Екстракт Цистанцхе Десертицола повећава формирање костију у остеобластима--И део

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Те-Мао Ли^aет а

Апстрактан
Циљеви Истражили смо ефекатЦистанцхедесертицолаМа. (ЦД) укљученкостформацијакултивисаним остеобластима. Методе Тест формирања минерализованих нодула је коришћен за испитивање ин витро ефеката ЦД-а(Цистанцхедесертицола)накостформација. Експресија алкалне фосфатазе (АЛП), морфогенетских протеина костију (БМП)-2 и експресије мРНК остеопонтина (ОПН) анализирана је квантитативном ланчаном реакцијом полимеразе у реалном времену. Механизам деловања ЦД-а(Цистанцхедесертицола)екстракт је истражен коришћењем Вестерн блотинга. Анти-остеопоротски ефекат ЦД-а ин виво(Цистанцхедесертицола)екстракт је процењен код мишева са овариектомијом.
Кључни налази

ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт није имао утицаја на пролиферацију, миграцију или зарастање рана култивисаних остеобласта, али је повећао АЛП, БМП-2 и ОПН мРНА и минерализацију костију. Митоген-активирана протеин киназа (МАПК) или инхибитори нуклеарног фактора (НФ)-кБ смањују ЦД(Цистанцхедесертицола)изазване екстрактомформирање костијуи АЛП, БМП-2 и ОПН израз. Међутим, ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт није утицао на остеокластогенезу. Поред тога, ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт спречио губитак кости изазван овариектомијом ин виво.
Закључци

ЦД(Цистанцхедесертицола)може бити романформирање костијусредство за лечење остеопорозе.

Кључне речиформирање костију; Цистанцхедесертицола; кинеска биљка; остеобласти

Цистанцхе десертицолаје добро заформирање костију

Увод

Кост је сложено ткиво састављено од неколико типова ћелија које пролазе кроз континуирани процес обнављања и поправке који се назива 'ремоделирање кости'. Два главна типа ћелија одговорна за ремоделирање кости су остеокласти, који ресорбују кост, и остеобласти, који формирају нову кост. Ремоделирање костију регулише неколико системских хормона (нпр. паратироидни хормон, 1, 25-дихидрокси витамин Д3, полни хормони и калцитонин) и локални фактори (нпр. азотни оксид, простагландини, фактори раста и цитокини).[1] Остеопороза настаје када су ресорпција и формирање кости некоординисане и вишак разградње кости превазилази изградњу кости.[2] Тренутни третмани за остеопорозу укључују бисфосфонате, калцитонин и естроген, који су инхибитори ресорпције костију који одржавају коштану масу инхибирајући активност остеокласта.[3] Међутим, ефекат ових лекова на повећање или опоравак коштане масе је релативно мали, свакако не више од 2 процента годишње.[3] Стога постоји потреба за средствима за изградњу костију, као што је терипаратид, који стимулишу новекостформацијаи кориговати промену трабекуларне микроархитектуре која је карактеристична за успостављену остеопорозу.[4,5] Јер нова.костформацијаје првенствено функција остеобласта, агенси који делују или повећањем пролиферације ћелија остеобластне лозе или индукујући диференцијацију остеобласта могу да појачају формирање кости.[5,6]
Иако механизми остеопорозе остају нејасни, они су вероватно повезани са смањеном доступношћу или ефектима фактора раста костију, као што су коштани морфогенетски протеини (БМП).[7] БМП, који су структурно повезани са трансформишућим фактором раста-б суперфамилије, првобитно су идентификовани по њиховом капацитету да изазову ектопичнукост формацијакод глодара.[8] БМП играју важну улогу укостформацијаи диференцијацију коштаних ћелија стимулацијом активности алкалне фосфатазе (АЛП), као и синтезом протеогликана, колагена и остеопонтина (ОПН).[9] Недавна студија је открила везу између остеопорозе и специфичних полиморфизама у генима БМП-2, АЛП и ОПН, што сугерише да су повезани са развојем остеопорозе.[10]

ЦистанцхедесертицолаМа. (Оробанцхацеае; скраћено као ЦД)(Цистанцхедесертицола)је аутохтона биљка у Кини и широко се користи у традиционалној медицини као терапеутско средство због својих седативних, аналгетичких и имуностимулативних својстава.[11] Савремене фармаколошке студије су показале да ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракти могу да стимулишу имунитет,[12] уклањају слободне радикале[13] и повећавају активност супероксид дисмутазе.[14] Анти-инфламаторни и антиоксидативни агенси имају потенцијал за лечење остеопорозе повећањемкост формацијаи/или сузбијање ресорпције кости.[15,16] Међутим, ефекат ЦД-а(Цистанцхедесертицола)о функцији коштаних ћелија још није утврђено. Ево, пријављујемо тај ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт није утицао на пролиферацију, миграцију или активност зарастања рана култивисаних остеобласта, али је повећао експресију АЛП, БМП-2 и ОПН и минерализацију костију. Поред тога, показујемо да сигнални путеви протеин киназе активиране митогеном (МАПК) и нуклеарног фактора (НФ)-кБ могу бити укључени у ЦД-посредовано повећање експресије гена и минерализације костију. Насупрот томе, ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт није потиснуо остеокластогенезу ин витро. Посебно, третман мишева са ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстракт спречио губитак коштане масе изазван овариектомијом ин виво. Наши подаци, дакле, сугеришу да ЦД(Цистанцхедесертицола)може се користити за стимулацијукостформацијаза лечење остеопорозе.

Цистанцхе десертицолаојачати имунитет

Материјали и методе

Екстракт и материјали Цистанцхе десертицола

ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт је купљен од Цхуанг Сонг-Зонг Пхармацеутицал Цомпани (Каохсиунг, Тајван). Екстракција и изолација ЦД-а(Цистанцхедесертицола)су праћени као што је претходно описано (на основу спектралних података идентификовали су хемијски састав укључујући бета-ситостерол, даукостерол, јантарну киселину, триаконтанол, актеозид, бетаин и полисахарид).[17] Зечја поликлонска антитела специфична за п-екстрацелуларне сигнално регулисане киназе (ЕРК), ЕРК, п-п38, п38, пц-Јун Н-терминалне киназе (ЈНК), ЈНК, п-п65 и п65 су купљена од Санта Цруз Биотецхнологи ( Санта Круз, САД). ЕЛИСА комплет за остеокалцин је купљен од Биосоурце Тецхнологи (Нивеллес, Белгија). Ц-терминални телопептиди ЕЛИСА комплета колагена типа И добијени су од Цросс Лапс-а (Херлев, Данска). Доминантно негативни мутант п38 обезбедио је др Ј. Хан (Соутх-Вестерн Медицал Центер, Даллас, УСА). ЈНК доминантно негативни мутант је обезбедила др М. Карин (Универзитет Калифорније, Сан Дијего, САД). ЕРК2 доминантно негативни мутант је обезбедио др М. Цобб (Соутх-Вестерн Медицал Центер). Сви остали реагенси су добијени од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, САД).

Ћелијска култура

Мишја ћелијска линија остеобласта МЦ3Т3-Е1 је купљена од Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ; Роцквилле, САД). Ћелије су узгајане у 95 процената ваздуха, 5 процената ЦО2 са а-МЕМ који је допуњен са 20 мм ХЕПЕС и 10 процената топлотно инактивираним феталним телећим серумом, 2 мм-глутамином, пеницилином (100 У/мл) и стрептомицином (100 мг /мл).

Мерење формирања минерализованих нодула

Формирање минерализованих нодула је процењено како је описано.[18] Укратко, остеобласти су култивисани у медијуму који је садржао витамин Ц (50 мг/мл) и б-глицерофосфат (10 мм) две недеље, а подлога је мењана свака три дана. После инкубације са ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстракта током 12 дана, ћелије су испране два пута са 20 мм Трис-пуферисаним физиолошким раствором који садржи 0,15 м НаЦл (пХ 7,4), фиксиран у ледено хладном 75% (в/в) етанолу током 30 минута, и ваздухом- осушене. Таложење калцијума је одређено коришћењем ализаринског црвеног-С бојења. Укратко, ћелије и матрикс фиксиране етанолом су обојени 1 х са 40 мм ализарин црвеним-С (пХ 4,2) и опширно испрани водом. Везана мрља је елуирана са 10 процената (в/в) цетилпиридинијум хлорида и ализарин црвени-С у узорцима је квантификован мерењем апсорбанције на 550 нм и упоређен са стандардном кривом. Један мол ализарин црвеног-С селективно везује приближно два мола калцијума.

Цистанцхе десертицолаје добро заформирање костију

Квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену

Укупна РНК је екстрахована из остеобласта коришћењем ТРИзол кита (МДБио Инц., Тајпеј, Тајван). Реверзна транскрипција је изведена коришћењем 2 мг укупне РНК и олиго(дТ) прајмера.[19,20] Квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену (кПЦР) је спроведена коришћењем ТакМан® једностепеног ПЦР Мастер Мик-а (Апплиед Биосистемс, Царлсбад, Царлсбад,). САД). Додата је укупна цДНК (100 нг по 25-мл реакцији) са прајмерима специфичним за секвенцу и Такман® сондама. Сви циљни генски прајмери ​​и сонде су купљени комерцијално, укључујући б-актин као интерну контролу (Апплиед Биосистемс). кПЦР тестови су изведени у три примерка на СтепОнеПлус систему за детекцију секвенци (Апплиед Биосистемс). Услови циклуса су били 10-мин активације полимеразе на 95 степени праћено 40 циклуса од 95 степени током 15 с и 60 степени током 60 с. Праг је постављен изнад контролне позадине без шаблона и унутар линеарне фазе амплификације циљног гена да би се израчунао број циклуса у којем је транскрипт откривен (означен ЦТ).

Вестерн блот анализа

Ћелијски лизати су припремљени како је претходно описано.[21,22] Протеини су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ и пребачени на Иммобилон поливинил дифлуоридне мембране (Миллипоре, Биллерица, САД). Мрље су блокиране са 4 процента говеђег серумског албумина током 1 х на собној температури, а затим испитане зечјим анти-хуманим антителима против п-65, или п-п65 (1:1000) током 1 х на собној температури. После три испирања, мрље су инкубиране са секундарним антителом магарца против зеца коњугованим с пероксидазом (1: 1000) током 1 х на собној температури. Мрље су визуелизоване појачаном хемилуминисценцијом коришћењем Кс-ОМАТ ЛС филма (Еастман Кодак, Роцхестер, САД).

Остеопороза изазвана оваријектомијом

За ову студију коришћене су женке ИЦР мишева, старе четири недеље, тежине 22~28 г. Мишеви су обострано овариектомирани под анестезијом са трихлороацеталдехидом (100 мг/кг), а контролни мишеви су лажно оперисани (Схам) ради поређења. Минерална густина костију и минерални садржај костију мерени су након оралне примене различитих концентрација ЦД-а(Цистанцхедесертицола)екстракт свака два дана током четири недеље. Укупна минерална густина костију у телу и минерални садржај костију одређени су двоенергетским рендгенским апсорпциометром (ДЕКСА; КСР-26; Норланд, Форт Аткинсон, САД) коришћењем режима за мале субјекте као што је претходно описано.[18, 23] Сви протоколи су били у складу са институционалним смерницама и одобрени су од стране Комитета за негу животиња Кинеског медицинског универзитета.

Статистичка анализа

Статистичка анализа је извршена коришћењем софтвера Присм 4.01. (ГрапхПад Софтваре Инц., Сан Дијего, САД). Дате вредности су средње вредности СЕМ. Статистичка анализа између два узорка обављена је коришћењем Студентовог т-теста. Статистичка поређења више од две групе вршена су коришћењем једносмерне анализе варијансе са Бонферонијевим постхоц тестом. У свим случајевима, П < 0,05="" се="" сматрало="">

Цистанцхе десертицолаје добро заформирање костију

Резултати

Цистанцхе десертицолаекстракт повећава минерализацију костију остеобластима Додавање ЦД-а(Цистанцхедесертицола)екстракт током 24 или 48 х није утицао на пролиферацију мишјих ћелија остеобласта МЦ3Т3-Е1 у МТТ тесту (подаци нису приказани). Пошто је диференцијација остеобласта сложен процес који укључује пролиферацију и миграцију ћелија, тестирали смо и миграциону способност МЦ3Т3-Е1 ћелија након третмана ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстракт. Користећи Трансвелл и тестове зарастања рана, пронашли смо тај ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт није утицао на миграцију остеобласта (подаци нису приказани). Формирање минерализованих нодула је један од маркера сазревања остеобласта. Бојење Ализарином црвеном С показало је да се минерализовани нодули формирају када су остеобласти култивисани две недеље у медијуму који садржи витамин Ц (50 уг/мл) и -глицерофосфат (10 мм), на начин који зависи од концентрације додавањем ЦД-а.(Цистанцхедесертицола)(Слика 1а). Стога, ЦД(Цистанцхедесертицола)екстраховањем изазвано формирање коштаних нодула култивисаним остеобластима, али не и њихову пролиферацију или миграцију. Такође смо испитали улогу ЦД-а(Цистанцхедесертицола)екстракт у остеокластогенези изазваној РАНКЛ-ом, али није нашао никакав ефекат (подаци нису приказани).

Екстракт Цистанцхе десертицола повећава алкалну фосфатазу, коштани морфогенетски протеин-2 и експресију остеопонтина у култивисаним остеобластима

Диференцирани остеобласти показују повишену активност АЛП, што је у корелацији са високим нивоом експресије ензима.[18] Нашли смо тај третман са ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстракт током 72 х значајно повећава активност остеобласта АЛП (слика 1б). С обзиром на кључну улогу БМП-2, АЛП и ОПН у диференцијацији остеобласта, тестирали смо да ли је ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт испољава свој ефекат на диференцијацију остеобласта регулацијом експресије БМП-2, АЛП и ОПН. Третман ћелија са ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстрахује повећану експресију мРНА АЛП, БМП-2 и ОПН на начин који зависи од концентрације (слика 1ц), показујући да ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракцијом индуковану диференцијацију остеобласта повећањем експресије АЛП, БМП-2 и ОПН.

Екстракт цистанцхе десертицола повећава формирање коштаних нодула кроз пут протеин киназе активиран митогеном

Пријављено је да МАПК игра важну улогу укостформација[24,25] па смо затим испитали да ли је овај сигнални пут укључен у ЦД(Цистанцхедесертицола)минерализација костију изазвана екстрактом. Предтретман ћелија са ЕРК инхибитором У0126, п38 инхибитором СБ203580 или ЈНК инхибитором СП600125 редукује ЦД(Цистанцхедесертицола)минерализација костију повећана екстрактом (слике 2а, 3а и 4а). Штавише, инхибитори су такође блокирали ЦД(Цистанцхедесертицола)Експресија АЛП, БМП-2 и ОПН изазвана екстрактом (Слике 2б–4ц). Трансфекција ћелија са ЕРК2, п38 или ЈНК мутантом редукованим ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстракт-повећање експресије мРНА АЛП, БМП-2 и ОПН (Слике 2ц, 3ц и 4ц). Затим смо директно испитали активацију ЕРК, п38 и ЈНК након ЦД-а(Цистанцхедесертицола)третман екстрактом. Инкубација ћелија са ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстрактом индукована фосфорилација ЕРК, п38 и ЈНК (слике 2д, 3д и 4д). Дакле, ЕРК, п38 и ЈНК посредују у повећањукостформацијаиндуковане ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)лечење остеобласта.

Екстракт Цистанцхе десертицола повећава формирање коштаних нодула путем нуклеарног фактора-кБ пута

Као што је раније поменуто, активација НФ-кБ је неопходна закостформација[26,27] Затим смо третирали остеобласте инхибиторима НФ-кБ пиролидин дитиокарбаматом (ПДТЦ) и Н-тозил-Л-фенилаланин хлорометил кетоном (ТПЦК) купљени су од Цалбиоцхем-а (Дармстадт, Немачка) да бисмо утврдили да ли је активација НФ-кБ активна. укључен у ЦД(Цистанцхедесертицола)минерализација костију изазвана екстрактом. Слика 5а показује да је предтретман остеобласта са ПДТЦ или ТПЦК инхибирао ЦД(Цистанцхедесертицола)формирање коштаних нодула изазвано екстрактом, а такође је смањило повећање експресије АЛП, БМП-2 и ОПН (Слике 5б и 5ц). Фосфорилација НФ-кБ п65 подјединице је индикатор активације НФ-кБ;[28] у складу са овим, открили смо да ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт је повећао фосфорилацију п65 у остеобластима (Слика 5д). Ови резултати су показали да је активација НФ-кБ важна за експресију АЛП, БМП-2 и ОПН-а изазвану екстрактом ЦД-а и формирање коштаних нодула.

Слика 4 Учешће ц-Јун Н-терминалних киназа (ЈНК) уЦистанцхедесертицола(ЦД) минерализација костију у остеобластима изазвана екстрактом. (а) Ћелије су постављене у 24- плоче са бунарима и култивисане у медијуму који садржи витамин Ц (50 мг/мл) и б-глицерофосфат (10 мМ) током две недеље. Ћелије су истовремено третиране ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстракт (26 мг/мл) плус СП600125 (3 мМ). Формирање минерализованих нодула је процењено ализаринским црвеним-С бојењем (н=5). (б, ц) Ћелије су претходно третиране СП600125 током 30 минута или трансфициране са ЈНК мутантом или 24 х, након чега је уследила стимулација са екстрактом ЦД-а, и активности алкалне фосфатазе (АЛП) и АЛП, коштаног морфогенетског протеина (БМП)-2 и Експресија мРНА остеопонтина (ОПН) мерена је помоћу АЛП комплета и квантитативне ланчане реакције полимеразе у реалном времену. (д) Ћелије су третиране ЦД екстрактом у назначеним временским интервалима, а експресија п-ЈНК је испитана Вестерн блот-ом. *П< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Цистанцхедесертицола)група третирана екстрактом.

Инхибиција губитка костију екстрактом Цистанцхе десертицола код мишева са овариектомијом

Да испитамо ефекат ЦД-а(Цистанцхедесертицола)екстракт на губитак костију, остеопороза је индукована код женки мишева овариектомијом. Као што се очекивало, мишеви са овариектомијом показали су смањену укупну минералну густину костију тела и садржај минерала у костима (Слике 6а и 6б). Третман ЦД-ом(Цистанцхедесертицола)екстракт током четири недеље инхибирао је губитак минералне густине костију и минералног садржаја кости на начин зависан од дозе (Слике 6а и 6б). Концентрације АЛП у крви могу одражавати остеобластну активност.[29] Као што је приказано на слици 6ц, ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт инхибирао смањење активности АЛП у серуму изазвано овариектомијом. Поред тога, ЦД(Цистанцхедесертицола)екстракт такође повећава ниво остеокалцина, маркеракостформација, и смањио ниво Ц-терминалних телопептида колагена типа И, маркера ресорпције костију (Слике 6д и 6е). Ови налази стога подржавају моћ и ефикасност ЦД-а(Цистанцхедесертицола)екстракт у спречавању губитка кости ин виво.

Слика 6 Инхибиција овариектомије изазвана смањењем минералне густине костију и минералног садржаја костијуЦистанцхедесертицола(ЦД) екстракт. Женке ИЦР мишева су подвргнуте лажној операцији или су овариектомизиране. Мишеви са оваријектомијом су третирани назначеним концентрацијама ЦД-а(Цистанцхедесертицола)екстракт оралним храњењем. Укупна минерална густина костију тела (а), садржај минерала у костима (б), активност серумске алкалне фосфатазе (АЛП) (ц), серумски остеокалцин (д) и серумски Ц-терминални телопептиди колагена типа И (е), одређени су четири недеље након операције. Подаци су представљени као средња вредност СЕ, н=8–10 мишева/група. *П < 0.05,="" у="" поређењу="" са="" лажним;="" #п=""><0,05, у="" поређењу="" са="" групом="" са="">

ДИСКУСИЈА

Кликните овде за информације о делу ИИ (Дискусија и закључак) овог чланка.

Од: 'Цистанцхедесертицолаекстракт се повећавакостформацијау остеобластима' поТе-Мао Ли^aет ал

---© 2012 Аутори. ЈПП © 2012 Роиал Пхармацеутицал Социети 2012Часопис за фармацију и фармакологију, 64, стр. 897–907