Фенилетаноидни гликозиди Цистанцхе Тубулоса индукују апоптозу у Еца-109 ћелијама путем пута који зависи од митохондрија

Увод

Рак једњака је један од најчешћих типова рака са 11. највећом стопом морбидитета и 6. највећом стопом морталитета на глобалном нивоу, и изазвао је око 439,000 смртних случајева у 2015. Инциденција рака једњака значајно варира међу различитим регионима, са источним Азија и источна и јужна Африка показују највише стопе инциденције и западна Африка која показује најниже стопе у 2012. У Кини, процењени случајеви и смртност од рака једњака били су 477,000 и 375,000, респективно , у 2015. Иако се стопа морбидитета од рака једњака смањила у земљама са средњим и високим и средњим социодемографским индексом између 2005. и 2015. године, стопа морталитета остаје висока због лоше прогнозе. Комбинација хируршке ресекције са хемотерапијом или радиотерапијом коришћена је за лечење карцинома једњака, међутим, објављено је да је између 2003. и 2014. године 5-стопа преживљавања остала<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyпоказао тоЦистанцхе тубулоса фенилетаноидни гликозиди(ЦТПГ) би могао да потисне раст ћелија меланома Б16-Ф10 ин витро и ин виво (24). Међутим, лоша растворљивост ЦТПГ-а у води који је претходно коришћен ограничава развој лека. Због тога је коришћен ЦТПГ растворљив у води (ЦТПГ-В) и истражен је антитуморски ефекат на ћелије рака једњака (Еца-109). Утврђено је да ЦТПГ-В може дозно-зависно да инхибира одрживост Еца-109 ћелија кроз индукцију апоптозе путем митохондријалног пута.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

материјали и методе

Животиње.

Женке Ц57БЛ/6 мишева (6-8 недеља, ~25 г) купљене су од Пекиншког лабораторијског центра за истраживање животиња (Пекинг, Кина) и смештене у контролисаној температури (25˚Ц), са светлосним циклусом (12/ 12) Установа за животиње Универзитета Ксињианг (Урумћи, Кина). Све животиње су добиле воду и храну без патогена.

Ћелијска линија и култура.

Ћелијска линија хуманог карцинома једњака (Еца-109) сачувана је у Кључној лабораторији за биолошке ресурсе и генетски инжењеринг у Синђијангу (Колеџ науке о животу и технологији, Универзитет Синђанг, Урумћи, Кина) и култивисана у РПМИ{{1} } медијум (Гибцо; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц., Валтхам, МА, САД) са додатком 10% топлотно инактивираног феталног говеђег серума (ФБС; МРЦ, ЕН МОАСАИ Биологицал Тецхнологи Цо., Лтд, Јиангсу, Кина), 1% Л -глутамин (100 мМ), 100 У/мл пеницилина и 100 µг/мл стрептомицина на 37˚Ц у влажној атмосфери која садржи 5% ЦО2.

Течна хроматографија високих перформанси (ХПЛЦ).

ЦТПГ-В (кат. бр. СГЈГ20170410) је купљен од Схангхаи Упбио Тецх Цо., Лтд. (Шангај, Кина). Главна једињења ЦТПГ-а су квалификована и квантификована помоћу ХПЛЦ према нашој претходној студији (24). Укратко, ХПЛЦ је спроведена на ЗОРБАКС СБ‑Ц18 колони (250к4,6 мм; 5 µм) на 30˚Ц и елуирана са 0,2% раствором мравље киселине и градијентом метанола почевши од 23%, пошто је додаван 1 мл сваке минуте. током 45 минута док не достигне 31%. Укупно 10 µл узорка је убризгано и детектовано на 330 нм. Стандард ехинакозида је купљен од Схангхаи Баобан Биотецх Цо., Лтд. (Шангај, Кина), а стандард актеозида је купљен од Сигма-Алдрицх (Мерцк КГаА, Дармстадт, Немачка). Стандарди су коришћени за анализу компоненти ЦТПГ-В.

МТТ тест.

Пролиферација ћелија је мерена МТТ тестом. Еца{{0}} ћелије су инокулисане у 96-плоче са бунарчићима у густини од 5к103 ћелије у 100 µл РПМИ{{5 }} медијум/бунарић и култивисан на 37˚Ц током 24 х, затим третиран различитим концентрацијама (0, 200, 400, 600 и 800 µг/мл) ЦТПГ-В или 0,4% диметил сулфоксида (ДМСО) током 24, 48 и 72 ч. ДМСО је коришћен као контрола растварача (800 µг/мл ЦТПГ-В који садржи 0,4% ДМСО). Цисплатин (20 µг/мл) је коришћен као позитивна контрола. Након тога, супернатант је одбачен након центрифугирања на 225 кг током 5 минута на собној температури и 100 µл МТТ раствора (0,5 мг/мл у РПМИ-1640 медијуму без ФБС) је додат у сваки бунар и инкубиран на 37°Ц током 3 х. Формирани кристали формазана су растворени у 200 ул ДМСО. Вредности оптичке густине (ОД) мерене су на таласној дужини од 490 нм помоћу 96-читача микроплоча (Био-Рад Лабораториес, Инц., Херцулес, Калифорнија, САД). Релативна виталност ћелија је израчуната према формули: Вијабилност ћелије (%)=(ОДтретирано/ОДнетретирано)к100%. Морфологија Еца‑109 ћелија је посматрана инвертованим флуоресцентним микроскопом (увећање, к200) (Никон Ецлипсе Ти‑Е; Никон Цорпоратион, Токио, Јапан).

За пролиферацију спленоцита, мишеви Ц57БЛ/6 су еутаназирани дислокацијом грлића материце, а слезине су изоловане. Направљена је једноћелијска суспензија и спленоцити су засејани у 96-плоче са бунарима у густини од 1к105 ћелија/бунарићу у 100 µл РПМИ-1640 медијума, а затим третирани различитим концентрацијама (0, 200, 400, 600 и 800 µг/мл) ЦТПГ-В током 24, 48 и 72 х на 37˚Ц са 5% ЦО2. Пролиферација спленоцита је мерена МТТ тестом, према горе поменутом протоколу. Стимулаторни индекс=ОДтреатед/ОДунтреатед.

Мерење апоптозе и ћелијског циклуса. Еца{{0}} ћелије су култивисане у посудама од 60 мм при густини од 2,5к105 ћелија по посуди током 24 сата и третиране различитим концентрацијама ({{31} }, 200, 400, 600 и 800 µг/мл) ЦТПГ-В или 0,4% ДМСО током 24 х на 37˚Ц са 5% ЦО2. Ћелије су сакупљене и обојене комплетом за откривање апоптозе Анексин В-флуоресцеин изотиоцијаната (ФИТЦ)/пропидијум јодида (ПИ) (Схангхаи Схенгсхенг Биотецхнологи Цо., Лтд., Шангај, Кина), према протоколима произвођача. Узорци су сакупљени проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур; БД Биосциенцес, Франклин Лакес, Њ, САД) и анализирани помоћу ФловЈо 7.6 (Трее Стар, Инц., Асхланд, ОР, САД). Да би се анализирао ефекат ЦТПГ-В на ћелијски циклус, 2,5к105 Еца-109 ћелије су засејане у посуде за културу од 60 мм и третиране са ЦТПГ-В (0, 100, 200 и 400 µг/мл) или 0,4 % ДМСО током 24 х на 37˚Ц са 5% ЦО2. Све ћелије су сакупљене и испране два пута ледено хладним ПБС (Гибцо; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц.), затим фиксиране у 70% ледено хладном етанолу на 4˚Ц током 30 мин. Након два пута испирања ледено хладним ПБС-ом, ћелије су ресуспендоване у 300 µл ПИ/РНасе пуфера за бојење (БД Биосциенцес, Сан Јосе, ЦА, УСА) током 10 минута на собној температури. Дистрибуција ћелијског циклуса је анализирана помоћу софтвера МодФит ЛТ 3.0 помоћу проточне цитометрије (БД ФАЦСЦалибур).

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСАПротив умораЗаштита јетре ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Анализа потенцијала митохондријалне мембране (Δψм) и реактивних врста кисеоника (РОС).За анализу Δψм, Еца{{0}} ћелије су третиране са ЦТПГ-В (0, 400, 600 и 800 µг/мл) или 0,4% ДМСО за 24 х на 37˚Ц са 5% ЦО2 и обојено комплетом за анализу потенцијала митохондријалне мембране са ЈЦ-1 (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи, Шангај, Кина), према протоколу произвођача, 20 минута на 37˚ Ц. Након два пута испирања са ЈЦ-1 пуфером за испирање (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи), узорци су ресуспендовани са 300 µл ЈЦ-1 пуфера за испирање и анализирани проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур). Флуоресценција ЈЦ-1 боје у Еца-109 ћелијама је такође примећена помоћу инвертованог флуоресцентног микроскопа (увећање, к200; Никон Ецлипсе Ти-Е). За анализу РОС, Еца-109 ћелије су третиране са ЦТПГ-В (0, 400, 600 и 800 µг/мл) током 2, 4, 6, 12 и 24 х и обојене тестом реактивног кисеоника комплет (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи), према протоколу произвођача, 20 мин на 37˚Ц. Након три пута испирања ледено хладним ПБС-ом, узорци су сакупљени проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур) и анализирани софтвером ФловЈо 7.6.

Слика 1. Квалификована контрола ЦТПГ-В. Компоненте ЦТПГ-В су квалитативно и квантитативно анализиране течном хроматографијом високих перформанси и упоређене са стандардима ехинакозида и актеозида. ЦТПГ-В, фенилетаноидни гликозиди растворљиви у водиC. тубулоса.

Активност уклањања радикала 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (ДППХ). Активност уклањања слободних радикала ЦТПГ-В одређена је ДППХ тестом слободних радикала према објављеном протоколу уз мању модификацију, пошто је метанол замењен етанолом да би се растворио ДППХ (25,26). За мерења у стабилном стању, 150 µл ДППХ (100 ммол/л) у етанолу је помешано са различитим концентрацијама ЦТПГ-В (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 и 600 µг/мл) у 50 µл ПБС, и инкубирано у мраку 30 минута на собној температури. Апсорбанца на 517 нм је детектована у присуству и одсуству ЦТПГ-В. Као позитивна контрола коришћено је укупно 50 µл витамина Ц. Активност уклањања радикала ДППХ израчуната је коришћењем формуле: Чишћење (%)=[1-(Асампле-Абланк)/А0] к100, где је Абланк апсорбанца контроле (без ДППХ), Асампле је апсорбанца узорка и А0 је апсорбанца ПБС са ДППХ.

Вестерн блот анализа. Еца{{0}} ћелије су третиране са ЦТПГ-В (0, 200, 600 µг/мл) или 0,4% ДМСО током 24 х на 37˚Ц са 5% ЦО2. Следеће испирање два пута са ПБС, ћелије 

Слика 2. Ефекат ЦТПГ-В на раст Еца-109 ћелија и спленоцита. (А) Еца-109 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-В током 24, 48 и 72 х, а затим је детектована виталност ћелија помоћу МТТ теста. (Б) Морфолошке промене Еца-109 ћелија након третмана ЦТПГ-В 24 х. (Ц) Спленоцити Ц57БЛ/6 мишева су третирани различитим концентрацијама ЦТПГ-В током 24, 48 и 72 сата, а затим је пролиферација анализирана МТТ тестом.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. тубулоса.

су лизирани у пуферу за лизу радиоимунопреципитације (Беијинг ЦомВин Биотецх Цо., Лтд., Пекинг, Кина) током 20 минута на леду. Након центрифугирања на 10,000 кг током 10 минута на 4˚Ц, супернатанти су сакупљени, а концентрације протеина су детектоване помоћу комплета за бицинхонинску киселину (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц.) у складу са протоколима произвођача. Вестерн блот анализа је спроведена према нашем претходном опису (24). Антитела против каспазе-7 (кат. бр. Д120077), каспазе-8 (кат. бр. Д155240), каспазе-9 (кат. бр. Д220078), Б-ћелијског лимфома{ {13}} (Бцл-2)-повезани Кс (Бак) (кат. бр. Д220073) и Бцл-2 (кат. бр. Д260117), и анти-мишји ИгГ-пероксидаза рена (ХРП) ) (кат. бр. Д111050) и анти-зечји ИгГ-ХРП (кат. бр. Д110058) купљени су од ББИ Лифе Сциенцес (Шангај, Кина). Антитела против каспазе-3 (кат. бр. Е-АБ-10050) и активне каспазе-3 (кат. бр. Е-АБ-22115) купљена су од Елабсциенце ( Вухан, Кина). Друга антитела против каспазе-7 (кат. бр. 9492), поли (АДП-рибоза) полимеразе (ПАРП) (кат. бр. 9542), цитохрома ц (кат. бр. АЦ909), ц-Јун НХ{ {37}}терминална киназа (ЈНК) (кат. бр. 9252С) и -актин (кат. бр. 58169) добијени су од Целл Сигналинг Тецхнологи, Инц. (Данверс, МА, САД). Сва примарна и секундарна антитела су разблажена у односу 1:1,000. Примарна антитела су инкубирана на 4˚Ц преко ноћи, а секундарна антитела су инкубирана на 37˚Ц током 1 х.

Слика 3. Апоптоза Еца-109 ћелија изазвана ЦТПГ-В. Ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-В током 24 х. (А) Апоптотичне и некротичне Еца-109 ћелије су анализиране проточном цитометријом. Горњи панел приказује појединачне тачкице, а доњи панел приказује збирне податке. * П<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. тубулоса.

Циљни протеини су детектовани коришћењем комплета за испитивање побољшане хемилуминисценције (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи), према протоколу произвођача.

Статистичка анализа. Статистичка значајност је израчуната једносмерном анализом варијансе са Тукеијевим пост хоц тестом, а резултати су анализирани коришћењем софтвера ГрапхПад Присм 5.0 (ГрапхПад Софтваре, Ла Јолла, Калифорнија, САД) између третиране и контролне групе. Сви подаци су представљени као средња вредност ± стандардна девијација. П<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

ЕКСТРАКТ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ ФУНКЦИЈЕ БУБРЕГА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Резултати

ЦТПГ‑В потискује раст Еца‑109 ћелија.

Компоненте ЦТПГ-В су квалификоване и квантификоване помоћу ХПЛЦ (слика 1), које су упоређене са стандардима ехинакозида и актеозида. Према временима вршне ретенције и површинама пикова, ЦТПГ-В је садржао 39,16% ехинакозида и 2,44% актеозида. Прво, ефекат ЦТПГ-В на виталност Еца-109 ћелија је одређен МТТ тестом. ЦТПГ-В је растворен у ДМСО на 200 мг/мл и разблажен РПМИ-1640 медијумом који садржи 10% топлотно инактивираног ФБС до назначених концентрација. Еца-109 ћелије су третиране ЦТПГ-В и виталност ћелија је анализирана МТТ тестом у назначеним временским тачкама. Третман ЦТПГ-В значајно је смањио виталност Еца{16}} ћелија на начин који зависи од дозе и времена (П<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Слика 4. Ефекат ЦТПГ-В на дистрибуцију ћелијског циклуса у Еца-109 ћелијама. Различите концентрације ЦТПГ-В су коришћене за лечење Еца-109 ћелија током 24 х, а дистрибуција ћелијског циклуса је анализирана проточном цитометријом. * П<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. тубулоса.

ЦТПГ-В индукује апоптозу у Еца-109 ћелијама. Да би се истражило да ли је ЦТПГ-В потиснуо раст Еца-109 ћелија путем индукције апоптозе или некрозе, ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-В. После 24 х, апоптоза и некроза Еца-109 ћелија су откривене бојењем Анексином В/ПИ. Као што је приказано на слици 3А, ћелије Анексина В-/ПИ+ су затворене као некротичне ћелије, а Анексин В+/ПИ+ и Анексин В+/ПИ- ћелије су затворене као апоптотичке ћелије. ЦТПГ-В је првенствено индуковао апоптозу Еца-109 ћелија на начин зависан од дозе, иако су се некротичне Еца{16}} ћелије такође значајно повећале под третманом 600 и 800 µг/мл ЦТПГ-В (П<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

ЦТПГ-В индукује заустављање ћелијског циклуса у С фази у Еца-109 ћелијама. Поремећај циклуса ћелија рака ће потиснути раст ћелија и промовисати апоптозу (27). Дистрибуција ћелијског циклуса у Еца-109 ћелијама је откривена ПИ бојењем након ЦТПГ-В третмана током 24 х. Уочено је да су се ћелије у С фази повећале и да су ћелије у Г0/Г1 фазама показале укупан значајан пад након третмана ЦТПГ-В (П<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

ЦТПГ‑В смањује Δψм и индукује ослобађање цитокрома ц. Апоптоза се може индуковати митохондријално зависним путем (28,29). Про- и анти-апоптотички чланови породице БЦЛ-2 протеина играју важну улогу у регулацији интегритета митохондријалне мембране (30,31). Након третмана ЦТПГ-В током 24 сата, Δψм је процењен коришћењем бојења ЈЦ-1. ЈЦ‑1 агрегат (црвена флуоресценција откривена у ФЛ‑2) ће се распасти у мономер (зелена флуоресценција откривена у ФЛ-1) када се Δψм смањује (32). Као што је приказано на слици 5А, фреквенције ФЛ-1+ ФЛ-2-/+ ћелија су се значајно повећале на начин који зависи од дозе, што указује да се Δψм ћелија Еца-109 смањио. Промене флуоресценције у ћелијама Еца-109 су такође примећене помоћу инвертованог флуоресцентног микроскопа (слика 5Б). Са повећањем концентрација ЦТПГ-В, црвена флуоресценција се смањила, а зелена флуоресценција повећала, што је у складу са подацима из проточне цитометрије. Такође је примећено да је ниво цитокрома ц у цитосолу значајно повећан (слика 5Ц), што је резултат смањења Δψм. Ово потврђује закључак извучен из повећаног броја ФЛ-1+ ФЛ-2-/+ ћелија да се Δψм смањио као резултат третмана ЦТПГ-В. Пријављено је да ЈНК може да регулише активацију породице протеина БЦЛ-2 изазивајући ослобађање цитохрома ц (33-35). Такође је утврђено да је ниво ЈНК значајно повећан након третмана ЦТПГ-В (слика 5Ц). Резултати су показали да ЦТПГ-В може индуковати апоптозу Еца-109 ћелија путем пута који зависи од митохондрија.

Слика 5. Смањење Δψм и повећање цитохрома ц и ЈНК. Еца-109 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-В током 24 х. (А) Δψм је детектован ЈЦ-1 бојењем и узорци су анализирани проточном цитометријом. Појединачне тачкице приказују промене у флуоресценцији ЈЦ‑1. Фреквенције ФЛ-1+ ФЛ-2-/+ ћелија су приказане на доњем панелу. ***П<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Слика 6. Нивои РОС у Еца-109 ћелијама након третмана ЦТПГ-В и антиоксидативна активност ЦТПГ-В. (А) Еца-109 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-В и нивои РОС су анализирани проточном цитометријом у назначеним временским тачкама. * П<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Ефекат ЦТПГ-В на интрацелуларно генерисање РОС.РОС би могао да смањи Δψм да изазове апоптозу (36). Да би се истражило да ли ЦТПГ-В може да повећа производњу РОС, Еца-109 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-В. Ћелије су сакупљене у назначеним временским тачкама и обојене са ДЦФХ-ДА. Производња интрацелуларних РОС у Еца-109 ћелијама одређена је проточном цитометријом. Као што је приказано на слици 6А, 800 µг/мл ЦТПГ-В значајно је повећало производњу РОС од 2-6 х, а смањило се са 12-24 х. Поред тога, 400 µг/мл ЦТПГ-В значајно повећава производњу РОС-а од 12-24 х. Штавише, 200 µг/мл ЦТПГ-В није значајно променио производњу РОС. Динамичке промене у производњи РОС могу бити повезане са апоптозом Еца{15}} ћелија. Такође је утврђено да ЦТПГ-В има активност уклањања слободних радикала (слика 6Б), што може бити повезано са смањеном производњом РОС у Еца-109 ћелијама третираним са 800 µг/мл ЦТПГ-В после 12 х.

Слика 7. Нивои цепаних каспаза и цепљених-ПАРП после третмана ЦТПГ-В. Протеини су изоловани из Еца-109 ћелија третираних ЦТПГ-В током 24 х и нивои цепљених каспаза и цепљених-ПАРП су детектовани помоћу Вестерн блот анализе. ДМСО, диметил сулфоксид; ЦТПГ-В, фенилетаноидни гликозиди растворљиви у водиC. тубулоса; ПАРП, поли (АДП-рибоза) полимераза.

ЦТПГ-В појачава активност каспазе-3, каспазе-7, каспазе-9 и ПАРП. Ослобађање цитохрома ц услед редукције Δψм могло би да активира протеазе каспазе да изазову апоптозу (29,30,37). Након третмана ЦТПГ-В током 24 х, активација каспазе-3, 7, 8, 9 и ПАРП је откривена Вестерн блот анализом. У поређењу са контролном, нивои цепане каспазе-9, цепане каспазе-7, цепане каспазе-3 и цепане-ПАРП, али не и нивоа цепане каспазе{{20 }}, регулисани су ЦТПГ третманом на начин који зависи од дозе (слика 7). Ови резултати су показали да ЦТПГ-В смањује Δψм и подстиче ослобађање цитокрома ц да би активирао каспазе које индукују апоптозу Еца-109 ћелија.

Дискусија

Традиционални ЦХМ би могао да изазове апоптозу ћелија рака једњака кроз различите путеве, укључујући рецепторе екстринзичне смрти, и интринзичне путеве стреса митохондријалног и ендоплазматског ретикулума (29). Наша претходна студија је показала да ЦТПГ, као главна компонента Ц. тубулоса, инхибира раст ћелија меланома Б16-Ф10 путем индукције апоптозе путем митохондријалног пута (24). У овој студији, истражен је антитуморски ефекат ЦТПГ-В на Еца-109 ћелије и утврђено је да ЦТПГ-В потискује раст Еца-109 ћелија, изазива апоптозу и заустављање ћелијског циклуса, смањен Δψм, повећано ослобађање цитокрома ц и активиране каспазе. ЦТПГ и ЦТПГ-В могу изазвати апоптозу и заустављање ћелијског циклуса у ћелијама рака. Међутим, тачни механизми су различити због различитих компоненти ЦТПГ-а (26,64% ехинакозида, 10,19% актеозида и 1,71% изоактеозида) и ЦТПГ-В (39,16% ехинакозида и 2,44% актеозида). ЦТПГ је зауставио Б16-Ф10 ћелије у Г0/Г1 фазама, али ЦТПГ-В је зауставио Еца{26}} ћелије у С фази (24). Производња РОС-а је дозно-зависно повећана ЦТПГ-ом, али је указивала на промену на временски зависан начин високом дозом ЦТПГ-В, која се значајно повећала на почетку третмана ЦТПГ-В (2-6 х) и значајно се смањио након 12 х, у поређењу са контролом. Могући разлог је тај што је главна компонента ЦТПГ-В ехинакозид. Неколико студија је известило да ехинакозид може инхибирати производњу РОС-а и апоптозу изазвану РОС-ом да би показао своје неуропротективне ефекте и ефекте против старења (38-40). Слично, у овој студији примећена је активност уклањања слободних радикала. Стога се спекулисало да би неке компоненте, укључујући вербаскозид, изо-вербаскозид и салидрозид у високој дози ЦТПГ-В, могле одмах да индукују генерисање РОС да изазову апоптозу Еца-109 ћелија (41,42), а затим РОС је уклонио ецхинакозид. Други могући разлог за разлике у производњи РОС од стране ЦТПГ и ЦТПГ-В је тај што су у овој и претходној студији коришћене различите ћелијске линије (24). Донг и сарадници (43) су известили да ехинакозид може да индукује апоптозу хуманих ћелија колоректалног карцинома СВ480 кроз стварање оксидативног оштећења ДНК без повећања нивоа РОС.

Третман ЦТПГ-В смањио је Δψм и изазвао ослобађање цитокрома ц, који промовише цепање каспазе-9 (28). Конзистентно, нивои цепане каспазе-9 су били повећани ЦТПГ-В третманом. Након тога, активна каспаза-9 може да активира каспазу-3 да изазове апоптозу (44). Нивои цепане каспазе-3 су такође повећани ЦТПГ-В третманом. Међутим, каспаза-8 није активирана од стране ЦТПГ-В, што указује да пут екстринзичног рецептора смрти није био укључен у апоптозу изазвану ЦТПГ-В. Ова запажања указују на то да ЦТПГ-В индукује апоптозу Еца-109 ћелија кроз активацију митохондријалног пута.

ПАРП има важну улогу у геномској стабилности и може се цепати активним каспазама, посебно каспазом-3 и -7 (45). Утврђено је да третман ЦТПГ-В активира каспазу-3 и -7, који могу да цепају ПАРП да инхибирају поправку ДНК и изазову апоптозу.

ЦТПГ-В такође, зависно од дозе и времена, потискује раст ћелија хуманог хепатоцелуларног карцинома БЕЛ-7404 (необјављени подаци). Иако ЦТПГ-В инхибира раст Еца-109 и БЕЛ-7404 ћелија, он промовише пролиферацију спленоцита, што може бити због садржаја полисахарида (~50%) у ЦТПГ-В (46 ). Слично томе, неколико студија је известило да полисахариди могу да подстичу пролиферацију спленоцита (46-49). У моделу миша, утврђено је да ЦТПГ-В значајно повећава индекс слезине, у поређењу са контролном групом, али није утицао на телесну тежину и индексе других органа укључујући срце, јетру, бубреге и плућа (необјављени подаци), што указује да ЦТПГ-В нема цитотоксични ефекат на нормалне ћелије.

Колективно, подаци указују да ЦТПГ-В инхибира раст Еца{1}} ћелија индукцијом апоптозе путем митохондријално зависног пута

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%