Клонирање гена, функционална идентификација, структура и анализа експресије сахарозе синтазе из Цистанцхе Тубулоса Ⅲ

4 Анализа експресије ЦтСус у различитим деловима Цистанцхе тубулоса иу систему ћелијске културе под стресом од суше

4.1 Анализа експресије ЦтСус у различитим деловима Цистанцхе тубулоса

Експерименти трансформације целе ћелије ин витро и експерименти ензимске каталитичке реакције потврдили су да протеин кодиран ЦтСус геном има способност да катализира синтезу УДП-глукозе. У циљу даљег истраживања корелације између овог гена и биосинтезе гликозидних једињења у Цистанцхе тубулоса, ниво експресије овог гена у различитим деловимаЦистанцхе тубулосаје анализирано.

ПРОДАЈА ВИСОКОКВАЛИТЕТНЕ СИРОВИНЕ ЦИСТАНЦХЕ

Вецистанцхе служба подршке - Контактирајте нас да бисте добили информације о попусту:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел:+86 15292862950

Ецхинацосидеје најрепрезентативније гликозидно једињење у Цистанцхе тубулоса, а његов садржај може достићи више од 30% суве тежине биљака Цистанцхе тубулоса [23]. Истраживачка група је претходно мерила садржај ехинакозида у различитим деловима биљака Цистанцхе тубулоса, а специфичан учинак је био: садржајechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>ваздушни део; међу њима је био највећи садржај ехинакозида у хаусторијуму. Квантитативни ПЦР флуоресценције у реалном времену је изведен коришћењем цДНК из различитих делова Цистанцхе тубулоса као шаблона, а резултати су анализирани од стране 2–ΔΔЦТ метода, а урађена је диференцијална анализа. Резултати су приказани на слици 4А. Ниво експресије ЦтСус гена у хаусторијуму био је највиши, 1,5 пута већи од надземног дела, а ниво експресије у подземном делу је био значајно већи од оног у надземном делу, што је у складу са шемом акумулације фенилетанол гликозида. представљен ехинакозидом у различитим деловимаЦистанцхе тубулоса.

Слика 4 Релативни нивои експресије ЦтСус у различитим деловима Ц. тубулоса иу ћелијама суспензије третираним ПЕГ6000. О: Релативни ниво експресије ЦтСус у различитим деловима Ц. тубулоса; Б: Ниво релативне експресије ЦтСус у ћелијама суспензије Ц. тубулоса третираних ПЕГ6000 у различитим временским тачкама н=3, 𝑥± с.*П ＜ 0,05,***П ＜ 0,001

ВИСОКОКВАЛИТЕТНЕ СИРОВИНЕ ЦИСТАНЦХЕ

4.2 Анализа експресије ЦтСус у ћелијама суспензије Цистанцхе десертицола у условима стреса од суше

Прелиминарна истраживања на пројекту су то показаластрес од суше изазван ПЕГ6000можезначајно повећатитхеакумулација фенилетанол гликозидау ћелијама суспензије Цистанцхе. Од 3 до 9 дана након индукције, садржај ехинацеасиде се значајно повећао. Од 12. до 15. дана,стопа раста ехинацеасидесадржај се успорио и достигао максималну вредност 15. дана. Затим, како се време културе повећавало, садржај ехинацеасиде се значајно повећао. Садржај фруктозида се постепено смањивао [24]. На основу овог истраживања, овај рад је користио цДНК нетретираних ћелија суспензије Цистанцхе десертицола и ПЕГ6000-индуковане ћелије суспензије Цистанцхе десертицола као шаблоне за спровођење квантитативне ПЦР детекције флуоресценције у реалном времену за испитивање ЦтСус гена у суспензији Цистанцхе десертицола ћелије у условима стреса од суше. промене нивоа експресије. Резултати су приказани на слици 4Б. У ћелијама суспензије Цистанцхе десертицола индукованим ПЕГ6000, експресија ЦтСус се значајно повећала 6. дана након индукције, и достигла највишу вредност 9. дана, а затим се вратила на исти ниво као и контрола. групе истог нивоа. Горе наведени резултати показују да стрес од суше може значајно повећати експресију гена ЦтСус у ћелијској линији суспензије Цистанцхе десертицола, што је у складу са обрасцем акумулације ехинацеасиде под стресом од суше. Међутим, вршна експресија ЦтСус гена појављује се раније од врха садржаја ехинацеасида, јер је активни донор гликозила синтетизован ЦтСус катализом важан прекурсор потребан за реакцију гликозилације у више корака у наредном биосинтетском путу ехинацеасиде. , стога се спекулише да ће организми након што су подвргнути стресу од суше првенствено мобилисати гене повезане са примарним метаболизмом како би постигли акумулацију активних донора, а затим постигли акумулацију важних секундарних метаболита.

ВИСОКОКВАЛИТЕТНЕ СИРОВИНЕ ЦИСТАНЦХЕ

5 Студија тродимензионалне структуре ЦтСус протеина и анализа кључних активних места

На основу функције ЦтСус у катализацији производње гликозил донора УДП-глукозе, даље је проучавана структурна основа ЦтСус каталитичке активности. За предвиђање секундарне структуре протеина коришћен је онлајн алат СОПМА. Резултати су показали да секундарна структура ЦтСус садржи 55,28% -хеликса, 25,47% насумичних намотаја, 12,80% продужених нити и 6,46% -завоја (Слика 5А), што указује да су -хелицес најважније секундарне структурне јединице у ЦтСус протеину, следе насумични намотаји, који такође чине велики део протеина. Проширени праменови и завоји су распоређени по протеину. Према постојећим студијама, сахароза синтаза обично постоји у облику тетрамера, који се сматра његовим активним обликом. Стога је овај рад даље користио АлпхаФолд2 за предвиђање структуре ЦтСус протеина и добио његову тродимензионалну структуру протеинских тетрамера. Поређење базе података ПДБ (Протеин Дата Банк) је показало да сличност секвенце између Арабидопсис тхалиана сахароза синтазе АтСус1 (ПДБИД 3С28) и ЦтСус може достићи 77,93%. Предвиђена структура ЦтСус упоређена је са тродимензионалном структуром АтСус1, а вредност средње квадратне девијације (РМСД) након суперпозиције протеина била је 1,11 А, што указује да су просторне структуре ове две веома конзистентне (Слика 5Б).

Пријављена структура кристалног комплекса протеин-лиганд Арабидопсис АтСус1 са УДП и фруктозом (ПДБИД3С29) коришћена је као шаблон [16] за анализу начина везивања ЦтСус са УДП и фруктозом. Резултати молекуларног спајања приказани су на слици 5Ц. Може се приметити да су џепови за везивање супстрата АтСус1 и ЦтСус веома слични у погледу типа аминокиселина, просторне дистрибуције и конфигурације, а преклапање је велико, што доказује да је секвенца сахарозне синтазе високо очувана у биљкама. Конформације два лиганда, УДП и фруктозе, у џепу за везивање протеинског супстрата приказане су на слици 5Д. Најповољнија конформација УДП и ЦтСус за молекуларно спајање има добро преклапање са конформацијом УДП у АтСус1-УДП кристалном комплексу, што доказује тачност резултата молекуларног спајања. Интеракција између УДП-а и кључних аминокиселинских остатака у џепу за везивање протеинског супстрата приказана је на Слици 5Е. УДП и ЦтСус су углавном повезани заједно водоничним везама и хидрофобним интеракцијама. Кључни аминокиселински остаци у џепу за везивање супстрата укључују: еу294, Гли301, Мет576, Арг578, Лис583, Глн646, Асн652, Леу677, Тхр678 и Глу681.

Референце

[1] Песма ЗХ, Леи Л, Ту ПФ. Напредак у истраживању фармаколошке активности у биљкама ЦистанцхеХоффинг. ет Линк [Ј]. Цхин Традит Херб Другс (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Лиу ВЈ, Лиу И, Сонг КК, ет ал. Поређење хемома између култивисане и дивље Цистанцхетубулосе коришћењем ¹Х-НМР спектроскопије [Ј]. Кина Ј Цхин Матер Мед (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Сонг И, Зенг К, Јианг И, ет ал. Цистанцхес Херба, од угрожене врсте до великог бренда кинеске медицине [Ј]. Мед Рес Рев, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Лиу И, Ванг Х, Ианг М, ет ал. Полисахариди Цистанцхе десертицола штите ћелије ПЦ12 од повреда изазваних ОГД/РП [Ј]. Биомед Пхармацотхер, 2018, 99: 671-680.

[5] Иин И, Хуанг Ј, Гу Кс, ет ал. Еволуција ензима интерконверзије биљних нуклеотида и шећера [Ј].ПЛоС Оне, 2011, 6: е27995.

[6] Бар-Пелед М, О'Неилл МА. Формирање шећера у биљним нуклеотидима, међусобна конверзија и спасавање рециклажом шећера [Ј]. Анну Рев Плант Биол, 2011, 62: 127-155.

[7] Гуо Х, Ли Л, Ванг ПГ. Биохемијска карактеризација УДП-ГлцНАц/Глц4-епимеразе из Есцхерицхиа цоли О86:Б7 [Ј]. Биохемија, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Донг С, Чеснокова ОН, Турнбоугх ЦЛ Јр, ет ал. Идентификација УДП-Н-ацетилглукозамин4-епимеразе укључене у гликозилацију протеина егзоспоријума у ​​Бациллус антхрацис [Ј]. Ј Бацтериол, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Ли ЛН, Конг ЈК. Идентификација гена сахарозе синтазе на нивоу транскриптома у Орнитхогалумцаудатум [Ј]. РСЦ Адв, 2016, 6: 18778-18792.

[10] Сцхмолзер К, Гутманн А, Дирицкс М, ет ал. Сахароза синтаза: јединствена гликозилтрансфераза за развој процеса биокаталитичке гликозилације [Ј]. Биотецхнол Адв, 2016, 34: 88-111.

[11] Цардини ЦЕ, Лелоир ЛФ, Цхирибога Ј. Биосинтеза сахарозе [Ј]. Ј Биол Цхем, 1955,214: 149-155.[12]Стеин О, Гранот