Цлец12а ублажава упалу док ограничава ширење колитогеног коменсала

РЕЗИМЕ

Регулација микробиоте је кључна за здравље црева, али механизми које користи урођени имунитет остају нејасни. Овде показујемо да су мишеви са недостатком лектинског рецептора Ц-типа, Цлец12а развили тешки колитис, који је зависио од микробиоте. Студије трансплантације фекалне микробиоте (ФМТ) на мишевима без клица откриле су колитогену микробиоту формирану унутар Цлец12а-/- мишева који су обележени експанзијом грам-позитивног организма, глодара Фаецалибацулум. Третман са Ф. родентиум био је довољан да погорша колитис код мишева дивљег типа. Макрофаги унутар црева изражавају највише нивое Цлец12а. Анализа цитокина и секвенцирања у Цлец12а-/- макрофагима открила је појачану упалу, али значајно смањење гена повезаних са фагоцитозом. Заиста, Цлец12а-/- макрофаги су оштећени у својој способности да усвоје Ф. родентиум. Пречишћени Цлец12а је имао веће везивање за грам-позитивне организме као што је Ф. родентиум. Дакле, наши подаци идентификују Цлец12а као урођени механизам имунолошког надзора за контролу ширења потенцијално штетних комензала без очигледне упале.

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

УВОД

Састав и функција микробиоте могу имати дубок утицај на здравље и болест сисара (Фассарелла ет ал., 2021). Ово је добро документовано за инфламаторну болест црева (ИБД), где је већина мишјих модела ИБД осетљива на промене у саставу микробиоте (Гкоускоу ет ал., 2014). Разумевање фактора који утичу на стабилност микробиоте и усмеравају их на стабилност биће важно како се развијају терапије засноване на микробиоти (Схарма ет ал., 2020; Сорбара и Памер, 2022). На микробиоту утичу вишеструки параметри, укључујући исхрану, лекове и имуни систем. Последњих година показало се да адаптивне имуне компоненте, посебно ИгА, утичу на састав микробиоте (Накајима ет ал., 2018; Окаи ет ал., 2016; Ианг и Палм, 2020). Међутим, мање се зна о томе како специфични урођени имуни рецептори утичу на састав хомеостатске микробиоте.

Генетски полиморфизми у генима који регулишу препознавање микроба и имунитет слузокоже су значајни алели ризика за ИБД, укључујући протеин аутофагије АТГ16Л1 (Цадвелл ет ал., 2008; Лиу ет ал., 2015; Риоук ет ал., 2007; Цонтрол, Веллцоме Труст Цасе ). У недавној студији која истражује промене експресије мијелоидних гена код особа са полиморфизмом АТГ16Л1Т300А, идентификовано је да је инхибиторни лектински рецептор Ц-типа (ЦЛР), Цлец12а, значајно потиснут у овим ћелијама (Бегун ет ал., 2015). Ова иста студија је показала да Цлец12а функционише у одбрани од патогене инфекције кроз повезаност са путем аутофагије. Ови подаци сугеришу да смањење Цлец12а код особа са ИБД може утицати на тежину и/или развој болести. Упркос овим доказима, мало се зна о механизмима имунолошке регулације које Цлец12а спроводи током колитиса.

Лектини Ц-типа су разнолика група растворљивих или мембрански везаних молекула способних да вежу и липиде, протеине и угљене хидрате који потичу из домаћина или микроба (Бровн ет ал., 2018). Минцле (Цлец4е) и Децтин-1 (Цлец7а) су два ЦЛР-а који утичу на специфичне чланове микробиоте да одржавају цревну хомеостазу (Илиев ет ал., 2012; Мартинез-Лопез ет ал., 2019). Међутим, са више од 1,000 различитих лектина Ц-типа, још много тога треба да се открије у оквиру ове породице протеина. Цлец12а припада породици рецептора природних убица и један је од само два лектина Ц-типа који садрже мотив који инхибира имуно-тирозин (ИТИМ) способан да ограничи инфламаторне сигналне путеве (Бровн ет ал., 2018; Марсхалл ет ал., 2004) . Цлец12а препознаје мокраћну киселину која је сигнал оштећења ћелија (Неуманн ет ал., 2014). Цлец12а је највише изражен у ћелијама урођеног имунитета, а код неутрофила делује на смањење активације и смањење производње инфламаторних цитокина након препознавања мокраћне киселине (Неуманн ет ал., 2014). Насупрот томе, Цлец12а промовише упалу дозвољавајући трансмиграцију мононуклеарних фагоцита (МНП) преко крвно-мождане баријере током аутоимуног модела мултипле склерозе и потенцира сигнализацију интерферона типа И као одговор на вирусну инфекцију (Ли ет ал., 2019; Сагар ет ал. ., 2017). Цлец12а је такође способан да препозна плазмодијални производ, хемозоин, за који се показало да повећава ЦД8+ Т ћелије у мозгу након инфекције плазмодијумом (Раулф ет ал., 2019). Дакле, Цлец12а представља промискуитетни ЦЛР са различитим улогама у имунитету и јединственим сигналним способностима, али његова улога у цревима остаје непозната.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Раније смо показали да специфичне гљивице црева погоршавају колитис индукујући метаболит пурина, мокраћну киселину (Цхиаро ет ал., 2017). Штавише, метаболизам пурина је недавно био повезан са људским цревним обољењима (Зху ет ал., 2019). Ови подаци заједно сугеришу да детекција мокраћне киселине може бити релевантна за ИБД. На основу овога, кренули смо да истражимо функцију Цлец12а у цревима. Открили смо да су животиње са недостатком Цлец12а веома подложне колитису који зависи од састава микробиоте који се формира у одсуству Цлец12а. ФМТ микробиоте Цлец12а-/- у ВТ животиња без клица био је довољан да погорша колитис и формирање колитогене микробиоте код Цлец12а-/- животиња је независно од адаптивног имунитета. Да би се идентификовали релевантни микроби који би могли да погоршају колитис, Цлец12а-/- животиње су лечене различитим антибиотицима, а они који су циљали на грам-позитивне бактерије су ублажили болест. Секвенцирањем 16С рДНК идентификовано је да је Фаецалибацулум родентиум значајно заступљенији код Цлец12а-/- животиња, а орална гаважа Ф. родентиум је била довољна да погорша патологију болести код ВТ животиња. Имунско профилисање Цлец12а-/- животиња открило је значајно смањење хомеостатских мијелоидних ћелија у дебелом цреву. РНК секвенцирање макрофага третираних Ф. родентиумом открило је да Цлец12а промовише фагоцитозу. Како се показало да Цлец12а везује више лиганда, питали смо да ли би се Цлец12а везао за различите чланове микробиоте. Коришћењем фузионог протеина Цлец12а-Фц идентификујемо да се Цлец12а највише везује за грам-позитивне чланове микробиоте. Заједно ови подаци сугеришу модел у којем Цлец12а контролише колитогене чланове микробиоте путем директног везивања и фагоцитозе, док истовремено спречава инфламаторне одговоре. У сценаријима где је експресија Цлец12а смањена, грам-позитивни патобиоти могу да се прошире и подстичу упалу. Стога, наше студије идентификују Цлец12а као важан супресор упале како би се осигурала хомеостаза и одржавање здраве микробиоте.

РЕЗУЛТАТИ

Цлец12а-/- животиње су веома подложне колитису независно од адаптивног имуног система

Смањена експресија Цлец12а је пријављена код особа са ИБД и показали смо да блокирање производње једног од лиганада за Цлец12а, мокраћне киселине, може побољшати колитис (Бегун ет ал., 2015; Цхиаро ет ал., 2017; Лиу ет ал. ., 2015). Међутим, Цлец12а још није проучаван на животињским моделима колитиса. У ту сврху, ВТ и Цлец12а-/- Ц57БЛ/6 мишеви су изазвани акутним ДСС колитисом. Цлец12а-/- животиње су изгубиле значајно више тежине, показале су краће дебело црево и имале значајно повећање инфламаторног маркера ЛЦН2 у измету у поређењу са ВТ животињама, што указује на погоршану упалу и болест (Слика 1А-Ц). У прилог томе, хистолошка анализа је открила повећано оштећење епитела, губитак крипте и прилив имуних ћелија код Цлец12а-/- животиња у поређењу са ВТ (Слика 1Д, Е). У складу са резултатима у ДСС моделу колитиса, трансфер ЦД4+ ЦД45РБхи ћелија у ТЦРб-/-; Двоструки нокаут мишеви Цлец12а-/- довели су до мањег повећања телесне тежине током времена и краћег дебелог црева у поређењу са Т ћелијама пребаченим у ТЦРб-/- мишеве (Слика 1Ф, Г). Заједно, ови резултати показују да губитак Цлец12а доводи до погоршања цревне болести.

Извештава се да се Цлец12а углавном експримира у ћелијама урођеног имунитета са веома ниском експресијом у ЦД8+ Т ћелијама. Стога, да би се утврдило да ли је адаптивни имунитет укључен у погоршану болест уочену код Цлец12а-/- животиња, Цлец12а-/- животиње су укрштене са Раг-/- животињама да би се уклониле и Т и Б ћелије. Опет, животиње Цлец12а-/- развиле су погоршану болест у поређењу са ВТ животињама јер су изгубиле више тежине и имале краће дебело црево од ВТ контрола (Слика 1Х, И). Слично, Цлец12а-/-; Раг-/- је развио погоршану цревну болест у поређењу са Раг-/- контролама и изгубио је толико тежине и имао краћа дебело црево од ВТ и Раг-/- као Цлец12а-/- (Слика 1Х, И). Раније смо известили да орални третман са С. церевисиае повећава нивое мокраћне киселине и погоршава колитис. Међутим, нису примећене разлике у нивоима мокраћне киселине у серуму или фецесу у ВТ у односу на Цлец12а-/- животиње, што сугерише да појачана болест примећена код Цлец12А-/- није резултат повећане мокраћне киселине (Слика С1). Дакле, погоршани развој колитиса примећен код Цлец12а-/- животиња је независан од адаптивног имуног система.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

Погоршање колитиса код Цлец12а-/- животиња зависи од микробиоте

Познато је да је колитис делимично изазван променама у саставу микробиоте (Кубинак ет ал., 2015; Раи и Диттел, 2015). Да би се утврдило да ли животиње Цлец12а-/- имају микробиоту која промовише погоршани колитис, ФМТ су изведени од ВТ или Цлец12а-/- мишева у ВТ животиња без клица. Четири недеље након трансплантације, половина животиња је смештена заједно, док је друга половина остала смештена одвојено. Акутни ДСС колитис је затим индукован у свакој групи (слика 2А). Животиње које су примиле Цлец12а-/- ФМТ и заједно смештене животиње изгубиле су знатно више тежине (слика 2Б) и имале су значајно краће дебело црево (слика 2Ц) од животиња које су примиле ФМТ од ВТ мишева. Штавише, хистолошка анализа је открила веће оштећење епитела и инфламаторни прилив након трансплантације са Цлец12а-/- микробиотом (Слика 2Д, Е). Успостављене микробне заједнице биле су различите међу групама како је утврђено секвенцирањем гена 16С рРНА коришћењем Браи-Цуртис (ПЕРМАНОВА, п=0.0001), непондерисане (ПЕРМАНОВА, п=0.0062) и пондерисане Унифрац удаљености (ПЕРМАНОВА, п=0.0001). Различитост микробиоте унутар групе била је највећа код животиња које су смештене заједно са истим показатељима који указују на стицање микроба из сваког ФМТ генотипа (Слика 2 ФХ). Ови подаци указују на то да погоршани колитис код Цлец12а-/- животиња покрећу специфични микроби обогаћени у одсуству Цлец12а; и ови микроби су постали доминантни покретачи колитогеног фенотипа, чак и у присуству утврђене ВТ микробиоте.

Састав микробиоте формиран у Цлец12а-/- животињама је независан од адаптивног имунитета

Имуни систем је важан за диктирање састава микробиоте. ФМТ експеримент је показао да Цлец12а-/- доводи до промене у саставу микробиоте која промовише погоршани развој колитиса. Прво смо желели да утврдимо да ли је недостатак Цлец12а-/- унутар имунолошког одељка способан да преобликује микробиоту црева. У том циљу, коштана срж из ВТ или Цлец12а-/- мишева је пребачена у смртоносно озрачене ВТ СПФ мишеве да би се стандардизовала микробиота након чега је уследио 8-недељни период имунолошке реконституције (Слика 3А). За то време, трансплантирани имуни систем има времена да се развије унутар примаоца, различито обликујући састав микробиоте. Да бисмо утврдили да ли су проколитогене промене у микробиоти резултат овог имунолошког обликовања, извели смо ФМТ користећи измет било ВТ или Цлец12а-/- химерних мишева и индуковали ДСС колитис (Слика 3А). Иако није било значајних промена у губитку тежине (слика 3Б), дебело црево животиња које су примале ФМТ од Цлец12а-/- химерних мишева било је значајно краће у поређењу са животињама које су примале ФМТ од ВТ мишева (слика 3Ц), што указује на погоршање болести. Штавише, када су примаоци ВТ и Цлец12а-/- ФМТ били заједно смештени, дебело црево је било значајно краће у поређењу са животињама које су примале ВТ ФМТ (Слика 3Ц). Дакле, недостатак Цлец12а-/- у хематопоетском одељку доводи до формирања доминантне колитогене микробиоте.

Да бисмо додатно потврдили да је адаптивни имуни систем неопходан за формирање колитогене микробиоте код Цлец12а-/- животиња, урадили смо ФМТ користећи измет из Раг-/- или Раг- /-; Цлец12а-/- - као што је претходно описано. Животиње које су добиле крпу-/-; Цлец12а-/- ФМТ је изгубио више на тежини и имао значајно краће дебело црево од животиња које су примиле ФМТ од Раг-/- животиња, штавише, животиње које су заједно смештене су такође развиле погоршану болест (Слика 3Д, Е). Ови подаци показују да је недостатак Цлец12а унутар урођеног имунолошког система довољан да доведе до стварања микробиоте способне да погорша колитис.

Цлец12а потискује експанзију Фаецалибацулум родентиум

Користили смо серију различитих антибиотика да идентификујемо релевантне организме који покрећу болести код Цлец12а-/- животиња. Прво, третман снажним коктелом антибиотика широког спектра који укључује еритромицин, ампицилин, неомицин и гентамицин, значајно је смањио озбиљност болести и код Цлец12а-/- и код ВТ животиња, што сугерише да је бактеријска популација микробиоте релевантна за болест ( Слика 4А; Слика С2). Затим смо додатно сузили које су бактеријске популације најрелевантније за болест коришћењем различитих антибиотика који циљају на јединствене бактеријске таксоне. Конкретно, одабрали смо гентамицин, аминогликозид који циља на грам-негативне бактерије, и цефалотин, цефалоспорин који првенствено циља на грам-позитивне бактерије. Ови лекови су давани Цлец12а-/- животињама током ДСС колитиса. Док третман гентамицином није правио разлику у тежини болести, животиње које су примале цефалотин задржале су своју тежину и имале значајно дуже дебело црево од лажно третираних животиња (Слика 4Б, Ц), што указује на то да се грам-позитивни организми који живе у Цлец12а-/- микробиоти играју важну улогу у погоршању патологије болести.

Затим смо извршили секвенцирање гена 16С рРНА СПФ ВТ и Цлец12а-/- фецеса да бисмо профилисали композиционе промене у микробиоти. Животиње ВТ и Цлец12а-/- груписане су значајно другачије према нефилогенетским и филогенетским метрикама пондерисаним обиљем, Браи-Цуртис и пондерисаним УниФрац, респективно (Слика С3А-Ц). Показатељи алфа разноликости нису открили значајне разлике у богатству (уочене карактеристике), што указује на то да Цлец12а-/- није имао више врста (Слика 4Д). Међутим, индекси равномерности и Шенонове разноликости су повећани у одсуству Цлец12а, што указује да је пропорционална дистрибуција бактерија у Цлец12а-/- мишевима измењена (слика 4Е, Ф) и даље подржавајући да је Цлец12а важан за регулисање структуре микробиоте у цревима.

Анализа састава микробиома (АНЦОМ) открила је да је, међу АСВ (варијанте секвенце ампликона) различито богатим, АСВ класификован у род Фаецалибацулум (фамилија Ерисипелотрицхацеае), значајно проширен унутар Цлец12а-/- фецеса у поређењу са ВТ (Слика 4Г, Х). БЛАСТ коришћењем АСВ репрезентативне секвенце из наше анализе указало је на 100% идентичност секвенцама из бактерије Фаецалибацулум родентиум. Ови подаци пружају доказе да су грам-позитивне бактерије у Цлец12а-/- животињи одговорне за колитогени фенотип, и посебно имплицирају грам-позитиван организам, Ф. родентиум, у погоршану болест.

На основу овога, тестирали смо хипотезу да Ф. родентиум може да погорша колитис. Претходно смо третирали ВТ СПФ животиње са 1 к 108 ЦФУ било живог или фиксног Ф. родентиума оралном гаважом и наставили третман сваког дана током акутног модела ДСС-а да бисмо обезбедили висок ниво колонизације Ф. родентиум. Животиње које су примале и живу и фиксну Ф. родентиум изгубиле су више на тежини и имале су значајно краће дебело црево од животиња које су третиране носачем (Слика 4И, Ј), што указује да повећани нивои Ф. родентиум могу погоршати болест.

Цлец12а ограничава инфламаторни одговор макрофага док повећава фагоцитозу

Да бисмо дефинисали ћелијску експресију Цлец12а у одсуству болести, профилисали смо урођене и адаптивне имуне ћелије у ламини проприа (ЛП) користећи вишебојну проточну цитометрију. У складу са претходним извештајима, Цлец12а је претежно ограничен на мијелоичну лозу са мало или нимало експресије на лимфоцитима (Слика 5А) (Хан ет ал., 2004; Пиз ет ал., 2008; Собанов ет ал., 2001). Интестинални неутрофили, макрофаги и дендритичне ћелије су показали сличне нивое експресије Цлец12а (слика С4А), док су макрофаги имали највећи проценат ћелија унутар ткива црева које експримирају Цлец12а (слика 5А). С обзиром на двоструку улогу макрофага да промовишу упалу путем класичне активације, али и да покрену репаративне механизме као одговор на оштећење ткива, питали смо како Цлец12а може утицати на ову дихотомију током колитиса. Иако су макрофаги прилично разноврсни, могу се широко поделити на М1 инфламаторне и М2 репаративне макрофаге према експресији ЦД38 и ЕГР2 респективно. Показали смо да животиње Цлец12а-/- имају повећане М1 макрофаге и смањене М2 макрофаге у ЛП дебелог црева током колитиса (слика 5 Б, Ц, слика С4Б). Ови подаци указују на то да Цлец12а регулише одговоре макрофага у цревима.

Да би се боље разумело како Цлец12а утиче на биологију макрофага као одговор на микробне лиганде, макрофаги изведени из коштане сржи (БМДМ) изоловани од ВТ или Цлец12а-/- животиња третирани су разним уобичајеним микробним лигандима укључујући ЛПС, Пам3ЦисК и Флагеллин. На свим овим узорцима урађена је анализа цитокина. Многи од тестираних цитокина нису индуковани под овим условима, међутим, МЦП-1, ИЛ-27, ИФН-б, ТНФ-а и ИЛ-6 су доследно детектовани у овим културама ( Слика 5Д). Цлец12а-/- БМДМ-ови су имали значајно већу експресију ових цитокина као одговор на многе микробне лиганде, а највећи диференцијални одговори су уочени као одговор на ТЛР2 агонист Пам3ЦисК. Ови подаци су у складу са познатом улогом Цлец12а у ублажавању инфламаторних одговора током стерилне инфламације (Неуманн ет ал., 2014).

цистанцхе биљке које повећавају имуни систем

РНА-сек је изведен на БМДМ-има из ВТ или Цлец12а-/- третираним са Ф. родентиум да би се утврдило како Цлец12а регулише одговоре ових ћелија на овај специфични бактеријски организам. Проценили смо диференцијални одговор упоређивањем Цлец12а-/- БМДМ-ова изложених Ф. родентиум у односу на контроле возила са онима ВТ БМДМ-а. Анализа обогаћивања различито експримираних гена показала је да макрофаги са недостатком Цлец12а имају значајно повећање гена укључених у контролу ћелијског циклуса када су изазвани са Ф. родентиум (Слика С5А). Ћелијски циклус је суштински повезан са фагоцитозом, а такође је било значајног смањења гена повезаних са фагоцитозом и инфламаторним одговором (Слика 5Е) (Луо ет ал., 2005). У складу са недавном студијом о Цлец12а и салмонели, ови подаци сугеришу да је фагоцитоза дефектна у одсуству Цлец12а као одговор на Ф. родентиум који живи у нормалном цреву (Бегун ет ал., 2015). Да би се ово тестирало, перитонеални макрофаги су сакупљени од ВТ и Цлец12а-/- животиња и заједно култивисани са Сибр®-греен обележеним Ф. родентиум. Цлец12а-/- макрофаги су имали значајно мање микроба по ћелији (Слика 5Ф, Г; Слика С5Б), што указује да недостатак Цлец12а доводи до узимања мањег броја организама и у складу је са смањеном фагоцитозом у РНА-сек скупу података. Заједно, ови подаци показују да Цлец12а игра двоструку улогу ублажавања отворених инфламаторних одговора на уобичајене микробне лиганде, истовремено промовишући узимање макрофага бактеријама.

Цлец12а се првенствено везује за грам-позитивне коменсале

Како је фагоцитоза покренута везивањем микроба праћено интернализацијом и убијањем, претпоставили смо да је Цлец12а био у стању да се веже за специфичне чланове микробиоте, као што је Ф. родентиум. Да би се решила ова могућност, створен је фузиони протеин који садржи ванћелијски везујући домен мишјег Цлец12а и Фц део хуманог ИгГ1 (Цлец12а-Фц) (Слика 6А) (Маглинао ет ал., 2014; Неуманн ет ал., 2014; Раулф ет ал., 2019). Протеин је пречишћен и тестиран на везивање за панел различитих грам-позитивних и грам-негативних бактерија за које се зна да су присутне у хомеостатском цреву, укључујући Ф. родентиум, Росебуриа спп., Бифидобацтериа анималис, Аккермансиа муцинипхила, Бацтериодес униформис, и гљивична комензална Цандида албицанс, проточном цитометријом. Салмонелла ентерица је такође укључена јер су претходне студије показале да се Цлец12а може повезати са уласком С. ентерица у ћелију (Бегун ет ал., 2015). Цлец12а се у различитом степену везује за неколико филогенетски различитих бактерија, укључујући Ф. родентиум, али не и гљиве, Ц. албицанс (Слика 6Б). Цлец12а се највише везао за грам-позитивне организме Ф. родентиум и члана породице Лацхноспирацеае Росебуриа сп., а најмање је ступио у интеракцију са Б. анималис, Б. униформис и С. ентерица (Слика 6Б), што указује на Цлец12а може везују се за специфичне чланове микробиоте са склоношћу према грам-позитивним организмима. Узети заједно, наши подаци идентификују Цлец12а као механизам који користи имуни систем за испитивање микробне заједнице црева и орезивање микробиоте путем директног везивања и фагоцитозе, док истовремено спречавају очигледне упалне одговоре на обилне грам-позитивне микробе који су критични за одржавање здравља црева.

ДИСКУСИЈА

Хомеостаза унутар црева захтева механизме за ограничавање комензалних микроба без иницирања штетне упале (Мацпхерсон ет ал., 2000). ИгА се последњих година појавио као један од критичних начина на који имунитет црева може да изврши контролу над микробиотом (Пабст и Слацк, 2020). Заиста, ИгА је у стању да се директно веже за микробе и/или њихове производе и елиминише их из црева без индукције прототипичне упале. Други имуни молекули који поседују ова двојна својства до данас нису проучавани. Лектини Ц-типа обухватају разноврсну класу протеина који могу препознати различите молекуле протеина, угљених хидрата и липида из микробних и производа домаћина (Бровн ет ал., 2018; Дроуин ет ал., 2020). Међутим, мало их је проучавано у контексту имунитета црева и микробиоте (Илиев ет ал., 2012; Мартинез-Лопез ет ал., 2019). Дакле, према нашим сазнањима, ово је прва демонстрација да недостатак Цлец12а мења састав микробиоте која утиче на озбиљност болести.

цистанцхе користи-јача имуни систем

Цлец12а је у великој мери проучаван у контексту препознавања мононатријум урата (МСУ) или мокраћне киселине, што је често показатељ ћелијске смрти (Коно ет ал., 2010; Неуманн ет ал., 2014). Мокраћна киселина је способна да активира инфламаторне одговоре преко НЛРП3 инфламасома, тако да, како би се спречило уништавање ткива током ћелијске смрти, ова упала мора бити контролисана (Мартинон ет ал., 2006). Показало се да Цлец12а балансира овај инфламаторни одговор кроз смањење регулације Сик сигнализације (Марсхалл ет ал., 2004). У складу са овим, делеција Цлец12а у моделу стерилне инфламације и аутоинфламаторном моделу артритиса изазива појачану активацију неутрофила и погоршање болести, чинећи Цлец12а важном инфламаторном кочницом (Ределингхуис ет ал., 2016). Међутим, недавно је доказано да Цлец12а побољшава сигнализацију интерферона типа И као одговор на вирусну инфекцију и посредује у преузимању салмонеле путем антибактеријске аутофагије (Бегун ет ал., 2015; Ли ет ал., 2019). Ово показује да Цлец12а не функционише само да ограничава упалу, већ може да игра различите улоге у зависности од контекста. Црева се разликује по томе што постоји велики број имуних ћелија чак и у одсуству болести. То је због присуства микробиоте, која игра важну улогу у инструкцијама развоја имунитета и спречавању колонизације патогених организама. Микробиота поседује исте површинске обрасце које детектују ТЛР-и који такође препознају патогене, па стога имуни систем црева мора да има строге регулаторне механизме да обузда упалу овим страним организмима (Бландер ет ал., 2017).

Првобитно смо се заинтересовали за Цлец12а јер смо идентификовали да гљивице црева, Саццхаромицес церевисиае, изазивају мокраћну киселину да погорша колитис (Цхиаро ет ал., 2017). Штавише, друге студије су идентификовале да микробиота може утицати на цревне болести путем индукције метаболизма пурина, чији је крајњи производ код сисара мокраћна киселина (Зху ет ал., 2019). Ови подаци сугеришу да механизми за откривање мокраћне киселине, као што је Цлец12а, могу утицати на цревну хомеостазу. Међутим, нисмо приметили промене у нивоима мокраћне киселине у серуму или фецесу, што указује да повећана тежина болести код Цлец12а-/- животиње није била изазвана повећањем мокраћне киселине. Међутим, повећана тежина колитиса код Цлец12а-/- је вођена саставом микробиоте. Дакле, на основу наших података смањена експресија Цлец12а-/- може утицати на састав микробиоте код пацијената са ИБД (Јасон Л. Кубинак, 2015; Рехман ет ал., 2011; Вијаи Кумар ет ал., 2010). Занимљиво је да смо открили да антибиотици који циљају на грам-позитивне организме могу да ублаже тежину колитиса код Цлец12а-/- животиња. Ово је у супротности са неколико извештаја који су идентификовали проширене грам-негативне Ентеробацтериацеае током упале црева, тако да је ово једна од ретких студија која је идентификовала експанзију грам-позитивних организама који су повезани са развојем колитиса. Иако, вероватно, није једини организам који утиче на тежину колитиса у овом моделу, примећена је драматична експанзија Ф. родентиум код Цлец12а-/- животиња. Ф. родентиум је грам-позитиван, оксидаза и каталаза негативан члан Фирмицутес (Бациллота) пхила (Цханг ет ал., 2015). Свакодневно увођење Ф. родентиум чак и код ВТ мишева појачава колитис, подржавајући да су повећани нивои Ф. родентиум у цревима штетни и вероватно изазивају тежину колитиса у Цлец12а-/-. Недавни извештај је показао да Ф. родентиум може повећати промет епитела и потиснути експресију ензима унутар епитела који смањују инфламаторне одговоре и стога је у складу са погоршаном болешћу коју видимо када се Ф. родентиум прошири у цревима (Цао ет ал., 2022). Пошто су људи колонизовани организмом сличним Ф. родентиум (Загато ет ал., 2020), даље студије би требало да разјасне утицај ових бактерија сличних Ф. родентиум на аспекте људске физиологије у вези са колитисом.

Подржавајући улогу Цлец12а међу урођеним имуним ћелијама, приметили смо да се колитогена микробиота још увек формира у Цлец12а-/- животињама којима недостаје адаптивни имуни систем. Највећи проценат ћелија у цревима које експримирају Цлец12а били су макрофаги што нас је навело да се фокусирамо на функцију Цлец12а у овим ћелијама. Претходне студије су показале да је Цлец12а важан медијатор производње интерферона типа И као одговор на вирусну инфекцију (Ли ет ал., 2019). Међутим, није процењено како Цлец12а утиче на одговоре на широк спектар бактеријских лиганада; ово је веома релевантно у цревима где постоји обиље ТЛР лиганада. Овде показујемо да Цлец12а служи за ублажавање реакција макрофага у цревима и вероватно функционише да обезбеди хомеостазу као одговор на микробиоту. РНК секвенца макрофага инкубираних са Ф. родентиум је истакла да недостатак Цлец12а доводи до дефекта ћелијског циклуса и фагоцитозе као одговора на ове комензалне бактерије. Недавна студија је показала да су Цлец12а-/- макрофаги смањили аутофагију као одговор на салмонелу (Бегун ет ал., 2015). Наши подаци допуњују и проширују ове налазе како би укључили да Цлец12а функционише и за контролу неинвазивних комензалних организама. Други су показали да Ф. родентиум утиче на епителну биологију, што сугерише да се Ф. родентиум налази у непосредној близини домаћина и стога мора бити под строгом контролом имунолошког система. Наши подаци потврђују да Цлец12а контролише Ф. родентиум кроз регулацију фагоцитозе. Фагоцитоза се покреће физичким везивањем лиганда или микроба, а лектини Ц-типа могу да се повежу са више лиганда, што нас је навело да тестирамо да ли се Цлец12а може директно повезати са бактеријама које живе у цревима. Занимљиво је да се Цлец12а највише везао за грам-позитивне организме Ф. родентиум и Росебуриа, а много мање за грам-негативне организме А. муцинипхила и Б. униформис, а никако за Ц. албицанс. Ови подаци показују да Цлец12а има склоност ка везивању одређених чланова микробиоте. Ово нам омогућава да изградимо модел у коме ангажовање Цлец12а и каснија фагоцитоза могу контролисати одређене чланове микробиоте и спречити потенцијално штетне ефекте њиховог ширења. Ово наглашава двоструку функцију Цлец12а која може да обузда упалу против микробних лиганада, а истовремено препознаје и контролише специфичне чланове микробиоте. Дакле, Цлец12а представља јединствен начин на који урођени имуни систем користи да осигура хомеостазу унутар гастроинтестиналног тракта.

ЛЕГЕНДЕ ФИГУРЕ

Слика 1. Цлец12а обуздава цревне болести независно од адаптивног имуног система

(А) Да би се проценила тежина колитиса, ВТ или Цлец12а-/- Ц57БЛ/6 специфични мишеви без патогена (СПФ) су третирани са 2,5% декстран натријум сулфата (ДСС) ад либитум током 7 дана у води за пиће. Проценат губитка тежине је процењиван дневно. Средња вредност +/- СЕМ, подаци су прикупљени из три независна експеримента коришћењем двосмерне АНОВА и Шидаковог теста вишеструког поређења.

(Б) Дужина дебелог црева (цм) назначених животиња је мерена при жртвовању. Дијаграм расипања је средња вредност +/- СЕМ, подаци су обједињени из три независна експеримента коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша

(Ц) Фекални липокалин-2 (нг/мЛ) назначених животиња је мерен као очитавање упале. Ступасти графикон је средња вредност +/- СЕМ, подаци су обједињени из два независна експеримента коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша

(Д) Репрезентативни Х&Е обојени делови дебелог црева од индицираних животиња након ДСС-индукованог колитиса.

(Е) Хистолошки резултати за назначене животиње генерисани су из пресека дебелог црева у

(Д). Ступасти графикон је средња вредност +/- СЕМ, упоређена коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша.

(Ф) Модел преноса Т ћелија колитиса изведен је да би се проценио хронични колитис. Тежина ТЦРб-/- и Цлец12а-/- ;ТЦРб-/- животиња је мерена недељно. Графикон приказује проценат губитка тежине назначених животиња током експеримента. Средња вредност +/- СЕМ, у поређењу са 2-начин АНОВА.

(Г) Дужина колоније назначених животиња из (И) је мерена при жртвовању. Ступасти графикон је средња вредност +/- СЕМ, упоређена коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша.

(Х) ВТ, Цлец12а-/-, Раг-/- или Раг-/- ;Цлец12а-/- Ц57БЛ/6 СПФ мишеви су процењени на акутни колитис. Наведеним животињама је дато 2,5% ДСС ад либитум током 7 дана. Проценат губитка тежине је процењиван дневно. Средња вредност +/- СЕМ, подаци су репрезентативни за два независна експеримента. Двосмерни АНОВА и Шидаков тест вишеструког поређења.

(И) Дужина дебелог црева (цм) назначених животиња је мерена при жртвовању. Ступасти графикон је средња вредност +/- СЕМ, подаци су репрезентативни за два независна експеримента који користе неупарене т-тестове. Свака тачка представља једног миша * п < 0.05; ** п < 0.01; *** п < 0,001; **** п < 0,0001

Слика 2. Микробиота формирана у Цлец12а-/- животињама изазива погоршани колитис

А) Трансплантације фекалне микробиоте (ФМТ) изведене су преношењем фекалних супернатаната са ВТ или Цлец12а животиња у ВТ мишеве без клица. Микробиотама је остављено да се хомогенизују четири недеље, након чега су половина ВТФМТ мишева и половина Цлец12а-/-ФМТ мишева заједно смештени и остављене су још четири недеље да се мешају. Све групе су затим добиле 2,5% ДСС ад либитум у својој води за пиће и жртвоване су 7. дана.

Б) Проценат губитка тежине назначених животиња је процењиван дневно. Графикон приказује средње вредности +/- СЕМ, подаци су обједињени из два независна експеримента коришћењем двосмерне АНОВА и Шидаковог теста вишеструког поређења.

Ц) Дужина дебелог црева (цм) од наведених животиња је мерена при жртвовању. Дијаграм расипања је средња вредност +/- СЕМ, упоређена коришћењем Ординари Оне-Ваи АНОВА са Дуннеттовим тестом вишеструких поређења. Свака тачка представља једног миша.

Д) Репрезентативни Х&Е обојени делови дебелог црева назначених животиња након колитиса изазваног ФМТ и ДСС.

Е) Хистолошки резултати су генерисани из пресека дебелог црева у (Д). Ступасти графикон је средња вредност +/- СЕМ, упоређена коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша.

Ф) Пондерисане удаљености Унифрац-а од секвенцирања гена 16С рРНА ВТФМТ, Цлец12а-/- ФМТ или животиња које су смештене заједно. Графикони кутија и бркова који приказују све тачке (поређење растојања у паровима) и упоређени коришћењем Крускал-Волисовог теста.

Г) Непондерисане удаљености Унифрац-а од секвенцирања гена 16С рРНА ВТФМТ, Цлец12а-/- ФМТ или животиња које су смештене заједно. Графикони кутија и бркова који приказују све тачке (поређење растојања у паровима) и упоређени коришћењем Крускал-Волисовог теста.

Х) Бреј-Кертисове удаљености од секвенцирања гена 16С рРНА ВТФМТ, Цлец12а-/- ФМТ или животиња које су смештене заједно. Графикони кутија и бркова који приказују све тачке (поређење растојања у паровима) и упоређени коришћењем Крускал-Волисовог теста.

Слика 3: Састав микробиоте формиран у Цлец12а-/- животињама је независан од адаптивног имунитета

А) Шематски дијаграм који приказује реконституцију коштане сржи са накнадним ФМТ. Ц57Бл/6 ВТ мишеви су смртоносно озрачени и реконституисани или са ВТ или Цлец12а-/- коштаном сржи. После 8 недеља, измет је узет од ових мишева и пребачен у ВТ мишеве без клица као што је објашњено у (А). Првобитно реконституисаним химерним животињама је тада дато 2,5% ДСС ад либитум у води за пиће.

Б) Проценат губитка тежине ФМТ мишева из (Ф) је процењиван дневно. Средња вредност +/- СЕМ, користећи двосмерни АНОВА и Тукеи тест вишеструког поређења.

Ц) Дужина дебелог црева (цм) од наведених животиња је мерена при жртвовању. Дијаграм расипања је средња вредност +/- СЕМ, неупарени т-тест. Свака тачка представља једног миша

Д) ФМТ-ови за процену улоге адаптивног имуног система на микробно обликовање и тежину колитиса изведени су преносом фекалних супернатаната из Раг-/- или Раг-/-; Цлец12а-/- СПФ животиње у ВТ мишеве без клица као што је описано у (А). Мишеви су третирани са 2,5% ДСС током 7 дана. Проценат губитка тежине је процењиван дневно. Графикон је средња вредност +/- СЕМ, користећи двосмерни АНОВА и Тукеи тест вишеструког поређења.

Е) Дужина дебелог црева (цм) од наведених животиња у (Ф) мерена је при жртвовању. Средња вредност +/-, СЕМ упоређена коришћењем обичне једносмерне АНОВА и Дуннет теста вишеструког поређења. Свака тачка представља једног миша. * п < 0.05; ** п < 0.01; *** п < 0,001; **** п < 0,0001

Слика 4. Цлец12а ограничава експанзију глодара Фаецалибацулум, микроба који погоршава колитис

А) ВТ или Цлец12а-/- Ц57БЛ/6 СПФ мишевима је дат коктел антибиотика (А) (неомицин, гентамицин, ампицилин, еритромицин), цефалотин или гентамицин (Б, Ц) у концентрацији од 0. 5г/Л током четрнаест дана. После седам дана животињама је дато 2,5% ДСС у води за пиће до жртвовања. Дужина дебелог црева (цм) од наведених животиња је мерена при жртвовању. Дијаграм расипања је средња вредност +/- СЕМ, неупарени т-тест. Свака тачка представља једног миша.

Б) Проценат губитка тежине назначених животиња је процењиван дневно. Графикон је средња вредност +/- СЕМ, користећи двосмерни АНОВА и Тукеи тест вишеструког поређења

Ц) Дужина дебелог црева (цм) назначених животиња мерена при жртвовању. Дијаграм расипања је средња вредност +/- СЕМ, неупарени т-тест. Свака тачка представља једног миша.

Д) Уочене карактеристике из ВТ или Цлец12а-/- фецеса, 16С рРНА секвенционирање алфа разноликости. Средња вредност +/- СЕМ, упоређена коришћењем Манн-Вхитнеи теста.

Е) Пиелоу изједначеност из ВТ или Цлец12а-/- фецеса, 16С рРНА секвенцирање алфа разноврсности. Средња вредност +/- СЕМ, упоређена коришћењем Манн-Вхитнеи теста.

Ф) Сханнон Ентропи Меан +/- СЕМ, упоређен коришћењем Манн-Вхитнеи теста.

Г) АНЦОМ анализа из ВТ и Цлец12а-/- фецеса. Таксономска имена су најбоља класификација АСВ-а помоћу базе података таксономије генома (ГТДБ).

Х) Релативна бројност Фаецалибацулум родентиум АСВ. У поређењу са Маном Вхитнеием * п < {{0}}.05; ** п < 0.01; *** п < 0,001; **** п < 0,0001

И) Ц57Бл/6 ВТ СПФ мишеви су претходно третирани са 1к108 ЦФУ Ф. родентиум оралном гаважом током три дана. Животиње су затим добијале 2,5% ДСС у води за пиће током 7 дана, док су наставиле да примају дневну гажу Ф. родентиум. Проценат губитка тежине је процењиван дневно. Средња вредност +/- СЕМ, подаци су обједињени од четири одвојена експеримента користећи двосмерни АНОВА и Тукеи тест вишеструког поређења.

Ј) Дужина дебелог црева (цм) назначених животиња је мерена при жртвовању. Ступасти графикон је средња вредност +/- СЕМ. Подаци су обједињени из четири одвојена експеримента упоређени коришћењем обичне једносмерне АНОВА са Дуннет тестом вишеструке корекције. Свака тачка представља једног миша. * п < 0.05; ** п < 0.01; *** п < 0,001; **** п < 0,0001

Слика 5. Цлец12а ограничава упалу и промовише фагоцитозу у макрофагима.

А) Имунофенотипизација је изведена путем проточне цитометрије на ћелијама изолованим из ламине проприе дебелог црева (цЛП) на ВТ и Цлец12а-/- животињама. Хеатмап показује учесталост експресије Цлец12а на урођеним и адаптивним имуним ћелијама

Б) Ступасти графикон приказује учесталост пре-гате, ЦД38+ ћелија (М1 макрофага) из цЛП-а назначених животиња. Средња вредност +/- СЕМ, упоређена коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша.

Ц) Ступасти графикон приказује учесталост пре-гате, ЕГР2+ ћелија (М2 макрофага) из цЛП-а назначених животиња. Средња вредност +/- СЕМ, упоређена коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша.

Д) БМДМ су сакупљени из ВТ и Цлец12а-/- дугих костију и култивисани у присуству М-ЦСФ (20 нг/мЛ) током 7 дана. Осмог дана БМДМ су пулсирани са ЛПС (100 нг/мЛ), МДП (10 мг/мЛ), Пам3циск (1 мг/мЛ) или Флагелином (1 мг/мЛ) током 24 сата. Медијум је сакупљен и тестиран на производњу цитокина. Топлотна мапа показује Лог2 пута промену назначених цитокина из Цлец12а-/- преко ВТ.

Е) БМДМ из ВТ и Цлец12а-/- мишева су изоловани и култивисани као у (А), а затим заједно култивисани са Ф. родентиум при МОИ од 10 током 24 сата. Након што су БМДМ испрани, РНК је сакупљена и припремљена за секвенцирање РНК. Топ 10 поједностављених категорија ГО термина (биолошки процес) обогаћених међу Цлец12а-/- ниже регулисаним

Ф) Перитонеални макрофаги су изоловани из ВТ и Цлец12а-/- мишева, а затим су култивисани са Сибр зелено обојеним Ф. родентиум да би се проценила фагоцитоза. Лево: ВТ макрофаги. Десно: Цлец12а-/- макрофаги. Приказане су репрезентативне слике из светлог поља (леве колоне), флуоресценције (средње колоне) и спојене (десне колоне). Жути врхови стрелица означавају примере ћелија Ф. родентиум које су прогутале макрофаге. скала=20 µм. Слике су репрезентативне за два одвојена експеримента.

Г) Ступасти графикон приказује организме по ћелији, као што се види у (Ф). 250 ВТ ћелија и 269 Цлец12а-/- ћелија је избројано да би се квантификовала количина Ф. родентиум по ћелији.

Слика 6: Цлец12а се директно везује за специфичне чланове микробиоте.

А) Шематски дијаграм који приказује Цлец12а-хумани ИгГ1-Фц фузиони протеин или празан вектор (само Фц део) Б) Хистограми проточне цитометријске анализе који представљају диференцијално везивање Цлец12а-Фц за различите бактерије или Ц. албицанс.

ДОДАТНЕ ЛЕГЕНДЕ О ФИГУРИМА

Додатна слика 1. Одсуство Цлец12а не ремети нивое мокраћне киселине.

А) Серумска мокраћна киселина (µМ) назначених животиња је мерена да би се проценио метаболизам пурина између ВТ и Цлец12а-/- Ц57Бл/6 мишева. Дијаграм расипања је средња вредност +/- СЕМ, подаци су прикупљени из три независна експеримента коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша.

Б) Фекална мокраћна киселина (µМ) назначених животиња је мерена да би се проценило излучивање мокраћне киселине у цревима између ВТ и Цлец12а-/- Ц57Бл/6 мишева. Дијаграм расипања је средња вредност +/- СЕМ, подаци су прикупљени из три независна експеримента коришћењем неупареног т-теста. Свака тачка представља једног миша.

Додатна слика 2. ВТ и Цлец12а-/- микробиоте изазивају диференцијалну болест

Проценат губитка тежине ВТ и Цлец12а-/- животиња третираних коктелом антибиотика који се састоји од неомицина, гентамицина, ампицилина и еритромицина.

Додатна слика 3. На састав микробиоте утиче Цлец12а.

А) ПЦоА дијаграми прве 3 осе засноване на Бреј-Кертисовим растојањима који показују укупне односе микробиоте и одговарајуће кутије и дијаграме бркова који квантификују различитост унутар сваке групе и упоређују са Манн-Вхитнеи тестом.

Б) ПЦоА дијаграми засновани на пондерисаним Унифрац растојањима и одговарајућим дијаграмима кутија и бркова који квантификују различитост унутар групе у поређењу коришћењем неупареног Манн-Вхитнеи теста.

Ц) Табела која приказује резултате ПЕРМАНОВА теста за ВТ у односу на Цлец12а-/- фекалну микробиоту са Браи-Цуртисовим и пондерисаним Унифрац растојањима.

Додатна слика 4: Цлец12а у макрофагима ограничава упалу.

А) Виолин дијаграми приказују средњи геометријски интензитет флуоресцентног интензитета (МФИ) имуних ћелија приказаних у (А). Средња вредност +/- СЕМ, Крускал-Волисов тест са Дун-овом корекцијом за вишеструка поређења. Слова означавају групе које се значајно разликују.

Б) Репрезентативни дијаграми проточне цитометрије М1 и М2 макрофага из цЛП ВТ или Цлец12а-/- мишева након ДСС колитиса. Ћелије су унапред затворене на ливе, ЦД45+, Ли6Ц-, ЦД11б+, МХЦИИ+ и ЦД64+. Са слике 5А

Додатна слика 5. Цлец12а стабилизује контролу ћелијског циклуса и регулише фагоцитозу у макрофагима.

А) Топ 10 поједностављених ГО термина (биолошки процес) категорија обогаћених међу Цлец12а-/- уп-регулисаним генима у поређењу са ВТ као одговор на Ф. родентиум. БМДМ из ВТ и Цлец12а-/- мишева који су култивисани заједно са Ф. родентиум су изоловани и анализирани као на слици 7А.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Избројано је 200 макрофага. Ступасти графикон приказује просечан број Ф. родентиум из 4 појединачна бунара да би се приказала конзистентност бројања и ефекта у свим бунарима. Средња вредност +/- СЕМ упоређена коришћењем неупареног т-теста.

ЗАХВАЛНИЦЕ

Желели бисмо да се захвалимо Гордону Брауну што је обезбедио животиње Цлец12а-/- за овај пројекат. Овај рад је подржан од стране Хелен Хаи Вхитнеи Фоундатион (КСО), НРСА НРСА Мицробиал Патогенесис Т32 Грант за обуку (КСО), ЦЦФА Сениор Ресеарцх Авард (ЈЛР), НИДДК Р01ДК124336, НИДДК Р01124317 и НЦЦАМ1цклин Р013АТ (НЦЦАМ Р023АТ) Фондација Јр. (ЈЛР), награда НСФ ЦАРЕЕР (ИОС-1253278) (ЈЛР), Пацкард Фелловсхип ин Сциенце анд Енгинееринг (ЈЛР), Бурроугхс Велцоме Инвестигатор ин Патхогенесис Авард (ЈЛР), Америчка фондација за астму (ЈЛР), Марголис Фондација (ЈЛР), грант МС Социети Центер (ЈЛР) и ВМ Кецк Фоундатион (ЈЛР) НИХ Нев Инноватор Авард ДП2ГМ111099-01 (РМО), НХЛБИ Р00ХЛ102228-05 ( РМО), грант Америчког друштва за истраживање рака (РМО), Киммел Сцхолар Авард (РМО), Р01АГ047956 (РМО) и НИАИД Р01АИ141202 (АСИ). Овај рад је подржан од стране Установе за проточну цитометрију Универзитета у Јути, поред Националног института за рак, кроз награду број 5П30ЦА042014-24. Подршка и ресурси Центра за рачунарство високих перформанси на Универзитету Јута су захвални.

ПРИЛОЗИ АУТОРА

ТРЦ је помогао у осмишљавању студије, извео већину експеримената на мишу и имунологији, спојио податке у бројке и помогао у писању рукописа. РБ је поставио експерименте без клица и одржавао све животиње без клица. ЕСВ је помогао у имунолошким експериментима црева ламина проприа. КСО је помогао у сакупљању мишева и пружио увид и смернице. КМБ је помогао у сакупљању мишева и проточној цитометрији. МЦН је помогао у сакупљању мишева. ВВ је пружио помоћ у изградњи конструкта за фузиони протеин и пречишћавању. ТЈ је пружио помоћ у тестовима фагоцитозе. ЈХ је анализирао плочице микроскопске фагоцитозе. МХ је пружио помоћ у пречишћавању и употреби фузионог протеина. КАК обезбеђује изолате бактерија. РОЦ је пружио имунолошку експертизу и увид. ВЗС је помогао у осмишљавању студије, извршио је биоинформатичке анализе, помогао у припреми фигура и статистици и помогао у писању рукописа. ЈЛР је помогао у осмишљавању и усмеравању студије, надгледао експериментални дизајн и резултате, организовао сараднике и реагенсе, прикупио средства за студију и помогао у писању рукописа.

МЕТОДЕ

Сојеви мишева

Све коришћене линије миша биле су на позадини Ц57БЛ/6. Цлец12а-/- мишеве је љубазно обезбедио Гордон Браун (Центар за медицинску микологију Савета за медицинска истраживања, Универзитет у Ексетеру) и они су били генотип у складу са њиховим претходно описаним протоколом (Ределингхуис, ет ал. 2016). Раг2-/- и ТЦРб-/- (Јацксон Лабораториес, 002118) добијени су од Јацксон Лабораториес и одржавани у нашој колонији мишева неколико генерација. За све ин виво експерименте са колитисом коришћено је 8 до 12-недељно старих мишева подударног пола. Коришћени су и мужјаци и женке мишева. Мишеви су одржавани у специфичним условима без патогена.

Сојеви бактерија и гљивица

Следећи организми су набављени из ДСМЗ-Герман Цоллецтион оф Мицроорганисм анд Целл Цултурес ГмбХ: Фаецалибацулум родентиум (ДСМ# 103405); Аккермансиа муцинопхилиа ДСМЗ (ДСМ# 26127); Бифидобацтериум анималис ДСМЗ (ДСМ# 26074). Бацтероидес униформис је набављен из Америчке колекције типских култура (АТЦЦ® 8492™). Росебуриа сп (ознака соја ЈЛР.КК002) је изолован на Сцхаедлеровом агару од Ц57БЛ/6 мишева који су имали микробиоту обогаћену спорама. Обогаћивање спора је изведено као што је претходно описано и мишеви су одржавани више генерација са овом микробиотом у нашем гнотобиотичком објекту пре него што је ЈЛР.КК002 изолован из фецеса (Бровне ет ал., 2016). Ми смо ПЦР-амплификовали и Сангер је секвенционирао 16С рРНА ген, а затим га класификовао услугом СИЛВА АЦТ и базом података СИЛВА (Пруессе ет ал., 2012). Коришћен је сој Салмонелла типхимуримум СТ2. Коришћен је сој Цандида албицанс сц5314. Бактеријски сојеви који се користе у синтетичкој заједници ПхиЛо11б описани су у наставку.

Експериментални колитис изазван ДСС-ом

Колитис је индукован додатком 2,5% или 3% (в/в) 36,000-50,000МВ декстран натријум сулфата (ДСС) (МП Биомедицалс) у води за пиће током 7 дана. Озбиљност колитиса је праћена свакодневно кроз промене телесне тежине, конзистенције столице и фекалне крви. За експеримент спашавања моноцита сви мишеви су добијали 2,5% ДСС током 5 дана, након чега је давана редовна вода; праћење тежине је настављено до 10. дана када су животиње убране. Ограничења тежине веће од 20% губитка тежине су наметнута као праг тежине. На експерименталним крајњим тачкама, МЛН и дебело црево су уклоњени. Дебело црево је мерено од цекума до ректума да би се одредила дужина. Ткива су затим обрађена за хистологију, екстракцију РНК или анализу проточне цитометрије.

Хистологија дебелог црева и бодовање

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Липоцалин-2 (ЛЦН-2) ЕЛИСА

Протокол је обављен према протоколу произвођача (Фисцхер Сциентифиц ДИ1857-05). Укратко, измет је сакупљен, измерен и изгњечен у ХБСС 1Кс у концентрацији од 100 мг/мЛ. Узорци су затим центрифугирани на 50 кг током 5 минута да би се уклонили велики остаци. Супернатант је затим уклоњен и стављен у нову епрувету и центрифугиран на 8000 кг током 5 минута да би се бактерије пелетирале. Овај супернатант је затим разблажен према болести животиња, али се генерално кретао од 1:100- 500 (здраво) – 1:500-1000 (третирано ДСС). Мерење мокраћне киселине Концентрација мокраћне киселине је обављена према упутствима произвођача (Инвитроген™ Амплек™Ред тест активности мокраћне/уриказе, кат. бр. А22181). Укратко, крв је сакупљена од ВТ или Цлец12а-/- мишева срчаном пункцијом у златне горње епрувете за одвајање серума. Епрувете су остављене да се згрушају 30 минута, а затим су центрифугирани на 1300 кг 10 минута. Серум је уклоњен и стављен у Еппендорф епрувете од 1,5 мл, брзо замрзнут и чуван на -80 степени Целзијуса до тестирања. Фекална мокраћна киселина је изведена добијањем свежих фекалних пелета од ВТ и Цлец12-/- мишева. Пелете су извагане и снимљене, а затим изгњечене у 1 мЛ 1к реакционог пуфера. После физичког гњечења, епрувете су центрифугиране на 50 к г током 5 минута да би се уклонили велики остаци. Преостала фекална каша је анализирана на мокраћну киселину.

Експериментални колитис преноса Т-ћелија

ВТ слезине су изоловане и изгњечене у РПМИ који садржи 10% феталног говеђег серума, пеницилина и стрептомицина. Ћелије су центрифугиране на 367 кг да би се изоловале ћелије. Добијени пелет је затим суспендован у 1к пуферу за лизу РБЦ током 5 минута, у мраку, на собној температури. Добијена бела крвна зрнца су затим пропуштена кроз Милтении ЦД4+ МАЦС колону да би се изоловале ЦД4+ Т-ћелије. Т-ћелије су затим обојене са ЦД4 и ЦДРБ и сортиране на ФАЦС Ариа Фусион (БД Биосциенцес). ЦД4+ ЦДРБхи ћелије су сакупљене и примењене на ТЦРб-/- или ТЦРб-/-; Цлец12а-/- мишеви интраперитонеално (ИП). Сваки миш је добио 5 к 105 ћелија. Озбиљност и развој колитиса праћени су недељно проценом губитка тежине. На експерименталној крајњој тачки, МЛН и дебело црево су уклоњени, а дебело црево је мерено од цекума до ректума да би се проценила тежина болести.

Изолација леукоцита из ламине проприа дебелог црева

Мишја дебело црево са причвршћеним цека је сакупљено и стављено у 1Кс ПБС у 6-плоче са бунарима на леду. Било која видљива преостала масноћа и везивно ткиво је уклоњено, а цекум је одсечен са дебелог црева. Дебела црева су отворена и слуз и измет су пажљиво уклоњени из дебелог црева пре него што су поново стављени у 6-плочу. Када су сва дебело црево распршено и остругано, свако дебело црево је исечено на коцкице на поклопцу петријеве посуде помоћу жилета и стављено у посебну епрувету од 50 мЛ. Додат је 10 мЛ претходно загрејаног раствора за дисоцијацију (1Кс ХБСС без Ца+ и Мг+, 1,5 мМ ДТТ, 10 мМ ХЕПЕС и 30 мМ ЕДТА) и епрувете су накратко вортексиране. Дебела црева су инкубирана око 25 мин. на 37 степени уз мућкање на 150 рпм док раствори не постану замућени од ИЕЦ одвајања. Узорци су промућкани 3Кс и вортексирани 15 секунди, а затим преливени преко 100 мМ филтера на 50 мл конус да би се уклониле неимуне ћелије као што су ИЕЦ, а филтери су накратко испрани са 2 мЛ ледено хладног 1Кс ПБС. Преостало ткиво је сакупљено на филтер пинцетом и премештено у нови конусни од 50 мЛ. 15 мЛ претходно загрејаног раствора за варење (1Кс ХБСС са Ца+ и Мг, 5% ФБС, 50 У/мл Диспасе ИИ [Миллипоре-Сигма, кат. бр. 4942078001], 0,5 мг/мл ДНАсе И [Вортхингтон Биоцхемицал, цат # ЛС9]002 и 0,5 мг/мЛ колагеназе Д [Миллипоре-Сигма, кат. бр. 11088866001]) је додато, узорци су кратко промешани, а затим инкубирани 45 мин. на 37 степени уз мућкање на 150 о/мин, или док се раствор не замути. Узорци су затим протресени 3к и мешани на вортексу 15 секунди. Да би се сакупиле преостале имуне цЛП ћелије, дигестирано ткиво је затим преливено преко 40 мМ филтера на конусној епрувети од 50 мЛ која садржи 10 мЛ 1Кс ПБС. Узорци су затим испрани и филтрирани са 2 мЛ ледено хладног 1Кс ПБС и центрифугирани на 800 кг током 10 минута на 4 степена. Затим је супернатант уклоњен и одбачен у вакууму. Ћелије су затим ресуспендоване у 500 мл комплетног РПМИ-а и пребројане са трипан плавим бојењем искључењем.

Проточна цитометрија

Леукоцити изоловани из цЛП-а су обојени ради одрживости коришћењем зомби боје 510 (АмЦиан) током 10 минута на собној температури у мраку. Узорци су затим блокирани Фц рецептором са ЦД-16/32 током 20 минута на 4 степена у мраку. Након центрифугирања на 367 кг током 5 минута, декантиране ћелије су обојене 30 минута у мраку на 4 степена. Сва антитела су коришћена у разблажењу од 1:250 осим ако није другачије назначено. Милелоид панел се састојао од ЦД45-БВ421, ЦД11б-ПерЦпЦи5.5, МХЦИИ-БВ605, ЦД64-БВ711, ЦКС3ЦР1-БВ785, Ли6Ц-ФИТЦ, ЦД38-ПЕ- Ци7, Ли6Г-ЦФ-594, Цлец12а-ПЕ (1:500), ЕГР2-АПЦ (интрацелуларно, 1:50). Т ћелије су се разликовале по: Зомбие дие 510 (АмЦиан), ЦД45-БВ421, ЦД3е-БВ711, ЦД4-ФИТЦ, Фокп3-АПЦ (интрацелуларни 1:50), ИЛ{{ 50}}ПЕ (интрацелуларно 1:50), ИФН-г (БВ605) (интрацелуларно 1:50), РОРгт-ПЕ610 (интрацелуларно 1:50), ИЛ-17А-БВ785 (интрацелуларно 1:50). После бојења, ћелије су испране 2 пута по 5 минута са пуфером за колону (1Кс ХБСС без Ца2+, Мг2+ и ХЕПЕС, ЕДТА, ФБС). Ћелије су фиксиране О/Н са 2% ПФА ако није било потребно интрацелуларно бојење и затим испране у колонском пуферу 2Кс пре рада на проточном цитометру. Ако је било неопходно интрацелуларно бојење, следили су се ФокП3 / пуфер за бојење транскрипционог фактора (Тонбо Биосциенцес) и протокол. Сви узорци су затим ресуспендовани у 300 ул пуфера за колону и пуштени у рад на БД ЛСР Фортесса након компензације са УлтраЦомп еБеадс (ТхермоФисхер Сциентифиц) и коришћењем појединачних контрола мрља.

Бактерије које боје ИгА

Бактерије су изоловане из фекалних пелета гњечењем у ХБСС са Ца2+ и Мг2+, у концентрацији од 100 мг фецеса по мЛ ХБСС. Згњечени измет је затим центрифугиран на 50 кг током 5 минута да би се уклонили велики остаци. Супернатант је уклоњен и стављен у нову епрувету. Ово је затим центрифугирано на 8000 кг током 5 минута да би се таложиле бактерије. Супернатант је уклоњен и пелете су испране у ХБСС са Ца2+ и Мг2+. Коначно, пелете су ресуспендоване у ХБСС у концентрацији од 100 мг/мЛ, а 10 уЛ од тога је стављено у 96-плочу са бунарима и блокирано са ХБСС са Ца2+ и Мг2+ који садржи 10% ФБС током 20 минута на собној температури. Затим је директно у узорак додато 100 уЛ анти-ИгА (ПЕ) и инкубирано 30 минута на 4 Ц у мраку. Ћелије су затим испране у ХБСС+ФБС раствору 2к и на крају ресуспендоване у ХБСС+1к Сибр®-греен и остављене да се инкубирају 20 минута у мраку на собној температури. Узорци су затим директно очитани на проточном цитометру.

Изолација коштане сржи

Коштана срж је изолована као што је претходно описано. Укратко, дуге кости из Ц57Бл/6 дивљег типа или Цлец12а-/- животиња су извађене и очишћене папирним убрусом благим трљањем. Чисте кости су држане на леду док су животиње обрађиване. Крајеви костију су благо ошишани да би се открила срж. Кост је уметнута (отворени крај окренут надоле) у 0.5 мЛ Еппендорф епрувету која је била пробушена иглом од 18 г. Ова 0.5 мЛ Еппендорф епрувета је затим стављена у Еппендорф епрувету од 1,5 мЛ и центрифугирана на 13,000 к г 1 мин. Провучена кроз коштану срж је затим лизирана еритроцитом, коришћењем пуфера за лизу еритроцита (Биолегенд) у складу са препорукама произвођача. Након лизе еритроцита, ћелије су ресуспендоване у комплетном Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (ДМЕМ) који садржи: 10% ФБС, 1мг/мЛ Пен/Стреп, ХЕПЕС 10мМ, 1к неесенцијалне аминокиселине, натријум пируват 1мМ. Ћелије су затим центрифугиране на 367 кг током пет минута да би се таложиле ћелије. Изоловане ћелије су затим коришћене за развој БМДМ-а или за даље изоловање моноцита.

Макрофаги добијени из коштане сржи

Леукоцити су изоловани из изолације коштане сржи, суспендовани у комплетном ДМЕМ-у, и пребројани путем искљученог бојења трипан плавим на хемоцитометру. Ћелије су постављене на посуде од 10 цм третиране културом ткива у концентрацији од 5-8 к 106 ћелија/плочи у 10 мЛ комплетног медијума + М-ЦСФ (20 нг/мЛ). Свежи медијум, укључујући М-ЦСФ, додат је постојећим медијима 4. и 7. дана. Потпуно диференцирани БМДМ-и су коришћени за експерименталну употребу између дана 7-9.

Изолација моноцита

Коштана срж је сакупљена од ВТ и Цлец12а-/- животиња као што је претходно описано. Моноцити су изоловани са комплетом за изолацију моноцита (БМ), мишем (Милтении Биотец) и ЛС МАЦС колоном према упутствима произвођача.

Ф. родентиум БМДМ ко-култура и РНАсек

Културе Ф. родентиум су квантификоване помоћу ОД 600нм (користећи 1 ОД 600нм=1 к 10^8 ћелија/мЛ), испране 2к у стерилном ПБС-у и заједно култивисане са 1 к 106 ћелија/мЛ потпуно диференцираних БМДМ на МОИ од 10 у 6-плочама за културу ткива у бунарима. После 24 сата заједничке културе, медијум је сакупљен и чуван на -20 Ц до даље употребе. БМДМ су испрани хладним, стерилним ПБС, 2к. Киазол (Киаген цат# 79306) РНА-стабилизациони реагенс, је затим додат директно у сваки бунар. Бунари су стругани стругачем за ћелије сакупљеним у 1,5 Еппендорф епрувете и замрзнути на -20 степени до екстракције РНК. Екстракција РНК је изведена коришћењем Дирецт-зол РНА минипреп комплета (Зимо Ресеарцх цат# Р2070) у складу са упутствима произвођача, а библиотеке секвенцирања су припремљене од стране Хунтсман Цанцер Институте Хигх-тхроугхпут Геномицс објекта. Укупна РНК је прво хибридизована са НЕБНект рРНА Деплетион китом в2 (НЕБ, цат# Е7400) да би се смањила рРНА из узорака. Библиотеке за секвенционирање уланчаних РНК су припремљене коришћењем НЕБНект Ултра ИИ Дирецтионал РНА Либрари Преп комплета за Иллумина (НЕБ, кат. # Е7760Л). Пречишћене библиотеке су квалификоване на Агилент Тецхнологиес 4150 ТапеСтатион помоћу Д1000 СцреенТапе теста (Агилент, цат# 5067-5582 и 5067-5583). Моларност молекула модификованих адаптером дефинисана је квантитативном ПЦР коришћењем Капа Биосистемс Капа Либрари Куант Кит (Роцхе, цат#07960140001). Појединачне библиотеке су нормализоване на 5 нМ у припреми за анализу Иллумина секвенце и секвенциониране на НоваСек 6000 са упареним крајем 150- циклуса секвенцирања.

Анализа цитокина

БМДМ су изоловани и узгајани као што је претходно описано. Потпуно диференцирани БМДМ су постављени на 1 к 105 ћелија/бунарићу у плоче за културу ткива 12-. БМДМ су стимулисани са 100 нг/мЛ ЛПС; 1 уг/мЛ Пам3Циск; или 1 уг/мЛ флагелина. Ћелије су стимулисане 24 сата, медијум је сакупљен и сачуван на -20 Ц за анализу. Цитокини су анализирани помоћу ЛЕГЕНДплек™ панела за инфламацију миша (13-плек) (Биолегенд, кат. бр. 740150). Подаци су анализирани коришћењем софтвера за анализу података ЛЕГЕНДплек™.

Секвенцирање гена 16с рРНА

Фекалне пелете или илеални садржај сакупљени су од појединачних мишева и одмах замрзнути на {{0}} степени у епруветама са навојним поклопцем од 2 мЛ које садрже 250 мг зрна граната од 0,15 мм (МоБио, кат. бр. {{5 }}). ДНК је екстрахована коришћењем Повер Фецал ДНК изолационог комплета (МоБио или КИАГЕН), према упутствима за комплет, и укључивала је 2 циклуса по 1 минуту ударања куглица на 4 степена на Мини-Беад-Беатер 16 (БиоСпец производи). В3 и В4 региони гена 16С рРНА су амплификовани једним кругом ПЦР-а коришћењем прајмера који су садржали (описани 3' до 5') секвенцу циљања гена 16С рРНА В3/4 региона, а затим је уследио 2-нуклеотидни јастучић секвенцама прајмера Иллумина, секвенцом нуклеотидног индекса 8- и преосталом секвенцом адаптера Иллумина. В3/4 16С-циљне секвенце су преузете од Такахасхија (Такахасхи ет ал., 2014), а индекси су преузети од Козицха (Козицх ет ал., 2013). Потпуне олигонуклеотидне секвенце које су коришћене су (индекси означени са Ксс): Прок16СВ34_За: ААТГАТАЦГГЦГАЦЦАЦЦГАГАТЦТАЦАЦКСКСКСКСКСКСКСКСАЦАЦТЦТТТЦЦЦТАЦАЦГАЦГЦТЦ ТТЦЦГАТЦТТГЦЦТАЦГГГНБГЦАСЦАГ; Прок16СВ34_Рев: ЦААГЦАГААГАЦГГЦАТАЦГАГАТКСКСКСКСКСКСКСКСГТГАЦТГГАГТТЦАГАЦГТГТГЦТЦТТЦЦ ГАТЦТГЦГАЦТАЦНВГГГТАТЦТААТЦЦ. Услови ПЦР циклуса били су следећи: почетна денатурација од 98 степени током 2 минута; 26 циклуса од 20 секунди 98 степени денатурације, 20 секунди 51,5 степени жарења, 20 секунди 72 степена екстензије; и једно последње продужење од 72 степена у трајању од 2 минута. Сваки ПЦР (изведен у три примерка за сваки узорак) је урађен у запремини од 25 ул користећи К5 Хигх-Фиделити 2Кс Мастер Мик (НЕБ, кат. # М0492Л), 5 пмол сваког прајмера и 50 нг шаблонске ДНК. Након амплификације, трипликати ПЦР-а из сваког узорка су обједињени, 5 ул је стављено на агарозни гел да се потврди амплификација, а преостали волумен је очишћен коришћењем Акиген АкиПреп МАГ ПЦР перли за чишћење (Цорнинг, кат. бр. МАГ-ПЦР-ЦЛ{{53 }}) разблажен до 62,5% у води да би се ефикасно уклонио било који димер прајмера који би био пожељно секвенциониран. Разблажена зрнца су додата при 1,8 Кс запремине ПЦР реакција, очишћена према упутствима произвођача и очишћени ампликони елуирани са 25 ул 10 мМ Трис-Цл, пХ 8,0. Ампликони су затим квантификовани пико зеленим дсДНК тестом (ТхермоФисхер, кат. #П11495) на читачу микроплоча, а затим су очишћене и индексиране појединачне библиотеке секвенционирања равномерно мултиплексиране (помоћу нг ДНК) и секвенциониране на Иллумина МиСек инструменту у упареном крају. Режим 300 циклуса у заједничком ресурсном објекту Хунтсман Цанцер Институте-а Хигх-Тхроугхпут Геномицс.

Биоинформатичка обрада података секвенце

Необрађена очитавања гена 16С рРНА су демултиплексирана омогућавајући 0 неподударности у индексима, а затим обрађене и анализиране у оквиру КИИМЕ2 (Болиен ет ал., 2019) као што смо претходно описали (Степхенс ет ал., 2021). Укратко, демултиплексиране и квалитетно филтриране секвенце су прво исечене од секвенци прајмера и линкера помоћу додатка Цутадапт, а затим су денозиране помоћу ДАДА2 (Цаллахан ет ал., 2016; Мартин, 2011). Таксономије су затим додељене АСВ-овима помоћу методе цлассифисклеарн у додатку за класификатор карактеристика, у односу на референтни скуп ГТДБ (релеасе89) који је скраћен на појачани В3/4 регион и обучен методом фит-цлассифиер-наиве-баиес (Бокулицх ет ал. , 2018; Паркс и сар., 2018; Педрегоса и сар., 2011). Метрике диверзитета, удаљености и статистичка значајност груписања бета диверзитета према перманови израчунати су у оквиру КИИМЕ2 (Андерсон, 2001).

За РНА-секве БМДМ-ова, необрађена очитања су била првог квалитета и исечена помоћу адаптера коришћењем обиља тримова, а затим је број транскрипата квантификован коришћењем Салмон у односу на транскриптом из скупа ГРЦм38 (мм10) (Патро ет ал., 2{{ 16}}17). Квантификације нивоа транскрипта су прочитане у Р коришћењем временског пакета и сумиране до броја гена пре анализе диференцијалне експресије са ДЕСек2 користећи формулу дизајна '~ Генотип + Третман + Генотип: Третман' (Лове ет ал., 2014; Лове ет ал., 2020). Диференцијални одговори на Ф. родентиум представљали су разлику између одговора сваког генотипа на третман са живим Ф. родентиум у односу на ћелије које су третиране контролно средством. Гени са значајно диференцијалном експресијом дефинисани су као они са прилагођеном п-вредношћу < 0,05 и лог2 пута променом > |0,58| (промена од 1,5 пута). Листе гена са значајно смањеном и повећаном регулацијом су затим коришћене за тестирање обогаћивања термина генске онтологије (ГО) користећи пакет цлустерПрофилер укључујући функцију поједностављења за смањење редундансе ГО термина и идентификацију кључних биолошких процеса (С, 2020; Ву ет ал. ., 2021).

Ф. родентиум ДСС изазов

Ф. родентиум је узгајан као што је претходно описано и квантификован на 1 к 109 ЦФУ/мЛ у стерилном ПБС-у. Ф. родентиум је фиксиран прво прањем 2к у стерилном ПБС, а затим ресуспендовањем у 1 мЛ 10% Фомалин-ПБС током 10 минута. Ћелије су затим испране још два пута у 10 мЛ стерилног ПБС-а да би се припремиле за оралну гаважу. Нефиксирани су испрани као фиксне ћелије и држани на леду до сонде. ВТ Ц57БЛ/6 СПФ мишеви су орално фиксирани са 100 уЛ раствора који је садржао или сам ПБС (носилац), Ф. родентиум (жив) или Ф. родентиум (фиксан) од дана -3 до 10. Животињама је дато 3,0% ДСС у данима 0-7; свежа ДСС вода се мењала сваки други дан. Ограничења тежине веће од 20% губитка тежине су наметнута као праг тежине. На експерименталним крајњим тачкама, МЛН и дебело црево су уклоњени. Дебело црево је мерено од цекума до ректума да би се одредила дужина. Ткива су затим обрађена за хистологију, екстракцију РНК или анализу проточне цитометрије.

Фагоцитозни тест

Перитонеални макрофаги су изоловани убризгавањем 5 мЛ стерилног ПБС-а у перитонеалну шупљину. ПБС је лагано мешан док је био у шупљини сваких неколико секунди. После 2 минута, ПБС је повучен коришћењем игле 28 калибра и достављен у хладан комплетан ДМЕМ. Ћелије су центрифугиране на 367 кг и испране у комплетном медијуму. Ћелије су затим избројане хемоцитометром и постављене у 12-плоче за културу ткива у концентрацији од 2,5 к 105 ћелија/мЛ. Ћелије су остављене да приањају преко ноћи. Следећег дана, бунари су нежно мешани мешањем и аспирација медија. Адхерентне ћелије су затим испране два пута са 500 уЛ хладног, стерилног, ПБС. Претходно загрејан комплетан ДМЕМ који садржи Ф. родентиум на МОИ од 10 је затим додат адхерентном (макрофагу). Плоче су затим лагано центрифугиране на 200 кг, на собној температури током три минута и затим инкубиране у стандардним условима ћелијске културе (37 Ц, 5% ЦО2) током 90 минута. Ф. родентиум је припремљен како је описано за ко-културу БМДМ-а само за секвенцирање РНК, након испирања, ћелије су ресуспендоване у 1к Сибр® зеленом (Сигма-Алдрицх ЦАС: 163795-75-3), на собној температури 20 минута. Бактеријске ћелије су затим пелетиране на 4000 рпм током 5 минута, ресуспендоване са комплетним ДМЕМ-ом и претходно загрејане за перитонеалне макрофаге. После 90 минута ко-културе, медијум је аспириран, а ћелије су испране два пута хладним, стерилним, ПБС. Адхерентне ћелије које садрже Сибр® зелено обојену Ф. родентиум су фиксиране са 2% параформалдехида (ПФА) током 10 минута. ПФА је аспириран и стерилни ПБС је стављен на ћелије. Ћелије су затим снимљене за фагоцитозу Ф. родентиум

Анализа слике макрофага

Бригхтфиелд и флуоресцентне слике култура макрофага третираних Ф. родентиумом су снимљене коришћењем ЕВОС м7000 Имагинг Систем (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА). За сваку културу снимљено је три до пет одвојених насумичних слика, које су изведене у три примерка.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

ЦЛЕЦ12А-Фц конструкција фузионог протеина анд пурифицатина

цДНК које кодирају екстрацелуларне домене Цлец12а миша су амплификоване ПЦР-ом из белих крвних зрнаца изолованих из Ц57Бл/6 ВТ СПФ коштане сржи и потврђене секвенцирањем. цДНК су фузионисане за Ц-терминус хуманог ИгГ1-Фц у експресионом вектору пФусе-хИгГ1- Фц2 (ИнвивоГен). Конструкти који садрже Цлец12а или празан вектор су трансфектовани у ћелије Лк293 култивисане са ДМЕМ +10% ФБС и Пен/стреп (1 мг/мЛ). Излучени фузиони протеини су сакупљени из медијума 24-48 после трансфекције. Медијум је центрифугиран на 367 кг током 5 минута да би се уклонили остаци/мртве ћелије, а супернатант је замрзнут на -20 Ц до употребе. Цлец12а-Фц или Фц-онли фузиони протеини су изоловани са Пиерце™ Цлассиц Магнетиц ИП/Цо-ИП комплетом (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Каталошки број: 88804), квантификовани са Пиерце™ БЦА Протеин Ассаи Китом (Тхермо Фисхер Сциентифиц Каталошки број: 233) и потврђено Вестерн блот-ом коришћењем антиЦлец12а антитела (Новус Биологицалс НБП2-27346СС).

Цлец12а-Фц-везујући тест

Пречишћени конструкти су разблажени до 0.4 мг/мЛ у ХБСС са Ца2+ и Мг2+. Бактерије су узгајане у одговарајућим медијумима и аеробним условима и нормализоване за ОД 600нм. Бактерије су испране са ХБСС са Ца2+ и Мг2+ и блокиране са ХБСС в/ Ца2+ и Мг{{8}% ФБС током 20 минута на собној температури. Све процедуре бојења су се одвијале у атмосферским условима. 1 к 107 бактеријских ћелија је стављено у 96-плочу са округлим дном, центрифугирано на 3,000 кг и декантирано. 50 уЛ конструкта је стављено на бактеријске ћелије, лагано помешано и инкубирано на 4 Ц током 1 сата. Ћелије бактерија су испране са ХБСС са Ца2+ и Мг2+ + 10% ФБС, 2к. 50 уЛ козјег анти-хуманог Фц (ПЕ) (Ебиосциенце Цаталог # 12-4998-82) је додато ћелијама и инкубирано на 4 Ц током 1 сата, у мраку. Ћелије су затим испране као и раније и стављене у ХБСС са Ца2+ и Мг2+ који садржи 1к Сибр® греен (Сигма-Алдрицх ЦАС: 163795-75-3). Ћелије су инкубиране на собној температури 20 минута у мраку и одмах очитане на БД ЛСР Фортесса проточном цитометру.

Озрачење и реконституција коштане сржи

Коштана срж је сакупљена од ВТ и Цлец12а-/- животиња као што је претходно описано. Примљени мишеви примаоци су смртоносно озрачени са 500 Радс на дан -1, а затим са 400 Радс на дан 0. Четири сата након последњег озрачивања, мишеви примаоци су стављени под анестезију изофлураном и 100 уЛ изолованог ћелије коштане сржи суспендоване у стерилном ПБС (1 к 108 ћелија/мЛ) су испоручене преко игле 28,5 у ретро-орбитални простор. Били смо заинтересовани за микробиоту, тако да животиње нису стављене на антибиотике, а након 8 недеља сакупљене су фекалне пелете за пренос микробиоте у ГФ животиње.

РЕФЕРЕНЦЕ

Андерсон, МЈ (2001). Нова метода за непараметарску мултиваријантну анализу варијансе. Аустрал Ецол. 26, 32-46. ДОИ 10.1111/ј.1442-9993.2001.01070.пп.к.

Бегун, Ј., Лассен, КГ, Јијон, ХБ, Бакт, ЛА, Гоел, Г., Хеатх, РЈ, Нг, А., Там, ЈМ, Куо, СИ, Виллабланца, ЕЈ, ет ал. (2015). Интегрисана геномика варијанте ризика Црохнове болести

идентификује улогу ЦЛЕЦ12А у антибактеријској аутофагији. Реп. ћелије 11, 1905-1918. 10.1016/ј.целреп.2015.05.045.

Бландер, ЈМ, Лонгман, РС, Илиев, ИД, Сонненберг, ГФ, и Артис, Д. (2017). Регулација упале интеракцијама микробиоте са домаћином. Нат. Иммунол. 18, 851-860. 10.1038/ни.3780.

Бокулицх, НА, Каехлер, БД, Ридеоут, ЈР, Диллон, М., Болиен, Е., Книгхт, Р., Хуттлеи, ГА, и Цапорасо, ЈГ (2018). Оптимизација таксономске класификације секвенци ампликона маркер-гена са КИИМЕ 2 ''ск2-додатком за класификацију карактеристика. Микробиом 6. АРТН 90 10.1186/с40168-018-0470-з.

Болиен, Е., Ридеоут, ЈР, Диллон, МР, Бокулицх, Н., Абнет, ЦЦ, Ал-Гхалитх, ГА, Алекандер, Х., Алм, ЕЈ, Арумугам, М., Асницар, Ф., ет ал. (2019). Поновљива, интерактивна, скалабилна и проширива наука о микробиомским подацима користећи КИИМЕ 2. Нат. Биотецхнол. 37, 852-857. 10,1038/с41587-019-0209-9.

Бровн, ГД, Виллмент, ЈА, и Вхитехеад, Л. (2018). Лектини Ц-типа у имунитету и хомеостази. Нат. Рев. Иммунол. 18, 374-389. 10,1038/с41577-018-0004-8.

Бровне, ХП, Форстер, СЦ, Аноние, БО, Кумар, Н., Невилле, БА, Старес, МД, Гоулдинг, Д., и Лавлеи, ТД (2016). Узгој 'некултурне' људске микробиоте открива нове таксоне и екстензивну спорулацију. Природа 533, 543-+. 10.1038/натуре17645.

Цадвелл, К., Лиу, ЈИ, Бровн, СЛ, Мииосхи, Х., Лох, Ј., Леннерз, ЈК, Кисхи, Ц., Кц, В., Царреро, ЈА, Хунт, С., ет ал. (2008). Кључна улога аутофагије и гена аутофагије Атг16л1 у Панетх ћелијама црева миша и човека. Природа 456, 259-263. 10.1038/натуре07416.

Цаллахан, БЈ, МцМурдие, ПЈ, Росен, МЈ, Хан, АВ, Јохнсон, АЈА и Холмес, СП (2016). ДАДА2: Закључак узорка високе резолуције из података ампликона Иллумина. Нат. Методе 13, 581-+. 10.1038/Нметх.3869.

Цао, ИГ, Бае, С., Вилларреал, Ј., Мои, М., Цхун, Е., Мицхауд, М., Ланг, ЈК, Глицкман, ЈН, Лобел, Л., анд Гарретт, ВС (2022). Фаецалибацулум родентиум ремоделира сигнализацију ретиноичне киселине за управљање хомеостазом цревног епитела зависне од еозинофила. Ћелијски домаћин и микроб 30, 1295- 1310 е1298. 10.1016/ј.цхом.2022.07.015.

Цханг, ДХ, Рхее, МС, Ахн, С., Банг, БХ, Ох, ЈЕ, Лее, ХК, и Ким, БЦ (2015). Фаецалибацулум родентиум ген. нов., сп. нов., изолован из фецеса лабораторијског миша. Антоние Ван Лееувенхоек 108, 1309-1318. 10.1007/с10482-015-0583-3.

Цхиаро, ТР, Сото, Р., Степхенс, ВЗ, Кубинак, ЈЛ, Петерсен, Ц., Гогокхиа, Л., Белл, Р., Делгадо, ЈЦ, Цок, Ј., Вотх, В., ет ал. (2017). Члан микобиоте црева модулира метаболизам пурина домаћина што погоршава колитис код мишева. Сци. Трансл. Мед. 9, .

Дроуин, М., Саенз, Ј., и Цхиффолеау, Е. (2020). Ц-тип рецептори слични лектину: глава или реп у имунитету на смрт ћелије. Фронт. Иммунол. 11. АРТН 251 10.3389/фимму.2020.00251.

Фассарелла, М., Блаак, ЕЕ, Пендерс, Ј., Наута, А., Смидт, Х., и Зоетендал, ЕГ (2021). Стабилност и отпорност цревног микробиома: разјашњавање одговора на пертурбације у циљу модулације здравља црева. Гут 70, 595-605. 10.1136/гутјнл-2020-321747.

Гкоускоу, КК, Делигианни, Ц., Тсатсанис, Ц., и Елиопоулос, АГ (2014). Микробиота црева у мишјим моделима инфламаторне болести црева. Фронтиерс ин Целлулар анд Инфецтион Мицробиологи 4. АРТН 28 10.3389/фцимб.2014.00028.

Хан, ИМ, Зханг, МХ, Ли, Н., Цхен, ТИ, Зханг, И., Ван, Т., и Цао, КСТ (2004). КЛРЛ1, нови рецептор налик лектину ћелије убице, инхибира цитотоксичност природних ћелија убица. Крв 104, 2858-2866. ДОИ 10.1182/крв-2004-03-0878.

Илиев, ИД, Фунари, ВА, Таилор, КД, Нгуиен, К., Реиес, ЦН, Стром, СП, Бровн, Ј., Бецкер, ЦА, Флесхнер, ПР, Дубински, М., ет ал. (2012). Интеракције између комензалних гљива и лектинског рецептора Ц-типа Децтин-1 утичу на колитис. Наука 336, 1314-1317. 10.1126/сциенце.1221789.

Јасон Л. Кубинак, ВЗС, Раи Сото, Цхариссе Петерсен, Тисон Цхиаро, Ласха Гогокхиа, Рицкесха Бел1, Надим Ј. Ајами, Јосепх Ф. Петросино, Линда Моррисон4, Ваине К. Поттс, Петер Е. Јенсен, Риан М. О' Цоннелл & Јуне Л. рунда (2015). МХЦ варијација обликује индивидуализоване микробне заједнице које контролишу осетљивост на ентеричку инфекцију. Комуникација природе. 0,1038/нцоммс9642.

Коно, Х., Цхен, ЦЈ, Онтиверос, Ф., и Роцк, КЛ (2010). Мокраћна киселина подстиче акутни инфламаторни одговор на смрт стерилних ћелија код мишева. Ј. Цлин. Инвест. 120, 1939-1949. 10.1172/Јци40124.

Козицх, ЈЈ, Вестцотт, СЛ, Бактер, НТ, Хигхландер, СК, и Сцхлосс, ПД (2013). Развој стратегије секвенцирања са двоструким индексом и курира за анализу података о секвенци ампликона на МиСек Иллумина платформи за секвенцирање. Примењена микробиологија животне средине 79, 5112-5120. 10.1128/Аем.{6}}.

Кубинак, ЈЛ, Петерсен, Ц., Степхенс, ВЗ, Сото, Р., Баке, Е., О'Цоннелл, РМ, и Роунд, ЈЛ (2015). МиД88 сигнализација у Т ћелијама усмерава ИгА посредовану контролу микробиоте да унапреди здравље. Целл Хост Мицробе 17, 153-163. 10.1016/ј.цхом.2014.12.009.

Ли, К., Неуманн, К., Духан, В., Наминени, С., Хансен, АЛ, Вартевиг, Т., Кургиис, З., Холм, ЦК, Хеикенвалдер, М., Ланг, КС, и Руланд, Ј. (2019). Рецептор кристала мокраћне киселине Цлец12А потенцира одговоре на интерферон типа И. Проц Натл Ацад Сци УСА 116, 18544-18549. 10.1073/пнас.1821351116.

Лиу, ЈЗ, ван Соммерен, С., Хуанг, Х., Нг, СЦ, Албертс, Р., Такахасхи, А., Рипке, С., Лее, ЈЦ, Јостинс, Л., Схах, ​​Т., ет ал . (2015). Анализе удружења идентификују 38 локуса осетљивости на инфламаторну болест црева и истичу заједнички генетски ризик међу популацијама. Нат. Генет. 47, 979-986. 10.1038/нг.3359.

Лове, МИ, Хубер, В. и Андерс, С. (2014). Умерена процена промене набора и дисперзије за РНА-сек податке са ДЕСек2. Геноме Биол. 15. АРТН 550 10.1186/с13059-014-0550-8.

Лове, МИ, Сонесон, Ц., Хицкеи, ПФ, Јохнсон, ЛК, Пиерце, НТ, Схепхерд, Л., Морган, М., и Патро, Р. (2020). Ткимета: Контролне суме референтне секвенце за идентификацију порекла у РНА-секв. Плос Цомпутатионал Биологи 16. АРТН е1007664 10.1371/јоурнал.пцби.1007664.

Луо, И., Туцкер, СЦ, анд Цасадевалл, А. (2005). Активација рецептора Фц и комплемента стимулише прогресију ћелијског циклуса ћелија макрофага од Г1 до СЈ Иммунол. 174, 7226- 7233. 10.4049/јиммунол.174.11.7226.

Мацпхерсон, АЈ, Гатто, Д., Саинсбури, Е., Харриман, ГР, Хенгартнер, Х., и Зинкернагел, РМ (2000). Примитивни механизам независан од Т ћелија ИгА одговора цревне слузокоже на комензалне бактерије. Наука 288, 2222-+. ДОИ 10.1126/сциенце.288.5474.2222.

Маглинао, М., Ерикссон, М., Сцхлегел, МК, Зиммерманн, С., Јоханнсен, Т., Готзе, С., Сеебергер, ПХ, и Лепениес, Б. (2014). Платформа за скрининг угљених хидрата који се везују за лектински рецептор Ц-типа и њихов потенцијал за циљање специфично за ћелије и имунолошку модулацију. Јоурнал оф Цонтроллед Релеасе 175, 36-42. 10.1016/ј.јцонрел.2013.12.011.

Марсхалл, АСЈ, Виллмент, ЈА, Лин, ХХ, Виллиамс, ДЛ, Гордон, С., и Бровн, ГД (2004). Идентификација и карактеризација новог хуманог мијелоидног инхибиторног ц-типа лектинског рецептора (МИЦЛ) који је претежно експримиран на гранулоцитима и моноцитима. Ј. Биол. Цхем. 279, 14792-14802. 10.1074/јбц.М313127200.

Мартин, М. (2011). Цутадапт уклања секвенце адаптера из секвенцијских читања високог протока. ЕМБНет.јоурнал 17. Мартинез-Лопез, М., Иборра, С., Цонде-Гарроса, Р., Мастрангело, А., Данне, Ц., Манн, ЕР, Реид, ДМ, Габориау-Роутхиау, В., Цхапарро , М., Лорензо, МП, ет ал. (2019). Сензор микробиоте помоћу Минцле-Сик осе у дендритским ћелијама регулише производњу интерлеукина-17 и -22 и промовише интегритет цревне баријере. Имунитет 50, 446-461 е449. 10.1016/ј.иммуни.2018.12.020.

Мартинон, Ф., Петрилли, В., Маиор, А., Тардивел, А., и Тсцхопп, Ј. (2006). Кристали мокраћне киселине повезани са гихтом активирају НАЛП3 инфламазом. Природа 440, 237-241. 10.1038/натуре04516.

Накајима, А., Вогелзанг, А., Маруиа, М., Мииајима, М., Мурата, М., Сон, А., Кувахара, Т., Тсуруиама, Т., Иамада, С., Мацуура, М., ет ал. (2018). ИгА регулише састав и метаболичку функцију цревне микробиоте промовишући симбиозу између бактерија. Ј. Екп. Мед. 215, 2019-2034. 10.1084/јем.20180427.

Неуманн, К., Цастинеирас-Виларино, М., Хоцкендорф, У., Ханнессцхлагер, Н., Лемеер, С., Купка, Д., Меиерманн, С., Лецх, М., Андерс, ХЈ, Кустер, Б. , ет ал. (2014). Цлец12а је инхибиторни рецептор за кристале мокраћне киселине који регулише упалу као одговор на смрт ћелије. Имунитет 40, 389-399. 10.1016/ј.иммуни.2013.12.015.

Окаи, С., Усуи, Ф., Иокота, С., Хори, ИИ, Хасегава, М., Накамура, Т., Куросава, М., Окада, С., Иамамото, К., Нисхииама, Е., ет. ал. (2016). Моноклонски ИгА високог афинитета регулише микробиоту црева и спречава колитис код мишева. Нат Мицробиол 1, 16103. 10.1038/нмицробиол.2016.103.

Пабст, О., и Слацк, Е. (2020). ИгА и цревна микробиота: важност специфичности. Муцосал Иммунол. 13, 12-21. 10,1038/с41385-019-0227-4.

Паркс, ДХ, Цхувоцхина, М., Ваите, ДВ, Ринке, Ц., Скарсхевски, А., Цхаумеил, ПА, и Хугенхолтз, П. (2018). Стандардизована бактеријска таксономија заснована на филогенији генома значајно ревидира дрво живота. Нат. Биотецхнол. 36, 996-+. 10.1038/нбт.4229.

Патро, Р., Дуггал, Г., Лове, МИ, Иризарри, РА, и Кингсфорд, Ц. (2017). Лосос обезбеђује брзу квантификацију експресије транскрипта са свесном пристрасношћу. Нат. Методе 14, 417-+. 10.1038/нметх.4197.

Педрегоса, Ф., Варокуаук, Г., Грамфорт, А., Мицхел, В., Тхирион, Б., Грисел, О., Блондел, М., Преттенхофер, П., Веисс, Р., Дубоург, В., ет ал. (2011). Сцикит-леарн: Машинско учење у Питхон-у. Ј Мацх Леарн Рес 12, 2825-2830.

Пиз, Е., Хуисамен, Ц., Марсхалл, АС, Гордон, С., Таилор, ПР, и Бровн, ГД (2008). Карактеризација мишјег МИЦЛ (ЦЛЕЦ12А) и доказ за ендогени лиганд. ЕУР. Ј. Иммунол. 38, 1157-1163. 10.1002/еји.200738057.

Раулф, МК, Јоханнсен, Т., Маттхиесен, С., Неуманн, К., Хацхенберг, С., Маиер-Ламбертз, С., Стеинбеис, Ф., Хегерманн, Ј., Сеебергер, ПХ, Баумгартнер, В., ет ал. (2019). Лектински рецептор Ц-типа ЦЛЕЦ12А препознаје плазмодијални хемозоин и доприноси развоју церебралне маларије. Реп. ћелије 28, 30-38 е35. 10.1016/ј.целреп.2019.06.015.

Раи, А., и Диттел, БН (2015). Међусобна повезаност између дисбиозе у микробиоти црева због имунодефицијенције и пенетрације болести колитиса. Имунологија 146, 359-368. 10.1111/имм.12511.

Ределингхуис, П., Вхитехеад, Л., Аугелло, А., Друммонд, РА, Левескуе, ЈМ, Ваутиер, С., Реид, ДМ, Керсцхер, Б., Таилор, ЈА, Нигровић, ПА, ет ал. (2016). МИЦЛ контролише упалу код реуматоидног артритиса. Анн. Рхеум. Дис. 75, 1386-1391. 10.1136/аннрхеумдис-2014-206644.