Цистанцхе Тубулоса штити допаминергичке неуроне кроз регулацију апоптозе и неуротрофног фактора који потиче од глијалних ћелија: ин виво и ин витро-Ⅰ

УВОД

Паркинсонова болест (ПД) је уобичајена неуродегенеративна болест која се јавља код старијих особа са патолошким манифестацијама губитка допаминергичких неурона у супстанцији нигра (СН) услед дегенерације. Озбиљност болести је у корелацији са губитком неуронских ћелија допамина (ДА) у СН, што је у складу са ставом да неуродегенеративнипроцес напредује много година пре него што се појаве било какви симптоми (Савле и Миерс, 1993). Прогресивна природа болести сугерише занимљиве могућности за терапијску интервенцију блокирањем основног неуродегенеративног процеса. Потрага за терапијским индукованим снажним и специфичним деловањем неуротрофних фактора на преживљавање ДА неурона је стога од великог интереса.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЗАШТИТУ ДОПАМИНЕРГИЈСКИХ НЕУРОНА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Неуротрофни фактори су есенцијални протеини, укључујући фактор раста нерава (НГФ), неуротрофни фактор који потиче из мозга (БДНФ) и неуротрофни фактор изведен из глијалних ћелија (ГДНФ), који промовишу раст нерава, неуролошки развој, аксонско вођење и функцију неурона. Међу свим неуротрофним факторима који штите и промовишу поправку допаминергичких неурона, ГДНФ има најјаче ефекте (Хонг ет ал., 2008; Рангасами ет ал., 2010; Аллен ет ал., 2013). Показало се да ГДНФ поседује моћне неуротрофне ефекте на ДА неуроне ин витро (Лин ет ал., 1993) и да испољава неуропротективне ефекте ин виво. Показало се да ГДНФ спашава нигралне ДА неуроне од ћелијске смрти изазване лезијом након хируршке или токсином изазване аксотомије код пацова (Бецк ет ал., 1995; Кеарнс и Гасх, 1995; Сауер ет ал., 1995) и делимично након системска администрацијаН-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин (МПТП)код мишева (Томац ет ал., 1995). Повећана инциденција неуронске апоптозе и смањени заштитни ефекти неуротрофичних фактора, потенцијално изазвани различитим патолошким факторима, леже у основи дегенерације допаминергичких неурона (Холден ет ал., 2006).

Ц. тубулоса је биљни лек који потиче од неколико биљака рода Цистанцхе. То је главна терапијска опција за синдром недостатка бубрега који је уско повезан са андрогеним хормонима у традиционалној кинеској медицини (ТЦМ). До данас, многа клиничка и основна истраживања о Ц. тубулоса показала су активност неуродегенеративних болести. Идентификација ТЦМ рецепата који тонизирају бубреге у лијечењу ПД може стога пружити алтернативни клинички третман за ПД.ехинакозид (ЕЦХ)је главна биоактивна компонента која се налази у лековитој биљци Ц. тубулоса. Студије су показале терапеутске ефекте гликозида Цистанцхе и ЕЦХ,вербаскозид(ВЕР) и ицариин (ИЦА) на Алцхајмерову болест (АД), ПД и друге пацијенте са васкуларном деменцијом (Урано и Тохда, 2010; Ванг ет ал., 2013; Ву ет ал., 2014). Ву ет ал. (2014) су сугерисали да екстракти Ц. тубулоса који садрже довољно ЕЦХ и актеозида побољшавају когнитивну дисфункцију узроковану А -42 тако што блокирају таложење амилоида и преокрећу холинергичку и хипокампалну допаминергичку неуронску функцију. Тао ет ал. (2015) су то утврдилифенилетаноидни гликозидииз Ц. тубулоса (Пх Гс-Цт) спречио је церебрални едем на великој надморској висини смањењем експресије протеина и мРНК АКП4 у можданом ткиву модела пацова.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЕКСТРАКТ ГРИЗКЕ ПОБОЉШАВАЈУ ПАМЋЕЊЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Претходне студије су показале да кинеска биљна једињења, укључујући три састојка Ц. тубулоса, епимедиум и рхизома полигонати, ублажавају оштећење допаминергичких неурона и повећавају нивое допамина регулацијом експресије неуротрофних фактора (Ву ет ал., 2013). Дакле, још увек није познато да ли су неуропротективни ефекти изазвани Ц. тубулоса дуготрајни и у којој мери спасавање нигралних ДА неурона применом ГДНФ може приуштити значајно очување моторичког понашања од значаја за симптоматологију ПД животиња. Ова студија је користила ТЦМ рецепт за тонирање бубрега, Ц. тубулоса наноповдер, који је добио национални патент (број патента: 2011103028541) у Кини и раније је показао одређени терапеутски ефекат у ПД. Ова студија је стога осмишљена да испита неуропротективне и регенеративне ефекте третмана Ц. тубулоса и да истражи апоптозу на МЕС23.5 ћелијама и бихевиоралним дефинитивним пацовима, као и регулацију ГДНФ-а, мерено низом циљних тестова. .

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Материјали, реагенси и опрема

Ц. тубулоса је купљен од Беијинг Тонг Рен Танг Гроуп, Цо., Лтд., Пекинг, Кина. ЕЦХ, ВЕР и ИЦА долазе из Националног института за контролу хране и лекова, Кина. МЕС23.5 допаминергичка неуронска ћелијска линија је поклон професора Биао Цхена, Лабораторије за неуробиологију, Медицински универзитет главног града, Пекинг, Кина. Педесет мушких мишева Ц57БЛ/6 (тежине 20–25 г сваки) купљено је од Схангхаи СЛАЦ Лаборатори Анимал Цо., Лтд. (број лиценце: СЦКСК2012-0002), Шангај, Кина.

МПП+, МТТ и глутамин су купљени од Сигма-Алдрицх (Карлсбад, Калифорнија, САД); ДМЕМ/Ф12 медијум и фетални говеђи серум су набављени од Гибцо Цо. (Лифе Тецхнологиес, ​​Царлсбад, ЦА, УСА); и МПТП, ДА стандард и стандард хомованилне киселине (ХВА) купљени су од Сигма-Алдрицх (Карлсбад, Калифорнија, САД). -актин, Бак, Бцл2, ГДНФ, ГДНФ фамилија рецептора алфа (ГФР 1) и Рет антитела су купљена од Целл Сигналинг Тецхнологи, Инц. (Беверли, МА, САД); 3,3'-диаминобензидин (ДАБ) комплет реагенса за бојење је купљен од Фузхоу Маикин Биотецх., Лтд. (Фујиан, Кина); и СДС-ПАГЕ комплет за припрему узорака гела, комплет за детекцију ултраосетљиве побољшане хемилуминисценције (ЕЦЛ) и тест бицинхонинске киселине (БЦА) купљени су од Беиотиме Институте оф Биотецхнологи (Пекинг, Кина).

Ова студија је користила следеће инструменте: ЕЛКС800 читач микроплоча (Био Тек Винооски, ВТ, САД); ЦО2 инкубатор (Хераеус, Ханау, Немачка); Гел ДОЦ 2000 систем за анализу гела, ћелија за електрофорезу и резервоар за електрофорезу (Био-Рад, Херцулес, Калифорнија, САД); ДУ-650 анализатор протеина (Бецкман Цоултер, Инц., Фуллертон, ЦА, САД); 5417Р брза расхладна центрифуга (Еппендорф, Хамбург, Немачка); СКСКМ двоструки планетарни куглични млин (Цхангсха, Тенцан Повдер Тецхнологи Цо., Лтд, Хунан, Кина); Млин мешалица ММ400 (Ретсцх ГмбХ, Хаан, Немачка); Агилент 1200 течна хроматографија високих перформанси (ХПЛЦ; Агилент Тецхнологиес, ​​Санта Цлара, Калифорнија, САД); ПоверПац Басиц електрофореза, ПоверПац Басиц трансмембрански трансфер систем, Универсал Хоод ИИ хемилуминисцентни снимач, С1000 Тхермал Цицлер РНА систем реверзне транскрипције (Био-Рад); Мотиц Мед 6.0 систем за анализу слике ткива и ћелија (Мотиц Цхина Гроуп, Цо., Лтд, Ксиамен, Кина).

ПрипремаЦ. тубулосаНанопрах

Ц. тубулоса је измерена, затим пречишћена и дехидрирана. Након конвенционалног уситњавања, фини прах Ц. тубулоса је пропуштен кроз 200-мрежасто сито и осушен замрзавањем. За припрему нанопраха Ц. тубулоса коришћени су вакуумски и високоенергетски млин са контролисаном температуром. Прво, сирови нанопрашак Ц. тубулоса је стављен у вакуумски резервоар за млевење који је био напуњен карбидним куглицама за млевење. Однос између куглица за млевење и нанопраха Ц. тубулоса кретао се од 15:1 до 5:1. Да би се добио фини прах, брзина и трајање високоенергетског лоптастог млина су подешени на 300 о/мин и 20 мин, респективно. Фини прах је ваган за обраду наноматеријала и обрађен у миксерском млину са фреквенцијом од 25/с и осцилацијом од 20с у три понављања. ПБС је коришћен за растварање и припрему основног раствора од 25 мг/мЛ, након чега је уследило 30 минута ултразвучне обраде, аутоклавирања и коначно складиштења на -20 ◦Ц.

Контрола квалитета активних компонентиЦ. тубулосапомоћу ХПЛЦ

ЕЦХ и ВЕР су садржали градијент елуације са октадецилсиланом везаним силицијум диоксидом као пунилом, метанолом као мобилном фазом А и 0.1% раствором мравље киселине као мобилном фазом Б. Таласна дужина детекције била је 330 нм. ИЦА је садржала градијент елуирања са октадецилсиланом везаним силицијум диоксидом као пунилом и ацетонитрил-вода (30:70) као мобилну фазу. Таласна дужина детекције била је 270 нм. Узорак, контрола и негативна контрола су измерени као по 10 µЛ за тест.

Ћелијска култура и МТТ тест за мерење одрживости МПП+-Третиране ћелије

Ћелије МЕС23.5 су инокулисане са 5% феталног телећег серума, 1% глутамина, 2% 50× Сато-овог раствора и ДМЕМ/Ф12 медијумом са 2% пеницилина/стрептомицина. Инкубирани су на 37◦Ц у инкубатору са 5% ЦО2 са засићеном влажношћу. Ћелије су изоловане и пасиране са 0,25% трипсина и ћелијска суспензија је сакупљена у фази логаритамског раста. Изоловане ћелије са густином од 1 × 105 су засејане у плоче обложене полилизином 96- бунарића, након чега је уследило додавање различитих коначних концентрација (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 и 800 µмол/Л ) МПП+ медија. МЕС23.5 ћелије које су инкубиране са нормалним медијумом културе 24 х и 48 х коришћене су као негативне контроле у ​​ин витро експериментима. Ћелије из различитих група за третман су инкубиране са МТТ реагенсом 4 х. Раствор у бунарчићима је затим одбачен и додато је 150 уЛ ДМСО и осцилује 10 мин. Апсорбанција сваког узорка на таласној дужини од 570 нм је мерена коришћењем аутоматског читача микроплоче. Проценат виталности ћелије (%)=средња апсорпција експерименталне групе/средња апсорпција негативне контролне групе × 100%.

Релевантне концентрације МПП+ медијума су додате за 24-сатни третман у ћелијама МЕС23.5 користећи исти приступ као за ин витро културу. Након третмана, раствор у бунару је одбачен. Подлога која садржи различите концентрације (10, 50, 100, 200, 250, 500 и 1000 µг/мЛ) нанопраха Ц. тубулоса додата је ћелијама МЕС23.5 у различитим бунарчићима и остављена да се инкубира 24 х и 48 х. Ћелије МЕС23.5 које су инкубиране са нормалним медијумом културе 24 х и 48 х коришћене су као негативне контроле. Ћелије МЕС23.5 које су инкубиране са МПП+ медијумом коришћене су као носач. Мерења су обављена у три примерка за сваки узорак. Апсорбанција одговарајућих третманских и контролних група је мерена да би се израчунала виталност ћелија.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЕКСТРАКТ АНТИ УМОРУ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Експресија ТХ мерена имуноцитохемијом

Када је нанопрашак Ц. тубулоса био у 100, 200 и 250 µг/мл, стопа преживљавања ћелија се значајно повећала (Слика 2Г). Стога смо у наредним експериментима тестирали три концентрације: групе са ниском дозом, са средњом дозом и са високом дозом. Три репликације су тестиране за сваку од група Ц. тубулоса. Стерилизована, полилизином обложена покривна стакла су стављена у 6- плоче са бунарима. Затим је 5 × 104 ћелија засејано у сваки бунар и инкубирано 24 х. Конвенционални свеж медијум је замењен у нормалној контролној групи и коначна концентрација од 100 µмол/Л МПП+ медијума је замењена у преосталим третираним групама да би се инкубирала 24 х. Конвенционалне свеже подлоге су затим замењене нормалном контролном и вехикулумом, а коначне концентрације од 100, 200 и 250 µг/мЛ нанопраха Ц. тубулоса су инкубиране са ћелијама током 24 х у ниским, умереним и високим дозама. Групе за лечење Ц. тубулоса, респективно. Ћелије МЕС23.5 у различитим групама су испране три пута у ПБС-у да би се уклонио супернатант и даље фиксиране у 4% параформалдехиду током 15 минута. После испирања са ПБС, ћелије су инкубиране са блокатором пероксидазе на 37°Ц током 30 мин, а затим поново испране са ПБС. 0,2% раствор Тритон Кс-100 је коришћен за пермеабилизацију ћелија током 10 минута, након чега је уследило испирање са ПБС. У сваки узорак је додат нормалан козји серум и инкубиран на собној температури 30 мин. Нормални козји серум је затим уклоњен и примарно антитело разблажено 1:400 у ПБС је додато сваком узорку и инкубирано на 4°Ц преко ноћи. Ћелије у негативној контролној групи су инкубиране са ПБС на 4°Ц преко ноћи. После испирања са ПБС, ћелије су инкубиране са секундарним антителима обележеним биотином у комори за влагу на 37 ◦ Ц током 20 мин. Сваки узорак је затим испран у ПБС и обележен коњугатима пероксидаза-стрептавидин рена (радни раствор Ц) на 37°Ц током 20 мин. Након испирања са ПБС, ћелије су обојене ДАБ реагенсом у мраку отприлике 1-10 мин, а развој браон боје је праћен светлосном микроскопијом. Сваки узорак је затим испран два пута у дестилованој води током 1-2 мин, а језгра су обојена раствором хематоксилина у трајању од 0,5-1 мин. Након темељног испирања сваког узорка у води, ћелије су потопљене у 1% алкохол хлороводоничне киселине за диференцијацију и 1% водени раствор амонијака, након чега је следило темељно прање ћелија у води. Ћелије из сваког узорка су затим дехидриране у 70% етанолу током 2 минута, 80% етанолу током 2 минута, 90% етанолу током 2 минута два пута, 95% етанолу током 2 минута два пута и 100% етанолу током 2 минута два пута. Ћелије су затим два пута потопљене у раствор ксилена на 2 мин и постављене на стакло са неутралним смолама. Под светлосном микроскопијом, сваки узорак је подвргнут снимању слике и насумичном одабиру 5-10 ефективних видних поља да би се одредила експресија одабраних протеина у допаминергичким неуронима назначена интензитетом смеђих честица и да би се полуквантификован садржај протеина према његовој просечној сивој вредности .

Стопа апоптозе ћелија МЕС23,5 мерена проточном цитометријом

Адхерентне ћелије су једном испране са ПБС. За изолацију ћелија, додата је одговарајућа количина раствора трипсина без ЕДТА на собној температури и раствор је нежно пипетиран да би се омогућило да се прилепљене ћелије одвоје. Затим је додат медијум ћелијске културе да се заустави трипсинизација. Смеша је пребачена у нову епрувету за центрифугирање и затим центрифугирана 5 минута на 1500 рпм да би се сакупиле изоловане ћелије. Након одбацивања супернатанта, ћелијска пелета је нежно ресуспендована коришћењем ПБС-а и ћелије су избројане. Приближно 1 × 105 до 5 × 105 ресуспендованих ћелија је центрифугирано 5 минута на 1500 рпм и супернатант је одбачен. Пет микролитара анексин В-ФИТЦ везујућег раствора је додато у ћелијску пелету да би се ћелије нежно ресуспендовале. Додато је још 5 µЛ Анексина В-ФИТЦ и темељно измешано. Пет микролитара раствора пропидијум јодида коришћено је за бојење ћелија инкубацијом на собној температури 10 минута непосредно пре проточне цитометрије.

Вестерн блот анализа заин витро

Ћелије су подељене у нормалну групу, МПП+ групу за третман, ниске дозеЦ. тубулосагрупа за лечење, група за лечење умерене дозе Ц. тубулоса и група за лечење Ц. тубулоса са високим дозама. Експресија Бцл2 и Бак је мерена у сваком. Укупно 1 × 105 ћелија по бунарчићу у 6-плочи са бунарима коришћено је за моделовање и третман у свакој групи пре сакупљања ћелија. Мешани лизат, који садржи РИПА пуфер, инхибитор протеазе и инхибитор фосфатазе, додат је да се ћелије лизе 30 мин на леду. Након центрифугирања, супернатант је коришћен за анализу протеина. Укупни протеин је квантификован коришћењем БЦА теста и раздвојен са 10% СДС-ПАГЕ. Одвојени протеини су пребачени на мембрану и инкубирани са 5% пуфером за блокирање обраног млека на собној температури током 2 х. Мембрана је затим инкубирана у примарном антителу (Бцл-2 0.34 мг/мл, Бак 0,11 мг/мл, разблажење 1:200) на 4◦Ц преко ноћи. Након корака испирања, мембрана је инкубирана у секундарном антителу (0,5 мг/мл, 1:5000 разблажења) на 4°Ц током 1 х, а затим у ЕЦЛ развијачу током 2 минута за конвенционални развој. За семи-квантитативну анализу експресије протеина коришћен је софтвер Куантити Оне.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЗАШТИТУ ЈЕТРА ПРОТИВ ЗАМОРА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Експериментално моделирање животиња и управа за лекове

Педесет мушких мишева без специфичних патогена 8-недеља старих насумично је подељено у пет група: нормална група, група за лечење МПТП (возило), група за лечење ниском дозом Ц. тубулоса, третман са умереном дозом Ц. тубулоса група и група за лечење високе дозе Ц. тубулоса. Животиње су биле смештене на 20–22◦Ц са слободним приступом храни и води. Мишевима у нормалној групи интраперитонеално је убризгана једнака запремина нормалног физиолошког раствора седам узастопних дана. Мишевима у другим третираним групама интраперитонеално је убризган МПТП (30 мг/кг/д) током седам узастопних дана да би се успоставили вехикулум.

Током ПД моделирања, мишевима у групама за лечење ниским, умереним и високим дозама Ц. тубулоса интрагастрично су даване еквивалентне клиничке запремине од 4 г/кг/д, 8 г/кг/д и 16 г/ кг/дЦ. тубулоса нанопрах, односно 14 узастопних дана. Мишевима у контролној групи и групама носача интрагастрично су даване еквивалентне количине нормалног физиолошког раствора током 14 узастопних дана. Све експерименталне процедуре су одобрене од стране Етичког комитета Универзитета Фујиан ТЦМ и спроведене су у складу са међународно прихваћеним принципима за употребу и негу лабораторијских животиња. У овој студији уложени су сви напори да се минимизира патња животиња.