Цистаносиде оф Цистанцхе Херба ублажава репродуктивну штету изазвану хипоксијом код мушкараца преко супресије оксидативног стреса-Ⅰ

Увод

Тренутно је око 48,5 милиона (15%) парова у репродуктивном добу широм света погођено неплодношћу, међу којима се 40-50% случајева приписује мушкој неплодности, стању које је снажно повезано са факторима животне средине и животним стилом. Докази сугеришу да је осетљивост тестиса сисара на низак притисак кисеоника узрочни фактор у неким облицима мушке неплодности. Као што је показано у претходним студијама, сперматогенеза је оштећена и смањена након излагања хипобаричној хипоксији.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Да би се истражио основни механизам, студије су показале да изложеност хипобаричној хипоксији повећава производњу реактивних врста кисеоника (РОС). РОС игра важну улогу у мушком репродуктивном систему. На ниским нивоима, потребни су за капацитацију сперматозоида, реакцију акрозома и фузију сперматозоида и ооцита [10]. Међутим, прекомерни РОС може изазвати оштећење нуклеарне/митохондријске ДНК сперме и пероксидативно оштећење плазма мембране, што су заузврат главни етиолошки фактори заповећан ризик од мушке неплодности. Дакле, акумулација РОС-а изазваног хипоксијом може бити један од узрока мушке неплодности.

Цистанцхес Херба, вишегодишња паразитска лековита биљка, широко је распрострањена у сушним подручјима и широко се користи због својих фармаколошких активности. Међу свим ефективним садржајимаЦистанцхес Херба, ПхГс се сматрају главном активном компонентом. До данас су изолована 34 ПхГЦистанцхес биљке. Цистаносиде(Цис), активни ПхГ изолован изЦистанцхес Херба, добио је пажњу због својих антиоксидативних ефеката.

Узимајући у обзир антиоксидативне ефекте Цис и улогу РОС у мушкој неплодности изазваној хипоксијом, Цис се сматра потенцијалним кандидатом за лек за лечењемушка неплодност изазвана хипоксијом. Међутим, неколико извештаја се бавило антиоксидативним ефектима Цис екстрахованог из Цистанцхес Херба у лечењу мушке неплодности изазване хипоксијом или укључених сигналних путева. У овој студији конструисани су експериментални модели хипоксије ин витро и ин виво и процењене су компоненте дејства различитих Цис.

материјали и методе

Ћелијска култура и реагенс

Ћелијска линија сперматогоније миша ГЦ-1спг (ГЦ-1) је купљена од Америчке колекције типских култура (АТЦЦ) и култивисана у ДМЕМ (Инвитроген, САД) са додатком 10% феталног говеђег серума, 1% Л-глутамин (100 мМ), пеницилин (100 У/мЛ) и стрептомицин (100 уг/мЛ) на 37 степени у влажном инкубатору са 5% ЦО2. Цис (Цис-А, Б, Ц, Х) је купљен од Цхенгду Гелипу Биотецхнологи Цо., Лтд. (Кина).

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Тест виталности ћелија

Вијабилност ћелија је тестирана тестом комплета за бројање ћелија{{0}} (ЦЦК-8). Укратко, ГЦ-1 ћелије су засејане у 96-плоче са 1,5×103 по бунарчићу и култивисане на 37 степени током 24 х. Затим су ћелије третиране различитим концентрацијама (20%, 15%, 10%, 5%) кисеоника или различитим концентрацијама (2 μМ, 0,2 μМ, 0,02 μМ) Цис (Цис-А, Цис-Б, Цис- Ц, Цис-Х) за потребно време. Затим је супернатант одбачен, а виталност ћелија је откривена коришћењем ЦЦК-8 комплета (Дојиндо Јапан). Апсорбанца сваког базена је мерена на 450 нм коришћењем читача микроплоче (БиоРад УСА). Коначно, виталност ћелија је израчуната према следећој формули: Вијабилност ћелије=(ОД експериментална група - ОДбланк група)/ (ОД контролна група - ОДбланк група) × 100%.

Вестерн блот анализа

Сакупљене ћелије или ткива су хомогенизовани у РИПА пуферу за екстракцију протеина (РИПА Беиотиме Кина; Цоцктаил Роцхе Швајцарска). Сакупљени су супернатанти, а концентрација протеина је тестирана БЦА методом (Беиотиме). Приближно 40 уг екстрахованих протеина из сваког узорка је одвојено помоћу СДС-ПАГЕ и електротрансферирано на нитроцелулозну (НЦ) филтер мембрану (Беиотиме Цхина). НЦ филтер мембране су блокиране са 5% немасног млека током 1,5 х и инкубиране са специфичним антителима (анти-ПАРП 1:1000, антиЦаспасе-3 1:1000, анти-Бцл-2 1:1000, анти-Бак 1 :1000, анти-ГАПДХ 1:1000 сва антитела су купљена од Целл Сигналинг Тецхнологи, САД) преко ноћи на 4 степена; Затим су све НЦ мембране инкубиране са одговарајућим секундарним антителом коњугованим с пероксидазом рена 1,5 х на собној температури и снимљене помоћу система за снимање (Таннон, Кина).

Детекција ћелијског циклуса

Проточни цитометријски тест (ФЦМ) је изведен за анализу ћелијског циклуса. Ћелије су третиране под различитим условима током 72 х и сакупљене. Ћелије су затим испране са ПБС, фиксиране у 75% етанолу и обојене пропидијум јодидом (ПИ). За сваки узорак, 1×104 ћелије су сакупљене и анализиране проточном цитометријом (ФАЦС Цалибур, БД Биосциенцес). Затим је израчунат удео ћелија Г1/С/Г2 фазе и индекс пролиферације [Фаза(С+Г2)/Фаза(Г1+С+Г2) × 100%].

Ки-67 бојење

Ћелије су култивисане у конфокалној посуди и третиране хипоксијом или различитим подтиповима Цис током 72 х. Након фиксирања свих ћелија са 4% параформалдехида, оне су инкубиране са анти-Ки-67 антителом (1:200, технологија ћелијске сигнализације). Затим су све ћелије инкубиране са одговарајућим ЦИ-3-коњугованим анти-зечјим ИгГ антителом (1:200, Бостер, Кина) и раствором ДАПИ (1,0 уг/мЛ, Беиотиме). Флуоресценција је примећена помоћу конфокалног микроскопа Флуовиев ФВ1000 (Олимпус, Јапан).

ВРХУНСКИ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОВЕЋАЊЕ ТЕСТОСТЕРОН ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Детекција РОС

ФЦМ је уведен за мерење интрацелуларних нивоа РОС помоћу ДЦФХ-ДА. Суспендоване ћелије су засејане у 6-плоче са бунарима и подвргнуте различитим третманима. После 72 х третмана, ћелије су суспендоване у ДМЕМ без серума са 10 μМ ДЦФХ-ДА (Беиотиме). Садржај РОС је затим одређен сортирањем ћелија активираним флуоресценцијом на Бецкман Цоултер Флов Цитометријском систему са таласном дужином ексцитације од 488 нм и таласном дужином емисије од 525 нм [18].

Одређивање пероксидације липида (ЛПО)

Тест са реактивним супстанцама тиобарбитурне киселине (ТБАРС) је изведен да би се открио ЛПО. Сви оперативни кораци су изведени према упутствима (Сигма УСА). Концентрације су израчунате коришћењем коефицијента моларне екстинкције од 1,56×105/(М·цм), који је добијен коришћењем малондиалдехида као стандарда. Резултати су изражени као нмол МДА еквивалената/мг протеина.

Одређивање активности ензима

Активности ензима су тестиране коришћењем комплета за испитивање укључујући глутатион редуктазу (ГР), глутатион пероксидазу (ГПк) и супероксид дисмутазу (СОД). Сви оперативни кораци су изведени према приложеним упутствима (Нан Јинг Јиан Цхенг Биоенгинееринг Институте Цхина).

Животиње и експериментални протокол

Зрели мужјаци пацова Вистар (180-220 г, стари 8 в) су добијени из центра за животиње Четвртог војно-медицинског универзитета, Сиан, Кина. Дозвола за коришћење животиња добијена је од Етичког комитета Универзитета (позив на број: 20190506). Експеримент на животињама је спроведен према универзитетским смерницама за негу и употребу лабораторијских животиња.

Свим пацовима је дозвољено да се прилагоде отприлике 1 недељу пре почетка експеримента. Након аклиматизације, пацови су насумично распоређени у 6 група са по 5 животиња у свакој групи. Пацови у контролној групи су узгајани под нормалним притиском (ПО2: 20%; ваздушни притисак: 101,3 кПа), док су пацови у моделу и групама третираним Цис одгајани у комори са кисеоником ниског притиска (унутрашњи притисак од 61,6 кПа). , еквивалентно висини од 4000 метара изнад нивоа мора: 14,55%) за симулацију хипоксичне средине на великој надморској висини; Сви пацови су имали слободан приступ храни и води у пластичним кавезима на 22 ± 2 степена и условима влажности са аутоматским 12-х светло/тамним циклусом. Пацови у моделу и групама третираним са Цис-ом остали су у хипобаричним условима, али су пребачени у нормобаричне услове сваких 96 х, када им је обезбеђена храна и вода, а кавези очишћени. Трајање преласка са хипобаричне на хипобарично је било приближно 2 х. Све третиране групе су третиране одговарајућим Цис (8 мг/кг/д) путем оралне сонде током 8 недеља, док су контролни и модел пацови третирани са једнаком запремином воде.

После 8 недеља, пацови су жртвовани под анестезијом. Тестиси, епидидимис и семенске везикуле су одвојени и измерени, а индекс органа израчунат је према следећој формули: (тежина органа/маса животиње) × 100%. Затим су сакупљене сперме у епидидимису и испитана је њихова покретљивост и активност ензима акрозома. Слично, ткива тестиса су сакупљена за хистопатолошке студије и детекцију РОС, ЛПО и антиоксидативних ензима.

ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЕКСТРАКТ БИЉКЕ ЦИСТАНЦХЕ ПОВЕЋАВА СЕКС МОЋ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Процена количине живе сперме

Хируршким маказама је урезан епидидимис, а суспензија сперме је припремљена у нормалном физиолошком раствору. Да би се проценила количина живих сперматозоида, 5 μЛ суспензије сперме пажљиво је помешано са једнаком запремином боје еозина-И. Затим су сперматозоиди избројани под светлосним микроскопом. Стопе живе сперме су процењене израчунавањем обојене (мртве сперме) и необојене сперме (жива сперма).

Одређивање активности ензима акрозома сперме

Тест активности ензима акрозома сперме је коришћен за процену ензима акрозома сперме [19]. Резултати у свакој групи су израчунати коришћењем следеће формуле: Активност ензима акрозома (μИУ)=(ОДЕкперимент група - ОДБланк група)/(247,5×10) × 106.

Резултати

Ефекти хипоксије на ГЦ{0}} ћелије

Да бисмо утврдили ефекте хипоксије на заметне ћелије, прво смо испитали промене у виталности ћелија након третмана хипоксије различитим концентрацијама кисеоника (20%, 15%, 10% и 5%) за 1, 3, 5 , односно 7 дана. Резултати ЦЦК-8 анализе су показали да у поређењу са контролном групом (20% концентрације кисеоника), ћелије изложене хипоксији показују значајно смањење виталности (П < 0,01; Слика 1А). Штавише, њихова стопа преживљавања била је обрнуто пропорционална концентрацији кисеоника и даље се смањивала са временом индукције. Да би се избегао претерани цитотоксични ефекат, 10% концентрације кисеоника и 3-дневно време индукције изабрани су као критеријум хипоксичног модела за наредне ин витро експерименте.

Након тога, извршено је ФЦМ и имунофлуоресцентно бојење да би се даље проценила промена пролиферације ГЦ{{0}} ћелија под третманом хипоксије. Резултати су показали да хипоксија може да изазове заустављање ГЦ-1 ћелија у Г1 фази, чиме се смањује улазак ћелије у С фазу и инхибира репликација ДНК. Дакле, хипоксија је значајно смањила индекс пролиферације ГЦ-1 ћелија (П <0,01; Слика 1Б). Позитивно Ки-67 бојење је још један специфичан биомаркер ћелија које се размножавају. Стога смо такође испитали однос Ки-67-позитивних ћелија са или без третмана хипоксије. У поређењу са контролном групом, третман хипоксије је значајно смањио Ки-67- позитивне ћелије, као што је приказано на слици 1Ц.

Затим смо имали за циљ да истражимо начин инхибиције виталности ГЦ{{0}} ћелија изазване хипоксијом. Као што је објављено у литератури, ниво РОС се повећавао како су пацови били изложени хипобаричној хипоксичној средини [8, 20]. Стога су ендогени нивои РОС у ГЦ-1 ћелијама мерени коришћењем ФЦМ теста. Резултати су показали више РОС нивое под хипоксијом у поређењу са нормалном групом кисеоника (П < 0,01; Слика 1Д). Акумулирани РОС изазива значајно оштећење ДНК, што заузврат изазива активацију пута ћелијске апоптозе и може бити главни етиолошки фактор за повећање ризика од мушке неплодности [21, 22]. Затим смо детектовали апоптотички ефекат активације хипоксије на ГЦ-1 ћелије ТУНЕЛ бојењем. Као што је приказано на слици 1Е, третман хипоксијом је резултирао повећањем ТУНЕЛ флуоресценције у поређењу са контролном групом, што указује на повећање апоптозе у групи модела.

Пошто је оштећење ћелија изазвано РОС-ом обично узроковано ОС, додатно смо тестирали ОС ГЦ-1 ћелија. Као што је приказано на слици 1Ф, нивои ЛПО ћелија ГЦ-1 у групи модела су значајно повећани у поређењу са нивоима ЛПО ћелија ГЦ-1 у контролној групи. Ови налази сугеришу да би повреда ГЦ-1 ћелија изазвана хипоксијом могла бити повезана са ОС, која је индукована акумулацијом РОС.