Анализа компоненти ароме и диференцијалних метаболита у Цистанцхе Мусалаис на основу ГЦ-МС и метаболомике

 

Апстракт:Ова студија је припремила Цистанцхе Мусалаис користећи традиционалне технике са црвеним грожђем Ксињианг Хетиан и различитим додацима Цистанцхе. Оптимални услови обраде су одређени једносмерном АНОВА. ГЦ-МС и нециљана метаболомика су коришћени за анализу компоненти ароме и диференцијалних метаболита, а активни састојци као што су укупни флавоноиди и укупни полифеноли су квантификовани. Оптимални услови су били: почетни садржај шећера од 32 степена Бк, температура ферментације од 25 степени и 7% додатак Цистанцхе десертицола. У овим условима, садржај алкохола, укупне киселости, укупних флавоноида и укупних полифенола достигао је (12,6 ± 0,6)% вол, (3,82 ± 0,19) г/Л, (0,80 ± 0,01) г/Л и (0,60 ± 0,00) г/Л, респективно, респективно. ГЦ-МС је открио 38 једињења ароме, од којих су естри најзаступљенија класа (24 једињења), затим 6 алкохола, 2 кетона и 2 алдехида. У поређењу са Мусалаисом направљеним искључиво од сока грожђа, Цистанцхе десертицола Мусалаис је показао значајно више нивое кључних естара, укључујући етил ацетат (6,42% наспрам. 2.42%) и етил палмитат (3,75% наспрам . 1.18%), док су виши алкохоли као што је изобутанол смањен на 1%{1}% ({1}%). Метаболомика је идентификовала 230 диференцијалних метаболита (ВИП већи или једнак 1, П < 0,05), обогаћених путевима повезаним са АБЦ транспортерима и биосинтезом аминокиселина. Компоненте као што су тригонелин и кроцин су значајно повишене. Метаболизам аминокиселина допринео је формирању карактеристичног профила укуса. Ова студија пружа теоријску и техничку основу за развој и унапређење квалитета Цистанцхе Мусалаис. Будућа истраживања би требало да укључе молекуларне сензорне технике, као што је ГЦ-О, како би се боље идентификовала кључна активна једињења одговорна за укупан профил укуса.

Кључне речи: Цистанцхе;Мусалаис; ГЦ–МС; метаболомика

ЦистанцхеМусалаис

 

 

 

Цистанцхе Мусалаис Листинг Детаилс

 

 

 

Мусалаис (Мсалаис)је традиционално ферментисано пиће јединствено за Синђанг, произведено од Авати црвеног грожђа или Хетиан (Хотан) црвеног грожђа. Прави се соком, концентрисањем и спонтаном ферментацијом, а карактерише се као примитиван, природан и зелен. Као јединствено кинеско природно ферментисано алкохолно пиће, Мусалаис показује различите регионалне карактеристике у сензорним атрибутима, нутритивној вредности и функционалним активностима. Алкохоли, естри, алдехиди, киселине, феноли и терпени који настају током ферментације не само да дају јединствен укус, већ су и повезани са предностима као што су унапређење циркулације крви, снижавање липида у крви, тонифицирање бубрега и јачање организма, регулација холестерола и одржавање цереа, чинећи га погодним за кардиоваскуларно и васкуларно здравље потрошача [1].

Последњих година, са растућом потражњом потрошача за здравим пићима, тржиште функционалних алкохолних пића се брзо проширило. На основу традиционалног пиварства, функционална пића садрже специфичне функционалне компоненте како би задовољиле потребе за добробит, одржавање здравља или специфичну физиолошку регулацију. На њихов квалитет утичу сировине, процеси, микробне заједнице и стабилност функционалних компоненти [2]. У народној пракси јужног Синђијанга, локални додаци као што су гоји бобице, шафраник, цистанче и шафран се често додају током припреме Мусалаја да би се побољшале здравствене предности и обогатила разноликост укуса [3]. Међу њима, Цистанцхе богат полисахаридима, аминокиселинама, фенилетаноидним гликозидима, иридоидним гликозидима и алкалоидима – има тоничко дејство на јанг бубрега, модулира неуроендокрину функцију и бори се против умора, због чега је добио назив „женшен пустиње“ [4–5].

Међутим, индустријализација Цистанцхе Мусалаис тренутно се суочава са изазовима укључујући недостатак стандарда производње, непотпуну технологију прераде и недовољно истраживања ароматичних супстанци, ограничавајући промоцију на тржишту и побољшање квалитета. У овој студији, Цистанцхе је коришћен као додатак за оптимизацију процеса Мусалаис ферментације. ГЦ-МС и нециљана метаболомика су коришћени за систематско решавање ароматичних састојака и диференцијалних метаболита, са циљем да се обезбеди теоретска основа и техничка подршка за стандардизовану производњу, модулацију укуса и функционално побољшање Цистанцхе Мусалаис, чиме се промовише модернизација и развој вредности овог традиционалног напитка.

1 Материјали и методе

 

1.1 Материјали и реагенси

 

Цистанцхе тубулоса (цеваста Цистанцхе): комерцијални примерци првог разреда пореклом из Хетиана (Хотан), Ксињианг, пуне текстуре и без буђи и нечистоћа.

Хетиан црвено грожђе: комерцијално воће са нетакнутим изгледом и јаком аромом, пореклом из Хетиана, Ксињианг.

Метанол и ацетонитрил: Тхермо Фисхер Сциентифиц (Цхина) Цо., Лтд.

Мравља киселина: ТЦИ (Схангхаи) Девелопмент Цо., Лтд.

L-2-хлорофенилаланин: Схангхаи Аладдин Биоцхемицал Тецхнологи Цо., Лтд.

 

1.2 Инструменти и опрема

 

08-2Т магнетна мешалица са константном температуром, Шангај Меииингпу Инструмент Цо., Лтд.

57330-У СПМЕ уређај и 57348-У 50/30 μм ДВБ/ЦАР/ПДМС СПМЕ влакно, Сигма-Алдрицх (Схангхаи) Традинг Цо., Лтд.

6890Н-5973 ГЦ–МС систем, Агилент Тецхнологиес (Цхина) Цо., Лтд.

5430Р расхладна центрифуга, Еппендорф (Схангхаи) Интернатионал Традинг Цо., Лтд.

TL-48R високопропусна брусилица за ткиво, Схангхаи Јингкин Индустриал Девелопмент Цо., Лтд.

СЦИЕНТЗ-1ЛС вакуумски концентратор, Нингбо Сциентз Биотецхнологи Цо., Лтд.

Ванкуисх Флек УХПЛЦ, Тхермо Фисхер Сциентифиц (Цхина) Цо., Лтд.

SDAJ-0.5 Линија за производњу вина у кинеском стилу, Схандонг Ањи Био-Ферментатион Екуипмент Тецхнологи Цо., Лтд.

1.3 Експерименталне методе

 

1.3.1 Ток процеса

Цистанцхе је куван на пари за каснију употребу. Хетианско црвено грожђе је опрано и одабрано, откинуто и згњечено. Сок од грожђа је екстрахован пресом, затим загреван и концентрован да би се подесили индикатори концентрације сока. На крају, парени Цистанцхе производ је помешан са концентрованим соком од грожђа и ферментисан под контролисаним температурним и временским параметрима. Након ферментације, производ је бистрен да би се добио Цистанцхе Мусалаис.

 

1.3.2 Припрема Цистанцхеа

Уз мање модификације Гонг ет ал. [6], висококвалитетна, неискварена осушена Цистанцхе је огуљена, исечена, умотана у газу и кувана на пари 20 минута за каснију употребу.

 

1.3.3 Припрема сока од грожђа

Коришћено је Хетиан црвено грожђе са почетним растворљивим чврстим материјама (шећером) од 18 степени Бк. Уклоњено је труло, покварено и неравномерно сазрело грожђе. После прања и љуштења, грожђе је пресовано. Сок је куван (концентрисан) на високој температури и концентрација је прекинута када је шећер достигао 26, 29 или 32 степена Бк. Сок је охлађен на собну температуру за каснију употребу.

 

1.3.4 Процес ферментације Цистанцхе Мусалаис

Цистанцхе куван на пари је додат у дефинисаним размерама (3%, 5%, 7%) у 600 мЛ концентрованог сока од грожђа у ферментору. Преостали шећер је мерен свака 24 х током ферментације да би се пратио напредак. Када је преостали шећер пао на 4 г/Л, ферментација је прекинута. Супернатант је сакупљен и пастеризован на 85 степени током 30 минута да би се добио Цистанцхе Мусалаис.

1.3.5 Једнофакторски експериментални дизајн за Цистанцхе Мусалаис

Испитивани су ефекти додавања Цистанцхеа (3%, 5%, 7%), почетног садржаја шећера (26, 29, 32 степена Бк) и температуре ферментације (22, 25, 28 степени) на физичко-хемијска својства и биоактивност.

 

1.3.6 Анализе и мерења

 

Садржај алкохола, растворљивих чврстих материја и укупна киселост: одређено према ГБ/Т 15038-2006 „Опште аналитичке методе за вино и воћно вино“.

Укупни флавоноиди: одређено у односу на Ксу ет ал. [7]. Калибрациона крива је припремљена са концентрацијом рутина (Кс) као апсцисом и апсорбанцијом (И) на 510 нм као ординатом, дајући И=0.8043Кс − 0,0278, Р2=0.9999, што указује на добру линеарност.

Укупни полифеноли: одређено Фолин–Циоцалтеу методом [8]. Припремљена је калибрациона крива са садржајем галне киселине (Кс) као апсциса и апсорбанцом (И) на 760 нм као ординатом, дајући И=0.4177Кс + 0.1048, Р2=0.9975, што указује на добру линеарност.

 

1.3.7 ГЦ–МС анализа

Узорци из две групе - експерименталне (32 степена Бк, 25 степени, 7% Цистанцхе) и контролне без Цистанцхе - подвргнути су ГЦ-МС.

Предтретман узорка: Узорак је стављен у бочицу за екстракцију од 20 мЛ; 100 μЛ 50 уг/мЛ изоамил фенилацетата је додато као интерни стандард. Бочица је запечаћена и еквилибрисана у воденом купатилу од 60 степени уз магнетно мешање на 250 о/мин током 20 мин. СПМЕ влакно је затим убачено на екстракцију од 30 минута. Пре употребе, СПМЕ влакно је кондиционирано на улазу ГЦ на 250 степени током 20 минута.

Услови ГЦ–МС: ХП-ИННОВак колона (60 м × 250 μм × 0,25 μм); улаз 250 степени; линија преноса 250 степени; проток гаса носача 1,5 мЛ/мин; поделити 4:1. Програм рерне: 40 степени (5 мин), рампа 5 степени/мин до 250 степени, држите 10 мин. Извор јона 230 степени; четворопол 150 степени ; ЕИ 70 еВ; потпуно скенирање 35–550 Да.

 

1.3.8 Нециљана метаболомика

 

1.3.8.1 Припрема узорка

Испитиване су две групе: експериментална (32 степена Бк, 25 степена, 7% Цистанцхе) и контролна без Цистанцхеа; н=3 биолошких реплика по групи, укупно 6 узорака. После одмрзавања и мешања, 300 μЛ сваког узорка је пребачено у епрувету од 1,5 мЛ и центрифугирано на 12.000 о/мин, 4 степена током 15 минута. Затим је 100 μЛ супернатанта премештено у епрувету од 2 мЛ, брзо замрзнуто у течном азоту и лиофилизовано. Додати 1 мЛ претходно охлађеног метанола:ацетонитрил (1:1, в/в), мешати 30 с; замрзнути на -20 степени 30 минута; центрифугирати на 12.000 о/мин, 4 степена 10 мин; прикупити 850 μЛ супернатанта и осушити у вакууму до потпуног стања; реконституисати у 150 μЛ 50% метанола (са 5 ппм 2-хлорофенилаланина), вртложни 30 с; центрифуга 12.000 о/мин, 4 степена 10 мин; филтрирати кроз мембрану од 0,22 μм и пренети филтрат у бочице. Комбинујте 10–20 μЛ из сваког узорка да бисте направили КЦ узорак за процену стабилности инструмента и поузданости података; КЦ се изоставља ако је укључено мање од 5 узорака.

 

1.3.8.2 Аналитички услови

Хроматографија: АЦКУИТИ УПЛЦ ХСС Т3 колона (100 А, 1,8 μм, 2,1 мм × 100 мм); проток 0,4 мЛ/мин; стуб 40 степени; аутосамплер 8 степени; ињекција 2 μЛ. Мобилна фаза А: вода са 0,1% (в/в) мравља киселина; мобилна фаза Б: ацетонитрил са 0,1% (в/в) мравља киселина.
Масена спектрометрија: напон распршивања +3.5 кВ/−3,0 кВ; плашт гас 40 арб; помоћни гас 10 арб; капиларни 320 степени; температура помоћног гаса 300 степени; МС1 резолуција 60.000; опсег скенирања м/з 70–1000; АГЦ циљни стандард; Мак ИТ 100 мс; МС/МС зависан од података на горња 4 јона са динамичким искључењем 4 с; МС2 резолуција 15.000; ХЦД енергија судара 30%.

 

1.3.8.3 Идентификација метаболита

Идентификација метаболита је заснована на ПСНГМ (ПерСоналбио Нект-Генератион Метаболомицс Датабасе), која се састоји од интерне библиотеке стандарда, мзЦлоуд (хттпс://ввв.мзцлоуд.орг/), ЛИПИД МАПС (хттпс://ввв.липидмапс.орг/), ХМДБ (хттпс://хмдб.ца/), МоНА (хттпс://мона.фиехнлаб.уцдавис.еду/), НИСТ_2020_МСМС и МС/МС спектралну библиотеку предвиђену АИ.

Напомена о спољним базама података које се користе у напоменама:

ХМДБ: Свеобухватна база података о људском метаболому (верзија 5.0) која садржи детаљне хемијске, клиничке и биохемијске информације за 220.945 метаболита, са опсежним унакрсним везама са КЕГГ, ПубЦхем, МетаЦиц, ЦхЕБИ, ПДБ, УниПрот и ГендБанк, и подршком за напредни текст/секуенце/секуенце МСН претраге. Такође повезан са ДругБанк, Т3ДБ, СМПДБ и ФооДБ.

LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50.000 курираних липидних структура), спектри, путеви, алати за МС анализу, цртање структуре и ресурси номенклатуре/класификације.

мзЦлоуд: Напредна библиотека масеног спектра која подржава претраге засноване на спектру, структури, подструктури, стаблу и м/з, са 32.330 једињења, 51.002 спектрална стабла и 16.531.567 спектра (са значајним додацима у 2024.), оптимизована за приступ Фирефок-у/Цхрому.

 

1.3.8.4 Мултиваријантна статистичка анализа

Мултиваријантне анализе су примењене на податке о метаболитима из 6 узорака за извођење ПЦА, разјашњавајући метаболичке разлике између Цистанцхе Мусалаис и Мусалаис. Диференцијални метаболити у групама су прегледани коришћењем ОПЛС-ДА променљиве важности у пројекцији (ВИП), промене набора и П вредности (ВИП праг и значај као горе), праћено биолошком интерпретацијом укључујући обогаћивање КЕГГ пута [9].

 

Референце

[1] Зху ЛКС, Ванг ЛЛ, Сонг ХЗ, ет ал. Квалитативна анализа главних арома једињења повезаних са традиционалном обрадом Мусалаја у Кини Синђанг. Часопис Института за пиварство. 2012;118(2):236–242.
[2] Зхао Б, Ли ДД, Иуан И, ет ал. Савремени напредак истраживања ферментисаног функционалног ликера. Прављење пића. 2025;52(2):43–49.
[3] Зху ЛКС, Хоу КСЈ, Ксу К. Дискусија о стратегијама развоја вина од грожђа Ксињианг Мсалаис. Наука и технологија за производњу пића. 2008(7):111–113.
[4] Песма ЗХ, Леи Л, Ту ПФ. Напредак у истраживању фармаколошке активности у биљкама Цистанцхе Хоффинг. ет Линк. Кинеске традиционалне и биљне дроге. 2003;34(9):У018.
[5] Схи ТТ, Ге ВХ. Развој истраживања Цистанцхе Хоффмг. Ет Линк. Кинески часопис за етномедицину и етнофармацију. 2009;18(9):7–9.
[6] Гонг Кс, Зхонг Т, Зхоу ЈИ, ет ал. Студија о технологији новог ферментисаног вина Цистанцхе. Модерна храна. 2019(5):64–68;79.
[7] Ксу ХТ, Ли Х, Зхао ИЗ, ет ал. Антиоксидативна и антибактеријска активност укупних флавоноида из Нервилиа фордии. Северна хортикултура. 2017(16):161–165.
[8] Иу Х, Ксу Кс, Хао ЈКС, ет ал. Мешовита ферментација комине од коре цитруса са Трицходерма конингии, Аспергиллус оризае и Лацтобациллус цасеи: оптимизација процеса, антиоксидативна активност и нециљана метаболомска анализа. Фоод Биосциенце. 2025;66:106180.
[9] Зхоу ЈН, Хоу ДХ, Зоу ВК, ет ал. Поређење широко циљане метаболомике и нециљане метаболомике дивљег Опхиоцордицепс синенсис. Молекули. 2022;27(11):3645.
[10] Ли КСХ. Истраживање технологије Роса квангсиенсис вар. стерилис ферментисано вино [Магистарски рад]. Цхонгкинг: Југозападни универзитет; 2017.
[11] Ли ЗЈ, Зханг КСД, Лонг БКС, ет ал. Истраживање развоја производа и оптимизације површине одзива крушке Мсалаис. Прерада пољопривредних производа. 2025;3:1–10.
[12] Зханг Л, Јианг КСФ. Провера прилагодљивости методе одређивања бакра у GB/T15038-2006 методи опште анализе вина и воћног вина. Прављење пића. 2020;47(5):104–107.
[13] Зхонг ДЛ, Ианг Х, Ванг З, ет ал. Утицај температуре малолактичке ферментације на квалитет вина Цабернет Саувигнон. Зхејианг Агрицултурал Сциенцес. 2025;66(7):1724–1732.