Екстракт Цистанцхе Десертицола повећава формирање костију у остеобластима
Mar 05, 2022
Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Те-Мао Лиa, Хсин-Цхих Хуангb, Чен-Минг Суc, Тин-Иун Хоa, Цхи-Минг Вуa, Вен-Цхи Цхенd, Ии-Цхин Фонгa,eи Цхих-Хсин Тангf,c
Апстрактан
Циљеви:Истражили смо ефекатЦистанцхе десертицола Ма. (ЦД) на формирање костију култивисаним остеобластима.МетодеТест формирања минерализованих нодула је коришћен за испитивање ин витро ефеката ЦД-а на формирање костију. Експресија алкалне фосфатазе (АЛП), морфогенетских протеина костију (БМП)-2 и експресије мРНК остеопонтина (ОПН) анализирана је квантитативном ланчаном реакцијом полимеразе у реалном времену. Механизам деловања екстракта ЦД-а је испитан применом Вестерн блоттинг-а. Ин виво анти-остеопоротски ефекат ЦД екстракта је процењен код мишева са овариектомијом.Кључни налазиЕкстракт ЦД-а није имао утицаја на пролиферацију, миграцију или зарастање рана култивисаних остеобласта, али је повећао АЛП, БМП-2 и ОПН мРНА и минерализацију костију. Инхибитори протеин киназе активиране митогеном (МАПК) или нуклеарног фактора (НФ)-кБ смањују формирање костију изазвано екстрактом ЦД-а и експресију АЛП, БМП-2 и ОПН. Међутим, ЦД екстракт није утицао на остеокластогенезу. Поред тога, екстракт ЦД-а је спречио губитак коштане масе изазван овариектомијом ин виво.ЗакључциЦД може бити ново средство за формирање костију за лечење остеопорозе.
Увод
Кост је сложено ткиво састављено од неколико типова ћелија које пролазе кроз континуирани процес обнављања и поправке који се назива 'ремоделирање кости'. Два главна типа ћелија одговорна за ремоделирање кости су остеокласти, који ресорбују кост, и остеобласти, који формирају нову кост. Ремоделирање костију регулише неколико системских хормона (нпр. паратироидни хормон, 1, 25-хидроксивитамин Д3, полни хормони и калцитонин) и локални фактори (нпр. азотни оксид, простагландини, фактори раста и цитокини).[1]
Остеопороза настаје када су ресорпција и формирање кости некоординисане и вишак разградње кости превазилази изградњу кости.[2] Тренутни третмани за остеопорозу укључују бисфосфонате, калцитонин и естроген, који су инхибитори ресорпције костију који одржавају коштану масу инхибирајући активност остеокласта.[3] Међутим, ефекат ових лекова на повећање или опоравак коштане масе је релативно мали, свакако не више од 2 процента годишње.[3] Стога постоји потреба за средствима за изградњу кости, као што је терипаратид, који стимулишу формирање нове кости и коригују промену у трабекуларној микроархитектури која је карактеристична за успостављену остеопорозу. остеобласт, агенси који делују или повећањем пролиферације ћелија остеобластне лозе или индукцијом диференцијације остеобласта могу побољшати формирање кости.[5,6]
Иако механизми остеопорозе остају нејасни, они су вероватно повезани са смањеном доступношћу или ефектима фактора раста костију, као што су коштани морфогенетски протеини (БМП).[7] БМП, који су структурно повезани са суперпородицом фактора раста-б који се трансформише, првобитно су идентификовани по њиховом капацитету да индукују формирање ектопичне кости код глодара.[8] БМП играју важну улогу у формирању костију и диференцијацији коштаних ћелија стимулишући активност алкалне фосфатазе (АЛП), као и синтезу протеогликана, колагена и остеопонтина (ОПН).[9] Недавна студија је открила везу између остеопорозе и специфичних полиморфизама у генима БМП-2, АЛП и ОПН, сугеришући да су повезани са развојем остеопорозе.[10]
Цистанцхе десертицола Ма.(Оробанцхацеае; скраћено ЦД) је аутохтона биљка у Кини и широко се користи у традиционалној медицини као терапеутско средство због својих седативних, аналгетичких и имуностимулативних својстава.[11] Савремене фармаколошке студије су показале да екстракти ЦД-а могу да стимулишу имунитет,[12] уклањају слободне радикале[13] и повећавају активност супероксид дисмутазе.[14] Анти-инфламаторни и антиоксидативни агенси имају потенцијал да лече остеопорозу повећањем формирања костију и/или сузбијањем ресорпције кости.[15,16] Међутим, ефекат ЦД-а на функцију коштаних ћелија још није утврђен. Овде извештавамо да ЦД екстракт није утицао на пролиферацију, миграцију или активност зарастања рана култивисаних остеобласта, али је повећао експресију АЛП, БМП-2 и ОПН и минерализацију костију. Поред тога, показујемо да сигнални путеви протеин киназе активиране митогеном (МАПК) и нуклеарног фактора (НФ)-кБ могу бити укључени у ЦД-посредовано повећање експресије гена и минерализације костију. Насупрот томе, ЦД екстракт није потиснуо остеокластогенезу ин витро. Посебно, третман мишева са екстрактом ЦД-а спречио је губитак коштане масе изазван овариектомијом ин виво. Наши подаци, стога, сугеришу да се ЦД може користити за стимулацију формирања костију за лечење остеопорозе.
Цистанцхе десертицола
Материјали и методе
Екстракт и материјали Цистанцхе десертицола
Екстракт ЦД-а је купљен од Цхуанг Сонг-Зонг Пхармацеутицал Цомпани (Каохсиунг, Тајван). Екстракција и изолација ЦД-а су праћени како је претходно описано (на основу спектралних података идентификовали су хемијски састав укључујући бета-ситостерол, даукостерол, јантарну киселину, триаконтанол, актеозид, бетаин и полисахарид).[17] Зечја поликлонска антитела специфична за п-екстрацелуларне сигнално регулисане киназе (ЕРК), ЕРК, п-п38, п38, пц-Јун Н-терминалне киназе (ЈНК), ЈНК, п-п65 и п65 су купљена од Санта Цруз Биотецхнологи ( Санта Круз, САД). ЕЛИСА комплет за остеокалцин је купљен од Биосоурце Тецхнологи (Нивеллес, Белгија). Ц-терминални телопептиди ЕЛИСА комплета колагена типа И добијени су од Цросс Лапс-а (Херлев, Данска). Доминантно негативни мутант п38 обезбедио је др Ј. Хан (Соутх-Вестерн Медицал Центер, Даллас, УСА). ЈНК доминантно негативни мутант је обезбедила др М. Карин (Универзитет Калифорније, Сан Дијего, САД). ЕРК2 доминантно негативни мутант је обезбедио др М. Цобб (Соутх-Вестерн Медицал Центер). Сви остали реагенси су добијени од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, САД).
Ћелијска култура
Мишја ћелијска линија остеобласта МЦ3Т3-Е1 је купљена од Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ; Роцквилле, САД). Ћелије су узгајане у 95 процената ваздуха, 5 процената ЦО2 са а-МЕМ који је допуњен са 20 мм ХЕПЕС и 10 процената топлотно инактивираним феталним телећим серумом, 2 мм-глутамином, пеницилином (100 У/мл) и стрептомицином (100 мг /мл).
Мерење формирања минерализованих нодула
Формирање минерализованих нодула је процењено како је описано.[18] Укратко, остеобласти су култивисани у медијуму који је садржао витамин Ц (50 мг/мл) и б-глицерофосфат (10 мм) две недеље, а подлога је мењана свака три дана. Након инкубације са ЦД екстрактом током 12 дана, ћелије су испране два пута са 20 мм Трис пуферованим физиолошким раствором који је садржао
0.15 м НаЦл (пХ 7,4), фиксиран у ледено хладном 75% (в/в) етанолу током 30 минута и осушен на ваздуху. Таложење калцијума је одређено коришћењем ализаринског црвеног-С бојења. Укратко, ћелије и матрикс фиксиране етанолом су обојени 1 х са 40 мм ализарин црвеним-С (пХ 4,2) и опширно испрани водом. Везана мрља је елуирана са 10 процената (в/в) цетилпиридинијум хлорида, а ализарин црвени-С у узорцима је квантификован мерењем апсорбанције на 550 нм и упоређен са стандардном кривом. Један мол ализарин црвеног-С селективно везује приближно два мола калцијума.
Квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену
Укупна РНК је екстрахована из остеобласта коришћењем ТРИзол кита (МДБио Инц., Тајпеј, Тајван). Реверзна транскрипција је изведена коришћењем 2 мг укупне РНК и олиго(дТ) прајмера.[19,20] Квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену (кПЦР) је спроведена коришћењем ТакМан® једностепеног ПЦР Мастер Мик-а (Апплиед Биосистемс, Царлсбад, Царлсбад,). САД). Додата је укупна цДНК (100 нг по 25-мл реакцији) са прајмерима специфичним за секвенцу и Такман® сондама. Сви циљни генски прајмери и сонде су купљени комерцијално, укључујући б-актин као интерну контролу (Апплиед Биосистемс). кПЦР тестови су изведени у три примерка на систему за детекцију секвенци СтепОнеПлус (Апплиед Биосистемс). Услови циклуса су били 10-мин активације полимеразе на 95 степени праћено 40 циклуса од 95 степени током 15 с и 60 степени током 60 с. Праг је постављен изнад контролне позадине без шаблона и унутар линеарне фазе амплификације циљног гена да би се израчунао број циклуса у којем је транскрипт откривен (означен ЦТ).
Вестерн блот анализа
Ћелијски лизати су припремљени како је претходно описано.[21,22] Протеини су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ и пребачени на Иммобилон поливинил дифлуоридне мембране (Миллипоре, Биллерица, САД). Мрље су блокиране са 4 процента говеђег серумског албумина током 1 х на собној температури, а затим испитане зечјим анти-хуманим антителима против п-65, или п-п65 (1:1000) током 1 х на собној температури. После три испирања, мрље су инкубиране са секундарним антителом магарца против зеца коњугованим с пероксидазом (1: 1000) током 1 х на собној температури. Мрље су визуелизоване појачаном хемилуминисценцијом коришћењем Кс-ОМАТ ЛС филма (Еастман Кодак, Роцхестер, САД).
Остеопороза изазвана оваријектомијом
За ову студију коришћене су женке ИЦР мишева, старе четири недеље, тежине 22~28 г. Мишеви су обострано овариектомирани под анестезијом са трихлоро-ацеталдехидом (100 мг/кг), а контролни мишеви су лажно оперисани (Схам) ради поређења. Минерална густина костију и минерални садржај костију мерени су након оралне примене различитих концентрација ЦД екстракта свака два дана током четири недеље. Укупна телесна минерална густина костију и минерални садржај костију одређени су двоенергетским рендгенским апсорпциометром (ДЕКСА; КСР-26; Норланд, Форт Аткинсон, САД) коришћењем режима за мале субјекте као што је претходно описано.[18, 23] Сви протоколи су били у складу са институционалним смерницама и одобрени су од стране Комитета за негу животиња Кинеског медицинског универзитета.
Статистичка анализа
Статистичка анализа је извршена коришћењем софтвера Присм 4.01. (ГрапхПад Софтваре Инц., Сан Дијего, САД). Дате вредности су средње вредности ± СЕМ. Статистичка анализа између два узорка обављена је коришћењем Студентовог т-теста. Статистичка поређења више од две групе вршена су коришћењем једносмерне анализе варијансе са Бонфер-Ронијевим постхоц тестом. У свим случајевима, П < 0,05="" се="" сматрало="">
Екстракт Цистанцхе десертицола
Резултати
Екстракт цистанцхе десертицола повећава минерализацију костију остеобластима
Додавање ЦД екстракта током 24 или 48 х није утицало на пролиферацију мишјих остеобластних МЦ3Т3-Е1 ћелија у МТТ тесту (подаци нису приказани). Пошто је диференцијација остеобласта сложен процес који укључује пролиферацију и миграцију ћелија, такође смо тестирали миграторну способност МЦ3Т3-Е1 ћелија након третмана са екстрактом ЦД-а. Користећи Трансвелл и тестове зарастања рана, открили смо да екстракт ЦД-а не утиче на миграцију остеобласта (подаци нису приказани). Формирање минерализованих нодула је један од маркера сазревања остеобласта. Бојење Ализарином црвеном С показало је да се минерализовани нодули формирају када су остеобласти култивисани две недеље у медијуму који садржи витамин Ц (50 мг/мл) и б-глицерофосфат (10 мм), а ово је повећано на начин који зависи од концентрације додавањем ЦД-а (слика 1а). Стога је екстракт ЦД-а изазвао формирање коштаних нодула култивисаним остеобластима, али не и њихову пролиферацију или миграцију. Такође смо испитали улогу екстракта ЦД-а у остеокластогенези изазваној РАНКЛ-ом, али нисмо нашли никакав ефекат (подаци нису приказани).
Екстракт Цистанцхе десертицола повећава алкалну фосфатазу, коштани морфогенетски протеин-2 и експресију остеопонтина у култивисаним остеобластима
Диференцирани остеобласти показују повишену активност АЛП, што је у корелацији са високим нивоом експресије ензима.[18] Открили смо да третман са екстрактом ЦД-а током 72 х значајно повећава активност остеобласта АЛП (слика 1б). С обзиром на кључну улогу БМП-2, АЛП и ОПН-а у диференцијацији остеобласта, тестирали смо да ли екстракт ЦД-а има свој ефекат на диференцијацију остеобласта регулацијом експресије БМП-2, АЛП и ОПН. Третман ћелија екстрактом ЦД-а повећао је експресију мРНА АЛП, БМП-2 и ОПН на начин који зависи од концентрације (Слика 1ц), показујући да ЦД екстракт индукује диференцијацију остеобласта повећањем АЛП, БМП-2 , и ОПН израз.
Екстракт цистанцхе десертицола повећава формирање коштаних нодула кроз пут протеин киназе активиран митогеном
Пријављено је да МАПК игра важну улогу у формирању кости [24,25], па смо затим испитали да ли је овај сигнални пут укључен у минерализацију костију изазвану екстрактом ЦД-а. Предтретман ћелија са ЕРК инхибитором У0126, инхибитором п38 СБ203580 или ЈНК инхибитором СП600125 смањио је минерализацију костију повећану екстрактом ЦД-а (Слике 2а, 3а и 4а). Штавише, инхибитори су такође блокирали експресију АЛП, БМП-2 и ОПН изазвану екстрактом ЦД-а (Слике 2б–4ц). Трансфекција ћелија са мутантом ЕРК2, п38 или ЈНК смањила је повећање експресије ЦД екстракта у АЛП, БМП-2 и ОПН мРНА (слике 2ц, 3ц и 4ц). Затим смо директно испитали активацију ЕРК, п38 и ЈНК након третмана екстрактом ЦД-а. Инкубација ћелија са екстрактом ЦД-а изазвала је фосфорилацију ЕРК, п38 и ЈНК (слике 2д, 3д и 4д). Према томе, ЕРК, п38 и ЈНК посредују у повећаном формирању костију изазваном ЦД третманом остеобласта.
Екстракт Цистанцхе десертицола повећава формирање коштаних нодула путем нуклеарног фактора-кБ пута
Као што је раније поменуто, активација НФ-кБ је неопходна за формирање кости.[26,27] Затим смо третирали остеобласте инхибиторима НФ-кБ пиролидин дитиокарбаматом (ПДТЦ) и Н-тозил-Л-фенилаланин хлорометил кетоном (ТПЦК) купљеним од стране компаније. Цалбиоцхем (Дармстадт, Немачка) да би се утврдило да ли је активација НФ-кБ укључена у минерализацију костију изазвану екстрактом ЦД-а. Слика 5а показује да је предтретман остеобласта са ПДТЦ или ТПЦК инхибирао формирање коштаних нодула изазвано екстрактом ЦД-а и такође смањио повећање експресије АЛП, БМП-2 и ОПН (Слике 5б и 5ц). Фосфорилација НФ-кБ п65 подјединице је индикатор активације НФ-кБ;[28] у складу са овим, открили смо да ЦД екстракт повећава фосфорилацију п65 у остеобластима (Слика 5д). Ови резултати су показали да је активација НФ-кБ важна за експресију АЛП, БМП-2 и ОПН-а изазвану екстрактом ЦД-а и формирање коштаних нодула.
Инхибиција губитка костију екстрактом Цистанцхе десертицола код мишева са овариектомијом
Да би се испитао ефекат екстракта ЦД-а на губитак костију, остеопороза је изазвана код женки мишева оваријектомијом. Као што се очекивало, мишеви са овариектомијом показали су смањену укупну минералну густину костију тела и садржај минерала у костима (Слике 6а и 6б). Третман са екстрактом ЦД-а током четири недеље инхибирао је губитак минералне густине костију и минералног садржаја кости на начин зависан од дозе (Слике 6а и 6б). Концентрације АЛП у крви могу одражавати активност остеобласта.[29] Као што је приказано на слици 6ц, екстракт ЦД-а инхибирао је смањење активности АЛП у серуму изазвано оваријектомијом. Поред тога, ЦД екстракт је такође повећао ниво остеокалцина, маркера формирања кости, и смањио ниво Ц-терминалних телопептида колагена типа И, маркера ресорпције костију (Слике 6д и 6е). Ови налази стога подржавају моћ и ефикасност екстракта ЦД-а у спречавању губитка кости ин виво.
Дискусија
Цистанцхе десертицолаМа, аутохтона биљка у Кини, широко се користи у традиционалној медицини за различите терапеутске третмане због своје седативне, аналгетичке и имуностимулативне активности.[11–15] Овде смо показали да екстракт ЦД-а изазива минерализацију костију у култивисаним остеобластима, али јесте. не утичу на њихову ћелијску миграцију или пролиферацију. Поред тога, открили смо да су АЛП, БМП-2 и ОПН циљни протеини сигнализације изазване екстрактом ЦД-а, што захтева активацију ЕРК, п38, ЈНК и НФ-кБ.
Кост је сложено ткиво састављено од неколико типова ћелија које су у континуитету подвргнуте процесу обнове и поправке.[30] Када су ресорпција и формирање кости неуравнотежене, распад кости надјачава формирање кости и резултира остеопорозом.[30] Користили смо мишеве са овариектомијом да бисмо испитали анти-остеопоротски ефекат ЦД екстракта. Мишеви са оваријектомијом имали су смањену укупну минералну густину костију у телу и садржај минерала костију, што је ублажено третманом ЦД екстрактом. Екстракт ЦД-а је такође повећао нивое остеогеног маркера АЛП и остеокалцина у серуму. Према томе, ЦД је средство за формирање костију које спречава губитак коштане масе изазван овариектомијом ин виво.
Иако механизми остеопорозе нису сасвим јасни, они су вероватно повезани са смањеном доступношћу или смањеним ефектима фактора раста костију, као што су АЛП, БМП{0}} и ОПН. Ова три фактора играју важну улогу у процесу формирања и ремоделирања костију,[31] и добро је документовано да стимулацију диференцијације ћелија остеобласта карактерише углавном повећана експресија АЛП, БМП-2 и ОПН.[32] ] У овој студији смо открили да екстракт ЦД-а повећава експресију АЛП, БМП-2 и ОПН и побољшава минерализацију костију. Стога, ЦД екстракт делимично посредује у формирању костију тако што регулише експресију АЛП, БМП-2 и ОПН.
Пријављено је да је п38 укључен у регулацију експресије АЛП током диференцијације остеобластичних ћелија;[33] Слично, ЕРК1/2 је важан за пролиферацију и диференцијацију остеобласта.[34,35] ЈНК је укључен у формирање остеокласта. .[36] Овде смо показали да ЦД екстракт индукује ЕРК, п38 и ЈНК фосфорилацију, а инхибитори ових ензима антагонизују појачавање минерализације кости посредовано екстрактом ЦД, сугеришући да активација ЕРК, п38 и ЈНК игра обавезну улогу у формирању кости изазваном екстрактом ЦД-а. остеобласти. Поред тога, инхибитори ензима и доминантно негативни мутанти ЕРК, п38 и ЈНК смањили су експресију АЛП, БМП-2 и ОПН-а појачану екстрактом ЦД-а. Ови подаци сугеришу да је активација ЕРК, п38 и ЈНК путева потребна за повећање експресије АЛП, БМП-2 и ОПН-а и сазревања изазване екстрактом ЦД-а у остеобластима. Пријављено је да ЕРК повећава пролиферацију и диференцијацију остеобласта.[34,35] Међутим, нисмо открили ефекат ЦД екстракта на пролиферацију остеобласта. Према томе, други путеви су могли да се супротставе ефекту ЕРК након стимулације ЦД екстрактом, или су неопходни за пролиферацију. С тим у вези, открили смо да инхибитори ПИ3К и Акт такође смањују минерализацију костију изазвану екстрактом ЦД-а и експресију мРНА АЛП, БМП-2 или ОПН (подаци нису приказани). Стога, ови путеви могу бити потребни за формирање костију изазвано екстрактом ЦД-а.
Показало се да НФ-кБ контролише функцију остеобласта у костима.[37] Резултати ове студије показују да активација НФ-кБ доприноси минерализацији костију изазваној екстрактом ЦД-а и експресији АЛП, БМП-2 и ОПН у култивисаним остеобластима и да инхибитори НФ-кБ-зависног сигналног пута (ПДТЦ и ТПЦК ) инхибирао минерализацију костију изазвану екстрактом ЦД-а и експресију АЛП, БМП-2 и ОПН. п65 је фосфорилисан на Сер536 различитим киназама у неколико сигналних путева, што повећава потенцијал трансактивације п65.[38] Резултати ове студије су показали да екстракт ЦД-а повећава фосфорилацију п65. Узети заједно, ови резултати сугеришу да је активација НФ-кБ потребна за формирање костију изазвано екстрактом ЦД-а у култивисаним остеобластима. Такође смо открили да су инхибитори ЕРК, п38 и ЈНК преокренули активност НФ-кБ луциферазе изазвану ЦД екстрактом (подаци нису приказани), у складу са тим да су ови ензими узводни медијатори активације НФ-кБ изазване екстрактом ЦД-а. Стога, ЦД екстракт индукује формирање кости преко ЕРК/п38/ЈНК/ и НФ-кБ путева.
Закључци
Ова студија је показала да ЦД екстракт индукује диференцијацију и сазревање остеобласта, али не и пролиферацију или миграцију. Екстракт ЦД-а је такође повећао експресију АЛП, БМП-2 и ОПН и минерализацију костију. Показали смо да су ЕРК, п38, ЈНК и НФ-кБ путеви укључени у формирање кости посредовано екстрактом ЦД-а и експресију АЛП, БМП-2 и ОПН. Штавише, екстракт ЦД-а спречио је губитак кости ин виво изазван овариектомијом. Стога, ЦД може бити користан у стимулацији формирања костију у лечењу остеопоротских болести.
