрварење примећене у студијама на животињама и људима.

Кључне речи Хронична болест бубрега. Мицроблеедс. Модел миша. Култура ендотелних ћелија. МРИ мозга

да се ослободихроничнабубрегаболест сацистанцхе

Увод

Једно од најзначајнијих неуролошких открића можданог удара последњих година је појавахроничнабубрегаболестда имају утицај који превазилази традиционалне факторе ризика као што су хипертензија и дијабетес [10, 11]. С обзиром на високу преваленцију (око 50 процената) церебралних микрокрварења и когнитивних оштећења код пацијената са узнапредовалом ЦКД [2–4, 6, 7], овај однос заслужује даље проучавање.

Церебрална микрокрварења су мала жаришта хемосидерин–гвожђа која се могу доказати на магнетној резонанцији (МРИ), за које се верује да одражавају основне церебралне микрохеморагије [12, 13] и указују на повећан ризик од можданог удара, како хеморагијског тако и исхемијског [9, 14]. Специфичне МРИ секвенце (градијентни ехо и сликање пондерисано осетљивошћу) демонстрирају ове жаришне области губитка сигнала у паренхима мозга чија је величина мања или једнака 10 мм [12, 15]. Церебрална микрокрварење зависе од старости, са преваленцијом која се приближава 20 процената до 65. године [16]. Поред старости, хипертензија и церебрална амилоидна ангиопатија су најбоље описани фактори ризика за настанак микрокрварења [13, 17]. У касној фази ЦКД, микрокрварење је присутно у до 50 процената популације [2–4].

Истовремено, когнитивно оштећење је и чешће и теже на нижим нивоимабубрегафункција[18], достижући преваленцију од 30–70 процената код хроничних пацијената на дијализи [6, 7]. У анализи попречног пресека 338 пацијената на хемодијализи старости 55 година и више са контролном скупином која одговара узрасту, 34 процента пацијената на дијализи имало је тешко когнитивно оштећење у поређењу са 12 процената контрола [6]. Још 35 процената дијализне кохорте имало је умерено когнитивно оштећење [6].

Неколико студија у кохортама без ЦКД показало је снажну повезаност између церебралних микрокрварења и опадања когнитивне функције [19–22]. Епидемиолошки подаци подржавају коегзистенцију МРИ микрокрварења и когнитивне дисфункције код пацијената у завршној фази бубрежне болести (ЕСРД) [8, 23]. Штавише, недавни извештај о 28 пацијената на хроничној дијализи са серијском магнетном резонанцу мозга показао је повезаност између нових микрокрварења и опадања резултата испитивања мини-менталног стања (ММСЕ) [4]. Даље, пацијенти са ЕСРД-ом имају 3- до 4-пут већу стопу инциденције и исхемијског и хеморагијског можданог удара у поређењу са општом популацијом [5]. У кохорти јапанских пацијената на хемодијализи који су на почетку били без можданог удара, присуство церебралних микрокрварења је било независни предиктор интрацеребралног крварења током периода праћења од 5- године [9].

Овде извештавамо о резултатима студија на мишевима и код пацијената са ЦКД. Пронашли смо повећане микрохеморагије у мозгу код мишева са ЦКД и описали оштећени ендотелни чврсти спој и поремећај цитоскелета актина као потенцијалне механизме за формирање микрохеморагије у миљеу ЦКД. Ретроспективна анализа серијске магнетне резонанце мозга код испитаника који нису са ЦКД, пре дијализе и хроничне хемодијализе потврдила је ЕСРД као значајан фактор ризика за прогресију терета микрокрварења.

Методе

Експерименти на мишевима

Експерименталне животиње и групе за третман

Истражена су два модела миша са ЦКД. (1) Модел аденин тубулоинтерстицијалног нефритиса: Мушки мишеви Ц57БЛ/6Ј из Јацксон Лабораториес (Бар Харбор, МЕ) старости 10– 12 недеља храњени су исхраном која је садржала 0,2 процента аденина током 18 дана да би изазвала хроничну интерстицијалну нефропатију, смештена поново на редовну храну током 2 недеље, а затим поново изложен аденинској исхрани током 1 недеље да би се одржала ЦКД (слика 1а). Контролни мишеви су одржавани на редовној храни. (2) Модел нефректомије 5/6: Мушки мишеви Ц57БЛ/6Ј стари 10 недеља подвргнути су двостепеној операцији у Јацксон Лабораториес која је укључивала леву делимичну нефректомију праћену десном тоталном нефректомијом недељу дана касније. Животиње су достављене у лабораторију недељу дана након

друга операција. Ова два модела су коришћена за одређивање ефекта хипертензије; хипертензија је обележје модела нефректомије 5/6, док аденин-ЦКД није хипертензивна [24].

Животиње са ЦКД су рандомизиране без ињекција липополисахарида (ЛПС) или ЛПС. (У пилот студијама, утврдили смо да је потребно дуже трајање уремије да би се открио већи терет спонтаних микрохеморагија код нелечених животиња са ЦКД; мишеви на аденинској исхрани само 10 дана након првих 18 дана изложеност је имала 3.0 ± 0,4 микрохеморагије по цм2.)

Пет недеља након почетне индукције ЦКД и у еквивалентном узрасту у контролама, мишевима су дате интраперитонеалне (ип) ЛПС ињекције (Салмонелла ентерица серотип Типхимуриум, Л{{0}} МГ, Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО ) да изазове микрокрварење у мозгу. ЛПС је примењен у три дозе, 1 мг/кг на 0, 6 и 24 х [25]. Мишевима третираним ЛПС-ом је дата хидратација поткожним ињекцијама физиолошког раствора два до три пута дневно током 3 дана након третмана ЛПС-ом. Крвни притисак (БП) је мерен 2 дана пре ињекције ЛПС-а путем плетизмографије репне манжетне (ЦОДА-С2 вишеканални, Кент Сциентифиц). Све експерименте је одобрио Универзитет Калифорније, Ирвине Институтионал Анимал Царе, анд Усе Цоммиттее.

Берба ткива и хемије крви

Мишеви су еутаназирани 1 недељу након ињекција ЛПС-а или у еквивалентној старости код нетретираних животиња екскрвављењем коришћењем срчане пункције под инхалационом анестезијом изофлураном. Игла за мерење 26- је коришћена као канила и убачена у леву комору, а ледено хладан раствор ПБС је примењен при брзини протока од 7–8 мл/мин. После

перфузијом током 5 минута, лева хемисфера мозга је брзо замрзнута за Вестерн блот. Десна хемисфера мозга и оба бубрега су фиксирани преко ноћи у 4 процента параформалдехида, а затим ускладиштени у хладном ПБС-у пре сечења. Серум је аликвот за хемију крви. Азот уреје у крви (БУН) је мерен коришћењем колориметријског комплета компаније БиоАссаи Системс (Хаивард, ЦА). Креатинин у серуму је мерен капиларном електрофорезом у О'Бриен Киднеи Ресеарцх Цоре Центру (УТ Соутхвестерн, Даллас, ТКС).

Детекција микрохеморагије

Мозгови су постављени у 1,5% агарозе и пресечени вибратомом да би се добили коронални пресеци (40 μм). Сваки 5. пресек је сакупљен за бојење пруском плавом да би се откриле микрохеморагије [26]. Бојење пруском плавом бојом изведено је коришћењем свеже припремљеног 5% калијум хексацијаноферата-три хидрата и 10% хлороводоничне киселине. Двадесет минута касније, делови су испрани у води и обојени нуклеарном брзом црвеном бојом, дехидрирани и прекрижени. Микрохеморагије су идентификоване при увећању × 20 јер су љубичасто-плаве наслаге избројане са три ињекције дате на 0,6 и 24х. Субкутана хидратација физиолошким раствором је давана 3 дана након ињекција ЛПС. Крвни притисак репа (БП) је мерен пре ињекције ЛПС. Мишеви су жртвовани 1 недељу након ЛПС ињекција. б Репрезентативни Х&Е обојени пресеци бубрега који демонстрирају аденин-индуковану тубулоинтерстицијску повреду ЦКД мишева (десни панел) у поређењу са нормалним бубрезима из ЦТЛ животиње (леви панел), × 20 увећање. Скала бар=100 μм

независни посматрачи, а затим је израчуната средња вредност. Слике посматраних позитивно обојених делова снимљене су фотомикроскопом (Никон Ецлипсе, Јапан) за три животиње по групи да би се израчунала површина микрохеморагија. Целе слике слајдова су скениране и коришћен је бесплатни софтвер ИмагеЈ (верзија 10.2) Националног института за здравље (ввв.имагеј.них.гов/иј/).

израчунајте укупну површину мозга. Број микрохеморагија је нормализован на укупну површину мозга по животињи.

Вестерн блоттинг

Хемисфере мозга за анализу протеина су брзо замрзнуте у време сакупљања ткива и хомогенизоване у ледено хладном реагенсу за екстракцију ткива И (Тхермо Фисхер Сциентифиц) допуњеном коктелом инхибитора протеазе (Роцхе Апплиед Сциенце, Индианаполис, ИН). Концентрације протеина су мерене помоћу комплета за анализу БЦА протеина (Тхермо Фисхер Сциентифиц). СДС-ПАГЕ гел електрофореза је урађена са 100 уг протеина по узорку. Протеини су пребачени на ПВДФ мембране и затим блокирани за

1 х у 5% немасног сувог обраног млека припремљеног у ТБС-Т пуферу (10 мМ Трис–ХЦл, 150 мМ НаЦл и 0,1 проценат Твеен-20) ​​и инкубирано са примарним антителима усмереним на клаудин -5 (разблажен 1:200, Сигма-Алдрицх САБ4502981), оклудин (разблажен 1:200, Инвитроген 711500, Тхермо Фисхер Сциентифиц) и нормализован на ГАПДХ интерну контролу (разблажен 1:10,000, Абцам, Цамбридге, МА) у 5% немасног млека ТБС-Т преко ноћи на 4 степена. Мрље су затим инкубиране са одговарајућим анти-зечјим или антимишјим секундарним антителима током 2 х на собној температури. Након испирања са ТБС-Т, траке су детектоване коришћењем Луминесцентног анализатора слике ЛАС-3000 (Фујифилм Лифе Сциенце, Стамфорд, ЦТ).

Имунохистоцхемистри

Да би се открило цурење крвно-мождане баријере (БББ), секције су инкубиране са биотинилованим анти-мишјим ИгГ секундарним антителом у 1:100 током 1 х на собној температури (Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, Калифорнија, САД). Након испирања са ПБС, секције су инкубиране 30 минута са комплексом авидин-биотин-пероксидаза (Вецтор Лабораториес) у разблажењу од 1:200. Бојење је развијено коришћењем 3′,3′-диаминобензидина (ДАБ, Вецтор Лабораториес) као хромогена. Проценат површине обојене ИгГ је анализиран коришћењем софтвера ИмагеЈ у мозгу који није ЛПС ЦТЛ и ЦКД. Праг за позитивно бојење ИгГ изабран је ручном проценом контролне животиње за бојење ИгГ, а овај праг је затим остао једнак за све укључене животиње [27].

Цистанцхе десертицола спречава болест бубрега

Експерименти са ћелијском културом

Култура ендотелних ћелија мозга и третман серумом

Овековечене мишје бЕнд.3 ћелије су купљене од Америчке колекције типских култура (АТЦЦ, Манассас, ВА). Фенотип ендотелних ћелија је потврђен имунолошким бојењем на вон Виллебранд фактор.

Ћелијске културе су инкубиране у комплетном Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму са високим садржајем глукозе (ДМЕМ, АТЦЦ 30-2002) који садржи 25 мМ глукозе са додатком 10 процента феталног говеђег серума (ФБС) и 1 процента пеницилин-стрептомицина у влажни инкубатор на 37 степени у атмосфери од 5 процената ЦО2 и 95 процената ваздуха. Ћелије су коришћене на пролазу 5 за све експерименте. Ћелије су засејане при густини 5 × 106 на 12- полиестерским уметцима Трансвелл (0,4 μм поре, Цостар) и конфлуенција је постигнута за 24–48 х. Медијум за културу је затим промењен да би се ћелије изложиле различитим концентрацијама ФБС, хуманог нормалног серума (ХНС) или уремичног серума (ЦКД) пацијената на дијализи. Очитавања ТЕЕР-а су мерена коришћењем ЕВОМ2 волт/Охм метра (Ворлд Прецисион Инструментс, Сарасота, ФЛ) на три локације по бушотини да би се добио просек. Експерименти су настављени 21 дан, а медијум за културу је освежаван свака 3-4 дана. НХС и уремични серум су из претходно прикупљених узорака добијених након одобрења ИРБ-а и информисаног пристанка.

Експерименти са културом ћелија урее

Да би се испитали ефекти урее (најзаступљенији задржани токсин у ЦКД), бЕнд.3 ћелије су инкубиране у ДМЕМ са високим нивоом глукозе са 10 процената ФБС самог или у медијуму са додатком 42 или 72 мг/дЛ (70 или 120 μм) урее ( Сигма- Олдрицх). Ове концентрације уреје су приближне вредностима пре и после хемодијализе које се генерално налазе код пацијената са ЕСРД и сматрају се клинички релевантним [28]. По завршетку периода инкубације 24-х, ТЕЕР је измерен и ћелије су сакупљене и обрађене за Вестерн блот анализу. За визуелизацију актинског цитоскелета, бЕнд.3 ћелије су узгајане на стакленим поклопцима и изложене горе наведеним концентрацијама урее током 24 х, фиксиране 10 минута у охлађеном 4 процентном формалину/ПБС, а затим обрађене за имунофлуоресцентно бојење користећи ацтистаин 488 флуоресцентно фалоидин са нуклеарном бојом ДАПИ (каталошки број ПХДГ1-А, Цитоскелетон Инц., Денвер, ЦО). Троструки слајдови су урађени по групи, а три оквира су снимљена по слајду на софтверу ИмагеЈ да би се израчунала површина бојења фалоидина нормализована на ДАПИ област.

Вестерн блоттинг

бЕнд.3 ћелије из експеримената са уреом су пелетиране, затим лизиране у реагенсу за екстракцију ткива И (Тхермо Фисхер Сциентифиц) са додатком коктела инхибитора протеазе (Роцхе Апплиед Сциенце). Концентрације протеина су мерене помоћу комплета за анализу БЦА протеина, а Вестерн блоттинг је урађен као што је горе описано са клаудином-5 (разблаженим 1:500) и оклудином (разблаженим 1:500) нормализованим на ГАПДХ интерну контролу (разређено 1:20 ,000). Вестерн блотови су поновљени најмање три пута за сваки узорак.

Хуман Студиес

Ретроспективни преглед МР графикона мозга

Електронски медицински картони између 1. јануара 2008. и 31. децембра 2014. у Медицинском центру Универзитета Калифорније-Ирвине су прегледани коришћењем Хонест Брокер система и УЦРеКс-а (Универзитета Калифорније за истраживачку размену) након одобрења ИРБ-а. Идентификовани су ЦКД пре дијализе (н =8) и хронични пацијенти на хемодијализи (н =9) који су имали најмање два МР скенирања мозга у различитим временским тачкама (од 10 првобитно идентификованих пацијената на хемодијализи, 1 је уклоњен са коначну анализу због недостајућих слика у радиолошком ПАЦС систему). Контроле са нормалном функцијом бубрега (н=10) су ручно упарене са пацијентима са ХББ на хемодијализи према полу и старости ± 5 година.

Преглед МРИ за церебрална микрокрварење

Микрокрварење је избројао неурорадиолог (ДФ) и анализирао их да ли су напредовали током времена. МРИ мозга са Т2*-пондерисаним и снимцима пондерисаним осетљивошћу (СВИ) и ФЛАИР (флуид-атенуатед инверсион рецовери) снимци су изведени на 1,5Т и 3Т МРИ скенерима. Дебљина слоја за СВИ секвенце је изведена на 2 мм, са међуслојним интервалом од 0. Микрокрварења су бројана на основу 2-мм аксијалног СВИ. ФЛАИР је био по-

формиран за откривање лезија беле материје при дебљини пресека од 3 мм, такође са међуслојним интервалом од 0.

Статистичка анализа

Није било одступања података након скрининга са Груббсовим тестом (екстремно студентизована метода одступања, хттп://грапхпад. цом/куицк цаллс/груббс1/). Разлике међу групама код мишева и код људи упоређене су хи-квадрат (Фисхер-ов егзактни) тест за категоричке варијабле и т-тест и АНОВА за континуиране варијабле. Континуирани подаци се приказују као средња вредност ± СЕМ. За податке о мишу, извели смо и Крускал-Волисов непараметарски и једносмерни АНОВА са Тукеи ХСД тестовима. Двосмерна АНОВА (ЦКД-да/не и ЛПС-да/не) је коришћена за тестирање интеракције ЦКД. Разлике међу групама сматране су значајним ако је П < 0.05.="" слике="" су="" генерисане="" коришћењем="" софтвера="" грапхпад="" присм="" 4="" (грапхпад="" софтваре,="" сан="" диего="">

Резултати

Преживљавање са ЛПС третманом

ЦКД мишеви третирани ЛПС-ом имали су стопу преживљавања од 80 процената. Били су само мишеви који су преживели 1 недељу након ЛПС третмана

укључени у завршне анализе. Сви мишеви у другим групама су преживели до краја експеримента.

ЦКД значајно повећане микрохеморагије у мозгу

Терет након ЛПС третмана

Животиње са ЦКД изазваном аденином и 5/6 нефректомијом показале су значајно повишене вредности азота уреје у крви (БУН) и креатинина у серуму у поређењу са ЦТЛ животињама (Табела 1). БП у репу је био значајно виши код животиња са нефректомијом са ЦКД у поређењу са животињама са ЦТЛ и аденин-ЦКД (Табела 1); међутим, број микрокрварења у две групе са ЦКД је био сличан. Х&Е бојење потврдило је тубулоинтерстицијску повреду изазвану аденином у бубрезима код мишева са ЦКД (слика 1б).

Просечно оптерећење микрохеморагија у мозгу било је 2.0 ± 0.5 по цм2 код не-ЛПС ЦТЛ мишева и повећано је 2–2.5- пута код животиња које немају ЛПС ЦКД (аденин- ЦКД мишеви 4,5 ± 0,9 по цм2;

нефректомија-ЦКД мишеви 4,2 ± 1,1 по цм2) (Табела 1; Слика 2а). За групе без ЛПС, повећање микрохеморагије је било значајно за аденин-ЦКД у поређењу са ЦТЛ, али не и за нефректомију-ЦКД. Третман ЛПС је повећао формирање микрохеморагије у истом степену код ЦТЛ и ЦКД животиња