Зашто Цистанцхе утиче на апоптозу ПЦ12 ћелија?

Ефекти Цистанцхеа на апоптозу ПЦ12 ћелија

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Тиан Јииу¹, Цхен Јианзонг¹, Цхен Ксиаоли², Јанг Хао³

¹Одељење за традиционалну кинеску медицину,²Одељење фармације, болница Ксијинг,³ПЛА Институт за неуробиологију, Четврти војномедицински универзитет, Кси'ан 710033, Кина

Апстрактан

ЦИЉ:Да би се истражили ефектиЦистанцхена 1- метил-4-фенилпиридинијум (МПП плус) изазванАпоптоза ПЦ12 ћелија.

МЕТОДЕ: ПЦ12 ћелијебили изложени само 200 μмол/Л МПП плус или МПП плус у комбинацији са различитим концентрацијамаЦистанцхеиз новозеландског серума белог зеца. Ефекти одЦистанцхенаапоптоза ПЦ12 ћелијадетектовани су проточном цитометријом, електронском микроскопијом и флуоресцентном микроскопијом.

РЕЗУЛТАТИ:Серуми прикупљени од зечева храњених еквивалентном дозом одЦистанцхеили на двоструку еквивалентну дозу одЦистанцхеимао очигледне заштитне ефекте наПЦ12 ћелијеанд тхестопе апоптозе ПЦ12 ћелијаинкубираних са ова два серума било је 2,8 процената и 10,2 процента, респективно, који су очигледно били нижи од оних кодПЦ12 ћелијесамо са МПП плус третманом (18,6 процената, П<0>

ЗАКЉУЧАК:Цистанцхеможе заштититиПЦ12 ћелијеизапоптозаизазвано МПП плус .

Кључне речи:ЦистанцхеДесертицола, 1-метил-4-фенилпиридинијум,ПЦ12 ћелије, апоптоза

Увод

Патогенеза Паркинсонове болести (Паркинсонова болест, ПД) је оштећење и губитак допаминергичких неурона супстанције нигра, иапоптозаможе бити важан разлог. Користимо проточну цитометрију (ФАЦС), трансмисиону електронску микроскопију и флуоресцентно бојење анализе нуклеарног облика и друге методе за откривање кинеске медицинеЦистанцхемедицински серум и неуротоксин 1-метил-4-фенилпиридинијум (1-метил-4-фенилпиридинијум, М ПП плус) третиране ПЦ12 ћелије, да би се истражио ефекат Цистанцхеа на неуроне Заштитни механизам поступак.

Ефекти одЦистанцхена апоптозу ПЦ12 ћелија

1. Материјали и методе

1.1 Материјали

ПЦ12 ћелијекупљени су од Јапанске фондације за науку о животу; РП-МИ1640 медијум за културу, телећи серум и колаген из репа пацова купљени су од Гибцо-а; МПП плус, Аннекин В-ФИТЦ, ПИ, ПБС, бочице за ћелијску културу и плоче за културу су купљене од Сигме; кинеска медицинаЦистанцхекупљено је од фабрике децокција у Кси'ан-у; Новозеландски крупноухи бели зец (мужјак, телесне тежине 2,5 ~ 3 кг) обезбедио је школски центар за животиње; Хоецхст33342 је купљен од компаније Бииунтиан; Параформалдехид је био домаће чистоће; ЛД4- центрифуга типа 2 (Фабрика медицинских центрифуга у Пекингу) Инструменти Флуоресцентни микроскоп (компанија Лаика), инвертни микроскоп (компанија Олимпус), ЈЕМ-2000ЕКС трансмисиони електронски микроскоп (Јапан), ЦО2 инкубатор константне температуре (овде -цус ХЕРАцелл, Немачка), Цоултер ЕПИЦС проточни цитометар (Бецк-ман Цоултер, САД).

1.2 Метод

ПЦ12 ћелијесу узгајани у медијуму ћелијске културе РПМИ1640, који је садржао 100 мЛ/Л телећег серума. Боца за ћелијску културу и плоча за културу су пре употребе прекривене са 0,2 г/Л колагена из репа пацова. Култивисане ћелије су постављене на 37 степени, у инкубатору од 50 мЛ/Л ЦО2, мењајте медијум 3 дана. Када се ћелије једнослојне културе спремају да се споје, дигестирајте са 1,25 г/Л трипсина и подкултурите. Када ћелије субкултуре уђу у фазу логаритамског раста, можете додати лекове. Према телесној тежини зеца, еквивалентна доза животиње се конвертује према површини тела. Традиционална кинеска медицинаЦистанцхесе припрема као прах осушен замрзавањем, који се разблажи дестилованом водом када се користи, а животињи се даје два пута дневно током 3 дана (Цхинесе Екпериментал Формула Цхинесе Јоурнал оф Сциенце, 1998; 4:13-15), 1 х после последњег иг, каротидно пуштање крви, преко ноћи на 4 степена, центрифугирање на 2500 о/мин 25 мин, одвајање серума, инактивација на 56 степени, 30 мин и 0. Стерилизација са 22 μм филтер мембраном и складиштење на -20 степени. Под истим условима припремљен је слепи контролни серум зеца, 1/2, 1 и 2 пута еквивалентна доза серума. Експеримент је подељен у 5 група: Група А је била празна зечја серумска група, група Б је 2 пута већа од еквивалентне дозе серума плус МПП плус група (доза гаваже је сирови лек цистанцхе 6,4 г/кг), група Ц је еквивалент доза серума плус МПП плус група (доза гаваже је сирови лек цистанцхе 3,2 г/кг), група Д је полу-еквивалентна доза серума плус МПП плус група (у дози је сирови лек Цистанцхе 1,6 г/кг), група Е је празан зечји серум плус МПП плус група. Субкултура у трајању од 12 х Убудуће посматрајте ћелије под обрнутим микроскопом и додајте лек пре спајања. Садржај серума сваке групе је 10 процената. После култивисања током 3 дана, МПП плус се додаје до коначне концентрације од 200 μмол/Л. Ставите на 37 степени, 50 мЛ/Л ЦО2 културе и проверите након 24 сата инкубације.

1.2.1 Посматрање флуоресценције ПЦ12 ћелија

Додајте Хоецхст33342 у култивисанеПЦ12 ћелијепри коначној концентрацији од 10 мг/Л, инкубирајте на 37 степени 30 минута, помешајте 40 г/Л параформалдехида и медијум за културу на 13: да би коначна концентрација параформалдехида била 10 г/Л После фиксације за 5-10 мин, одбацити супернатант, испрати са ПБС, и посматрати под флуоресцентним микроскопом.

1.2.2 Посматрање трансмисионим електронским микроскопом

После 24 сата третмана леком, ћелије су сакупљене и пребачене у епрувету за центрифугирање, центрифугиране на 1500 р/мин, 4 степена 5 мин, и испране два пута са 10 ммол/Л ПБС. Центрифугирајте на 1500 о/мин, 4 степена 5 минута, одбаците супернатант, полако додајте 25 мЛ/Л глутаралдехида дуж зида епрувете и фиксирајте на 4 степена 2 х, огулите ћелијске грудвице правој пипетом, исперите 3 пута са ПБС-ом, сваки пут по 5 мин, фиксирати 1 х после осмијум киселине на 4 степена Пост-градијент дехидратације ацетоном, натапањем епоксидном смолом и уградњом, исечен са ЛКБ-2188 ултра танким микротомом, обојен уранил ацетатом- оловни цитрат, посматран трансмисионим електронским микроскопом и фотографисан.

1.2.3 Детекција проточном цитометријом

М ПП плус третман 24 х, дигестирати 106 адхерентнихПЦ12 ћелијеса 1,25 г/Л трипсина, испрати два пута са ПБС, додати 490 μЛ пуфера за везивање, добро промешати ћелије и додати 5 μЛ Анексина В-ФИ ТЦ Помешати 10 μЛ раствореног ПИ у ћелијској суспензији, лагано промешати, ставити тест епрувета на 4 степена, инкубирајте 10 минута у мраку и извршите детекцију на проточном цитометру. Свака група има 4 реплицирана бунара.

Статистичка обрада: Подаци су представљени са к ±с, поређење између више група се врши Крускал-Волисовим тестом, а поређење у пару се врши Манн-Вхитнеи тестом, а П<0.05 is="" considered="" as="" a="" significant="">

Ефекти Цистанцхеа на апоптозу ПЦ12 ћелија

2. Резултати

2.1 Посматрање ПЦ12 ћелија флуоресцентним микроскопом

Нормално одрастаоПЦ12 ћелијеможе емитовати уједначену флуоресценцију након бојења Хоецхст33342, а флуоресценција густо обојене грануларне масе и тачкаста бела флуоресценција могу се видети у језгру апоптотске ћелије. Језгро већине ћелија у нормалној групи је релативно униформно. Плава флуоресценција, слабо видљива кондензована флуоресценција у облику тачке, њена кондензована флуоресценција у облику тачке је слабија од МПП плус контролних ћелија. Нормално узгојене ћелије показују уједначену плаву флуоресценцију након бојења по Хоецхсту, а морфологија језгра је правилна (слика 1А); Након МПП плус, нуклеарни хроматин се чини концентрисаним, или високо кондензованим, показујући неправилну флуоресценцију тачака, или маргинализовано; касна ћелијска језгра подељена на фрагменте (слика 1Б). Еквивалентна доза и 2 пута већа од еквивалентне дозе Ћелије уЦистанцхемедицински серум плус М ПП плус група била је близу нормалне (Слика 1Ц, Д).

Фиг. 1ПЦ12 ћелијеумрљано са Хоецхст33342(Хо)

А : Контрола: хроматин је равномерно распоређен и редовно обојен ; Б : МПП плус третиран: кондензација и маргина хроматина на нуклеарној мембрани; Ц : ЕквивалентЦистанцхеплус МПП плус третман ед;Д :Двоструки еквивалент Цистанцхе плус МПП плус третиран, хроматин је нормалан.

2.2 Посматрање пројекционим електронским микроскопом

Нормално култивисанПЦ12 ћелијеимају уједначен нуклеарни хроматин, чисту и комплетну нуклеарну мембрану, обилне цитоплазматске митохондрије и комплетне органеле (слика 2А). Након третмана МПП плус, ПЦ12 ћелије су се значајно промениле, ћелијска мембрана је нетакнута, површинске микровиле су нестале, а цитоплазма је концентрисана, хроматин је кондензован, сломљен, високо кондензован и сакупљен на унутрашњој површини нуклеарне мембране, што показује карактеристикеапоптоза, углавном у раним и средњим стадијумима апоптотичких ћелија (слика 2Б, Ц). Апоптотичне ћелије у свакој групи која садржиЦистанцхесеруми су очигледни Смањење, нуклеарни хроматин је равномерно распоређен, нуклеарна мембрана је чиста и комплетна, а органеле су нетакнуте, близу ћелије приказане на слици 2А.

2.3 Резултати теста проточне цитометрије

Фосфатидилсерин (ПС) који се налази на унутрашњој страни ћелијске мембране мигрирао је на спољашњу страну ћелијске мембране у раној фазиапоптоза. Стопе апоптозе сваке групе биле су (2,3 ± 0,11) процената, (2,8 ± 0,21) процената, (1{{10}},2 ± {{ 14}}.60) процената, (16.0 ± 0.87) процената и (18.6 ± 0.67) процената. Анализа ранг-сума теста Б, Ц, Д групе у поређењу са Е групом П<0.05. there="" is="" a="" significant="" difference="" between="" serum-containing="" chinese="" medicine="" and="" the="" blank="" serum="">

Слика 2ПЦ12 ћелијеултраструктура ЕМ ×6000

О: Без МПП плус равномерно диспергован хроматин, цитоплазма са густом густином електрона, нормална структура органела и нетакнута ћелијска мембрана; Б, Ц: Изложено 200 μмол/ ЛМ ПП плус .Рана апоптотска фаза, периферна кондензација хроматина, скоро нормална структура цитоплазме(Б). Касна пост-отична фаза, даља кондензација хроматина, повећана густина електрона у цитоплазми, одсуство нормалне структуре органела и поремећај интегритета ћелијске мембране (Ц).

3. Дискусија

Неуротоксичност М ПП плус је сложен процес вишекомпонентног деловања, укључујући ефекат ометања замене митохондрија и синаптичких везикула допамином за производњу реактивних врста кисеоника [1]. Тренутно се верује да је већина њих повезана са митохондријалном ћелијомапоптозаи ендогени Неуротоксични ефекат допамина доводи до апоптозе повезане [,2] У процесу посматрања апоптозе допаминске ћелијске линије субстантиа нигра СН4741 од стране М ПП плус, долази до активације каспазе-1 и каспазе{ {4}} [3] .1 μмол/ Л-ов МПП плус делује на СХ-СИ5И ћелије неуробластома надбубрежне жлезде и може повећати експресију Бцл-2 протеина повезаног са апоптозом након неколико дана [4].Цистанцхеје сув, љускави лист из рода Цистанцхе (Цистанцхе) фамилијеЦистанцхе. Месната стабљика цистанцхе има добар лековити ефекат у лечењу Алцхајмерове болести и ПД. Укупни гликозиди цистанхе могу ефикасно да уклоне различите активне слободне радикале кисеоника и могу заштитити оксидацију ДНК узроковану ОХ. [5]. Схенг ет ал. [6] истраживања су потврдила да екстракт тубулкозида Цистанцхеа може да ублажи цитотоксичност изазвану МПП плус, да ослаби акумулацију реактивних врста кисеоника у ћелији и да има антагонистички ефекат на МПП плус индуковануапоптозаи оксидативни стрес. То смо приметилиЦистанцхеима антагонистички ефекат на МПП плус индуковани ПЦ12. Ефекат ћелијеапоптоза, и заштитни ефекат одПЦ12 ћелијеповећава се са повећањем дозе.

Ефекти Цистанцхеа на апоптозу ПЦ12 ћелија

Референце

[1] Лотхариус Ј, О Маллеи КЛ. Лек који изазива паркинсонизам 1- метил-4-фенилпиридинијум покреће интрацелуларну оксидацију допамина. Нови механизам токсичности [Ј]. Ј Биол Цхем, 2000; 275 (49): 38581-38588 .

[2] Маруиама В, Наои М. Смрт ћелија код Паркинсонове болести [Ј]. Ј Неурол, 2002;249(С Суппл 2):6-10.

[3] Цхун ХС, Гибсон ГЕ, ДеГиоргио ЛА, ет ал. Смрт допаминергичких ћелија изазвана МПП( плус), оксидансом и специфичним неуротоксикантима деле заједнички молекуларни механизам [Ј]. Ј Неуроцхем, 2001;76(4): 1010-1021.

[4] Веецх ГА, Деннис Ј, Кеенеи ПМ, ет ал. Поремећена функција митохондријалног транспорта електрона повећава експресију анти-апоптотичког Бцл-2 и Бцл-КСЛ протеина у неуробластому СХ-СИ5И и кибридним ћелијама Паркинсонове болести кроз оксидативни стрес [Ј]. Ј Неурости Рес, 2000;6(1):693-700.

[5] Ванг Ксиаовен, Јианг Ксиаоиан, Ву Лиа, ет ал. Ин витро уклањање слободних радикала и заштитни ефекти на оштећење ДНК изазвано ОХ изазвано укупним гликозидимаЦистанцхе[Ј]. Цхинесе Пхармацеутицал Јоурнал, 2001; 36(1): 29-32. Ванг КСВ, Ји анг КСИ, Ву ЛИ и др. Проучавање укупних гликозида који елиминишу слободне радикале и штите повређену ДНК ин витро [Ј]. Цхин Пхарм, 2001;36(1):29-32.

[6] Схенг Г, Пу Кс, Леи Л, ет ал. Тубулозид Б изцистанцхесалса спашава ПЦ12 неуронске ћелије од 1-метил-4-фенилпиридинијум-индукованогапоптозаи оксидативни стрес [Ј].Плаи нта Мед, 2002;68(11):966-970.

Из: Часопис Четвртог војномедицинског универзитета (Ј Фоуртх Мил Мед Унив) 2004; 25(10)

ИД чланка: 1000-2790 (2004) 10-0955-03