Идентификација врста и анализа хемијског састава дивљих биљака Цистанцхе из Кеније
May 14, 2025
Апстракт:Ова студија је користила биљну морфологију, хистологију и технике баркодирања ДНК за идентификацију дивљих врста Цистанцхе у Кенији. Садржај главних активних компоненти, укључујући фенилетаноидне гликозиде, шећерне алкохоле и бетаин, у дивљини Цистанцхе из Кеније одређен је ХПЛЦ методом. У међувремену је извршена анализа отиска прста. Резултати су показали да је дивља биљка Цистанцхе сакупљена из Кеније идентификована као Цистанцхе сенегаленсис (Реут.) Бецк. Садржај активних састојака као нпрехинакозид,цистанозид А, актеозид, изоактеозид, и 2′-ацетилактеозид у Ц. сенегаленсис из Кеније били су нижи од оних у домаћем Ц. тубулоса, али виши од оних у домаћем Ц. десертицола. Садржај бетаина био је сличан оном код домаће Ц. десертицола, али не садржи глукозу. Карактеристике отиска прста су сличније онима код домаће Ц. тубулоса. Ова студија пружа основу за заштиту ресурса, дубинско истраживање и развој ресурса Цистанцхе у Кенији.
Кључне речи: Цистанцхес Херба; Цистанцхе сенегаленсис (Реут.) Бецк; Кенија; идентификација врсте; ДНК баркодирање; одређивање садржаја
Цистанцхе десертицолаИЦ Ма
Цистанцхе, цењена биљка у традиционалној кинеској медицини, односи се на осушене, љускаве, сочне стабљике пустињских биљака као нпр.Цистанцхе десертицолаИЦ МаиЦистанцхе тубулоса(Сцхенк) Вигхт, оба члана породице Оробанцхацеае. Чувена по својој способности да тонизира јанг бубрега, храни суштину и крв и влаже црева како би ублажила затвор, Цистанцхе се вековима слави у кинеским биљним текстовима. Његов најранији медицински запис појављује се у древном класикуШенонгов класик Материје Медике, где је Цистанцхе класификована као биљка "врхунског квалитета". Током историје, бројни традиционални медицински текстови су документовали моћне предности Цистанцхеа, због чега је добио цењени надимак „Гинсенг оф тхе Десерт“.
Различити фармаколошки ефекти Цистанцхеа приписују се његовом низу биоактивних једињења. Међу њима, фенилетаноидни гликозиди су примарни активни састојци одговорни за ефекте Цистанцхе-а који тонизира бубреге и негује срж. Ова једињења – као што су ехинакозид и актеозид – показују неуропротективне, анти-деменцијске, против старења и хепатопротективне активности. Посебно, ехинакозид и актеозид су два референтна једињења која се користе за контролу квалитета Цистанцхе-а, као што је наведено у издању Кинеске фармакопеје из 2020. Поред тога, лаксативни ефекат Цистанцхе-а је углавном због његових олигосахаридних алкохолних компоненти, укључујући бетаин, манитол, фруктозу, глукозу и сахарозу. Ових пет компоненти су широко препознате као показатељи способности Цистанцхеа да влаже црева и подстиче рад црева.
Цистанцхе тубулоса(Сцхенк) Вигхт
У Кини, главне врсте Цистанцхе укључујуЦистанцхе десертицолаИЦ Ма,Цистанцхе тубулоса(Сцхенк) Р. Вигхт,Цистанцхе салса(ЦА Меи.) Г. иЦистанцхе синенсисГ. Бецк. Ове врсте су поријеклом из региона као што су Унутрашња Монголија, Нингкиа, Гансу и Ксињианг. Осим северозападне Кине, врсте Цистанцхе су такође распрострањене у сушним и пустињским регионима Евроазије и северне и источне Африке, укључујући земље попут Ирана, Авганистана, Кеније, Пакистана и Монголије.
Кенија, која се налази у источној Африци и простире се на екватору, углавном се састоји од висоравни са просечном надморском висином од 1.500 метара, али северне области су пустињске или полупустињске. Аутохтони народи Кеније имају дугу историју коришћења лековитих биљака за лечење. Регион се може похвалити богатом лековитом флором - на пример, екстракти из коре и корена дрвета четкице за зубе (Салвадора персицаЛ.) су познати по својим антиинфламаторним и антибактеријским својствима и често се користе за лечење зубобоље и инфекција. Кора сандаловине (Осирис ланцеолатаХоцхст. & Стеуд.) се користи за лечење дијареје, док се децокције масаи коприве (Уртица массаицаБлаги бр.) листови се користе за болове у стомаку. Ова богата традиција је подстакла живу културу лековитог биља, али због изазова економског развоја, употреба ових лековитих биљака није у потпуности документована нити систематски проучавана.
Занимљиво је да се врсте Цистанцхе често сматрају коровом у Африци и нису добиле много пажње или истраживања. У ствари, скоро да нема објављених студија о афричком цистаншу. Одговарајући на позив Одељења за регионални развој за сушне и полусушне земље источноафричке заједнице, наш истраживачки тим је спровео теренску студију у Кенији како би истражио локалне ресурсе Цистанцхеа. Прикупили смо дивље узорке Цистанцхе, извршили ботаничку идентификацију и анализирали њихова примарна биоактивна једињења. Циљ је био да се разуме разноликост врста и развојни потенцијал Цистанцхеа у Кенији, и да се обезбеди научна основа за даље истраживање и коришћење ових вредних пустињских биљака.
Цистанцхе тубулоса сушени цео корен Продаја у Кини
Материјали и методе
Биљни материјали
Узорке дивљег Цистанцхеа из Кеније прикупили су у августу 2023. професори Пенгфеи Ту и Ионг Јианг са Факултета фармацеутских наука Универзитета у Пекингу у Кајиаду, Кенија (01 степен 50'01"С; 36 степен 47'00"Е). Две дивље биљке Цистанцхе су сакупљене и означене К1 и К2, заједно са коренима њихове биљке домаћина (види слику 1). Биљку домаћина је идентификовао Кенеди Матхека, истраживач асистент у Источноафричком хербаријуму, Национални музеји Кеније, каоСерицоцомопсис хилдебрандтииСцхинз, који припада породици Амарантхацеае. Узорци одЦистанцхе десертицолаиЦистанцхе тубулосаприкупљени су из града Турпан и округа Иутиан у аутономном региону Синђанг Ујгур, респективно, а аутентичност их је потврдио професор Пенгфеи Ту као свеже сочне стабљикеЦистанцхе десертицолаИЦ Ма иЦистанцхе тубулоса(Сцхренк) Вигхт. Сви узорци ваучера чувају се у нашој лабораторији.
Инструменти
Ватерс Арц ХПЛЦ систем
Куинтик125Д-1ЦН електронска вага (Сарториус, Пекинг)
Олимпус BX-50 оптички микроскоп (Олимпус, Јапан)
НаноЗоомер-СК панорамски скенер слајдова (Хамаматсу Пхотоницс, Јапан)
КК500ДЕ дигитални ултразвучни чистач (Кунсхан Ултрасониц Инструментс, Кина)
ММ400 млин за екстракцију ДНК (Ретсцх, Немачка)
ПЦР термални циклус (Аналитик Јена, Немачка)
DYY-8C апарат и резервоар за електрофорезу (Фабрика инструмената Лиуии, Пекинг)
МИНИ Спаце 1000 гел систем за снимање (Танон, Шангај)
Инкубатор са константном температуром (Иихенг, Шангај)
Реагенси
Ехинакозид (лот: ДСТ191008-038), актеозид (ДСТДЛ006101), изоактеозид (ДСТ210601-060), Д-манит (ДСТДГ006201) купљени су од Цхенгду Десите Биотецхнологи Цо., Лтд.; тубулозид А (MUST-15040115), 2'-ацетилактеозид (MUST-15071504), бетаин (MUST-23082505), Д-глукоза безводна (MUST-23030214), фруктоза (MUST-23031403) и сахароза (MUST-23082505) добијени су од Цхенгду Мансите Биотецхнологи Цо., Лтд. (ХПЛЦ граде, ОЦЕАНПАК), мравља киселина (ХПЛЦ граде, ВОКА реагенси) су све биле хроматографске чистоће. Комплет за екстракцију геномске ДНК биљака (ДП305, Тианген Биотецх, Кина) и ултра чиста вода коришћени су за молекуларну анализу.
Припрема, бојење и посматрање делова стабљике сукулента
Пратећи методу из референце [10], свеже стабљике сукулента Цистанцхеа су исечене на одговарајуће величине и конзервисане у ФАА фиксативу (70% етанол: глацијална сирћетна киселина: формалдехид=90:5:5). Након испирања текућом водом да би се уклонио заостали фиксатив, ткива су омекшана флуороводоничном киселином, обојена сафранином, дехидрирана, стављена у парафин и пресечена. Након монтирања, дијапозитиви су печени, парафин истопљен, а делови обојени 95% раствором етанола Фаст Греен, а затим запечаћени неутралном смолом. Морфологија ткива је посматрана под микроскопом, а добро формирани пресеци су скенирани помоћу панорамског скенера да би се добиле слике високе резолуције.
Екстракција ДНК, ПЦР амплификација и секвенцирање
Укупна ДНК из Цистанцхе узорака и корена биљке домаћина је екстрахована коришћењем комплета за екстракцију геномске ДНК биљке (Тианген), пратећи протокол произвођача. Концентрације ДНК и односи ОД260/ОД280 мерени су микроволуменским УВ спектрофотометром да би се проценио квалитет пре него што се настави.
ПЦР амплификација је циљала на унутрашњи транскрибовани спацер 2 (ИТС2) регион рибозомалне ДНК и хлоропластни псбА-трнХ ген за молекуларну идентификацију [11]. Прајмер секвенце су биле следеће:
ИТС2 напред: 5'-АТГЦГАТАЦТТГГТГТГААТ-3'
ИТС2 реверс: 5'-ГАЦГЦТТЦТЦЦАГАЦТАЦАЦАТ-3'
псбА-трнХ напред: 5'-ГТТАТГЦАТГААЦГТААТГЦТЦ-3'
псбА-трнХ реверс: 5'-ЦГЦГЦАТГГТГГАТТЦАЦААТЦЦ-3'
ПЦР реакције (25 μЛ) су укључивале 12,5 μЛ 2× Так Мастер Микса, по 1 μЛ предњег и реверзног прајмера (2,5 μмол·Л⁻¹), 2 μЛ ДНК шаблона и 8,5 μЛ ддХ₂О. ИТС2 појачање: 94 степена 5 мин; затим 35–40 циклуса од 94 степена 30 с, 56 степена 30 с, 72 степена 45 с; коначно продужење на 72 степена 10 мин. псбА-трнХ амплификација: 95 степени 4 мин; 35 циклуса од 94 степена 30 с, 55 степена 1 мин, 72 степена 1 мин; коначно продужење на 72 степена 10 мин. ПЦР производи су анализирани гел електрофорезом, а циљне траке су подвргнуте Сангер-овом двосмерном секвенцирању. Хроматограми секвенци су анализирани коришћењем ЦодонЦоде Алигнер-а (в3.7.1, ЦодонЦоде Цо., УСА) да би се добиле циљне ДНК секвенце, које су идентификоване коришћењем кинеског Материа Медица ДНК баркод система и БЛАСТ анализе у бази података ГенБанк. Филогенетска стабла су конструисана са МЕГА Кс софтвером за идентификацију врста.
Квантитативно одређивање пет фенилетаноидних гликозида
Садржај пет фенилетаноидних гликозида одређен је према раније утврђеним методама [13]. Припрема референтних раствора: тачно одмерити ехинакозид, тубулозид А, актеозид, изоактеозид и 2'-ацетилактеозид и растворити у 50% метанолу да би се припремио мешани стандардни раствор унапред одређене концентрације. Услови хроматографије: колона Пхеноменек Луна Ц18 (250 мм × 4,6 мм, 5 μм); мобилна фаза А: ацетонитрил–метанол (6:1, в:в); мобилна фаза Б: 0,1% пуфер мравље киселине; градијент елуирања: 0–5 мин, 10%–18% А; 5–15 мин, 18%–24% А; 15–20 мин, 24%–26% А; 20–28 мин, 26%–30% А; 28–35 мин, 30%–35% А. Брзина протока: 1,0 мЛ·мин⁻¹; температура колоне: 30 степени; таласна дужина детекције: 330 нм. Метода: убризгати по 10 μЛ стандардног и узорка раствора у ХПЛЦ за анализу.
Квантитативно одређивање бетаина, манитола, фруктозе, глукозе и сахарозе
Ове компоненте су квантификоване према претходним методама [14]. Референтни раствори: тачно одмерити бетаин, манитол, фруктозу, глукозу и сахарозу, растворити у води да би се припремио мешани стандардни раствор. Раствори узорака: раствор Цистанцхе узорка (припремљен као горе) са 50% метанола до 1/5 првобитне концентрације, добро промешати и филтрирати кроз микропорозну мембрану од 0,22 μм. Услови хроматографије: Колона Сходек АСХАИПАК НХ2П-50 4Е (250 мм × 4,6 мм, 5 μм); мобилна фаза: ацетонитрил–вода (77:23); брзина протока: 0,7 мЛ·мин⁻¹; температура колоне: 25 степени; детекција са детектором евапоративног расејања светлости (ЕЛСД): температура цеви за померање 100 степени, проток гаса носача 3 Л·мин⁻¹. Квантификација је извршена убризгавањем 5 μЛ и 10 μЛ стандардних раствора и 5 μЛ раствора узорка и израчунавањем садржаја применом екстерне стандардне логаритамске једначине у две тачке.
Процена сличности отиска прста
Раствори узорака су припремљени као што је горе описано, а ХПЛЦ услови и методе су били исти као за квантификацију фенилетаноидних гликозида. Хроматографски подаци су увезени у „Систем за процену сличности хроматографских отисака прстију традиционалне кинеске медицине (издање 2012.)“. Као референтни коришћен је хроматограм узорка К1, са пет пикова фенилетаноидног гликозида означених за корекцију у више тачака, генерисање преклопних и референтних хроматограма и израчунавање сличности отиска прста.
Резултати и анализа
1. Морфолошка идентификација Цистанцхе
Дивљи примерци Цистанцхеа сакупљени у Кенији показују карактеристичне морфолошке карактеристике. Цваст је клас, са једним листом дуго-јајоличастог облика и две мале брактеоле, чије су обе стране голе. Чашка је цеваста, са пет тупих режњева на врху. Вјенчић је цевасто-кампануласт, дужине 3-4 цм, око 2,5 пута дужи од чашке, са пет режњева на врху и закривљеним ивицама. Вјенчић је жуте боје (слика 1А, Б), а када се осуши постаје браон. Филаменти су дугачки око 3 цм, са неколико финих длачица у основи. Стил је нешто дужи од прашника, а стигма је скоро сферична, глатка и гола. Има четири прашника, са дугим јајоликим прашницима који су густо прекривени дугим вунастим длакама; основа прашника је нагло зашиљена. Ова карактеристика је у складу са описимаЦистанцхе десертицолаиЦистанцхе салсау "Флори Кине"; насупрот томе, антер база одЦистанцхе тубулосаје туп и заобљен, што га јасно разликује од других врста у истом роду [7].
Поред тога, биљка домаћин,Серицоцомопсис хилдебрандтииСцхинз, је веома разгранат грм. Његове младе гране густо су прекривене бледожутим или белим вунастим длачицама. Листови су широко лопатасто-обличасти са уском базом (слика 1Д, Е). Цвасти су густо скупљене дуж петељке, која је заједно са осовином цваста прекривена сивкастобелим или бледо сивим или белим вунастим длачицама.
Сочна стабљика дивље цистанче је спљоштена-цилиндрична, са бледожутом или браонкастом површином густо прекривеном игличастим, меснатим љускама распоређеним у редове. Текстура је чврста, али мало флексибилна (слика 2А). Попречни пресек стабљике сукулента је бледожут или браонкаст, са разбацаним бледо смеђим васкуларним сноповима видљивим голим оком (Слика 2Б). Под микроскопом, васкуларни снопови изгледају јајолики или веретани, састављени од ксилема и флоема, често присутни као појединачни расути снопови или груписани у парове или трије, са флоемом оријентисаним у различитим правцима (Слика 2Ц, Д). Према издању Кинеске фармакопеје из 2025., пресекЦистанцхе десертицолаје браонкаст, са бледо смеђим тачкастим васкуларним сноповима распоређеним у таласасти прстен, често формирајући унутрашње пресавијени прстенасти сноп; насупрот томе,Цистанцхе тубулосаприказује расуте васкуларне снопове у облику тачака, кључну карактеристику за идентификацију ова два типа пресека Цистанцхе [1]. Дивљи Цистанцхе из Кеније такође показује расуте васкуларне снопове у облику тачака на попречном пресеку, у складу са карактеристикамаЦистанцхе тубулоса.
Слика 2. Карактеристике изгледа и пресека дивље биљке Цистанцхе (К2) у Кенији. О: Изглед стабљике; Б: Попречни пресек меснате стабљике; Ц: Парафински део меснате стабљике (сафранин-брзо зелено бојење); Д: Увећани поглед на васкуларни сноп у парафинском делу
