Клонирање, функционална идентификација и анализа експресије халкон синтазе из Цистанцхе Тубулоса

Апстракт: Циљ

За проучавање функцијехалкон синтаза из Цистанцхе тубулосаи образац експресије ЦтЦХС гена у белим, црвеним и љубичастим цветовима.

МетодеЦтЦХС ген је клониран РТ-ПЦР и извршена је биоинформатичка анализа. ПЕТ-28а-ЦтЦХС плазмид је пребачен у Есцхерицхиа цоли да би се индуковала експресија протеина помоћу ИПТГ. ЦтЦХС рекомбинантни протеин је инкубиран са супстратима п-кумароил ЦоА и малонил ЦоА, а производи су детектовани помоћу ХПЛЦ и МС. ПЦАМБИА1300-35С-ГФП-ЦтЦХС плазмид је пребачен у протопласт Арабидопсис тхалиана да би се посматрала субћелијска локализација ЦтЦХС протеина. Образац експресије ЦтЦХС гена у цветовима Ц. тубулоса са три боје детектован је кРТ-ПЦР.

РезултатиЦтЦХС ген је клониран. Дужина отвореног оквира читања (ОРФ) била је 1173 бп, која је кодирала 390 аминокиселина, а молекулска тежина протеина је била 42 8000.

ОРГАНСКИ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНЦХЕ СА 30% ЕХИНАКОЗИДА И 12% АКТЕОЗИДА

ЦтЦХС је садржао каталитичке остатке Цис164, Хис303, Асн336, који су конзервирани у халкон синтази. ЦтЦХС протеин је експримиран у Е. цоли и пречишћен да би се добио рекомбинантни протеин. ЦтЦХС протеин би могао да катализира п-кумароил ЦоА и малонил ЦоА да произведе нарингенин халкон. ЦтЦХС протеин је углавном био локализован у цитоплазми. ЦтЦХС ген је био високо експримиран у љубичастим и црвеним цветовима, а релативни нивои експресије су били 8,44 и 3,21 пута већи од оних у белим цветовима.

Закључак ЦтЦХС ген је клониран из цвета Ц. тубулоса и експримиран је протеин. ЦтЦХС протеин има функцију халкон синтазе, а експресија ЦтЦХС гена је већа у тамнијим цветовима, што указује да ген ЦтЦХС може регулисати боју цвета Ц. тубулоса, што поставља основу за даља истраживања механизма регулације боје цвета Ц. тубулоса.

Кључне речи: Цистанцхе тубулоса (Сцхенк) Вигхт; халкон синтаза; анализа активности ензима; субцелуларна локализација; анализа израза

Цистанцхе Тубулоса(СЦХЕНК) ВИГХТ је биљка из рода Пиреал, која је природно распрострањена у јужном Синђијангу [1] у области Хетиан у Синђијангу [2]. Цветови луле имају високу лековиту вредност. Његове месне стабљике су један од извора верзије за 2020.Кинеска фармакопеја". [3] Истраживања на цветовима луле, стабљике меса кордонуса су се повећала, али постоји релативно мало биолошких истраживања на његовим цветовима. Период цветања цветова луле је од априла до маја [4], углавном постоје три боје беле , црвени и љубичасти цветови су богате боје, али њихов механизам регулације боје цвета није пријављен и генетски фактори [5] Пигмент у биљном цвећу углавном обухвата три категорије: флавоноиди, каротен и беетин, најшири спектар боја [7]. као три варијанте Паеониа Лацтифлора Палл.

Појављује се као бела, а главна боја боје садржи боју црвене и лепа компетенција чини цветове присутним као љубичасто-црвено [8]. Цветна боја је важна карактеристика многих украсних биљака, а такође је и кључни фактор који привлачи ружичасте инсекте [9]. Истраживања су показала да се преноси. Највећа учесталост посета инсеката је тамнољубичаста биљка цистанче [10]. За биолошка истраживања синтетичких генетских истраживања цистаноида у цвјетовима цистаносауруса у цвјетовима, погодно је за разјашњавање механизма контроле бојења кордона цвијећа у цијеви, пружајући теоријску основу за побољшање боје технологије генетског инжењеринга, промовишући њене богатије боје, повећавајући прегледност, проширење обима апликација.

Биосинтетички пут одфлавоноидипочиње сафенилпропаноидни пут. Фенилаланин се прво претвара у циметну киселину под дејством фенилаланин амонијалазе (ПАЛ), а циметна киселина се 4-хидроксилише циметном киселином. Ензим (циметна киселина-4-хидроксилаза, Ц4Х) и 4-кумарат коензим А лигаза (4-кумарат коензим А лигаза, 4ЦЛ) катализују реакцију за стварање 4-кумароил-ЦоА [11]. Један молекул 4-кумароил-ЦоА и три молекула малонил-ЦоА катализовани су халкон синтазом (ЦХС) да би се створио нарингенин халкон, који имафлавоноидна једињења.Основни скелет халкон изомеразе, флаванон{0}}хидроксилазе, дихидрофлавонол 4-редуктазе итд. генерише низ флавоноида као што су изофлавони, флавоноли, антоцијанини, итд. [12]. Као кључни ензим у путу биосинтезе флавоноида, ЦХС регулише садржај флавоноида у биљкама и такође игра важну улогу у регулисању боје цветова биљака [13]. На пример, пост-транскрипционо утишавање гена Гентиана сцабра Бунге ЦХС може инхибирати биосинтезу антоцијанина и изазвати специфично избељивање режњева крунице [14]. Утишавање ЦХС гена Ацтинидиа ериантха Бентх. ЦХС смањује садржај антоцијанина у латицама и изазива Боја црвених латица постаје светлија [15]. Стога је у овој студији клониран ЦтЦХС ген из цвећа Цистанцхе десертицола, а на њему су обављена биоинформатичка анализа, експресија и пречишћавање прокариота, анализа активности ензима, анализа субћелијске локализације и анализа експресије у три боје цветова како би се истражила функција ЦтЦХС. протеин и образац експресије ЦтЦХС гена коришћени су за прелиминарно истраживање односа између ЦтЦХС и боје цветова Цистанцхе десертицола, што је поставило основу за проучавање регулаторног механизма боје цвета Цистанцхе десертицола.

1 Материјали и инструменти

1.1 Материјали

Цветови Цистанцхе тубероса сакупљени су из округа Иутиан, префектура Хотан, Ксињианг у мају 2018. Насумични принцип је испоштован током узорковања и одабрани су цветови Цистанцхе тубероса са добрим физиолошким статусом и доследном висином биљке. Професор Ту Пенгфеи са Фармацеутског факултета Универзитета у Пекингу узео је три соја Цистанцхе десертицола са три цветне боје беле, црвене и љубичасте и идентификоване као Цистанцхе тубулоса (Сцхенк) Вигхт. Брзо су замрзнути у течном азоту, ускладиштени на сувом леду и транспортовани у Пекинг. Хемијски компетентне ћелије Е. цоли ДХ5 су купљене од Нањинг Новезан Биотецхнологи Цо., Лтд., а хемијски компетентне ћелије Е. цоли БЛ21 (ДЕ3) су купљене од Беијинг Куансхијин Биотецхнологи Цо., Лтд.; пЕТ-28а, пЦАМБИА1300-35С-ГФП Вектор је купљен од Вухан Трансдуцтион Биологи Лаборатори Цо., Лтд. Малонил-ЦоА је купљен од компаније Сигма, 4-кумароил-ЦоА, нарингенин -халкон је купљен од Схангхаи Иуание Биотецхнологи Цо., Лтд., а нарингенин је купљен од Схангхаи МцЛеан Биоцхемицал Тецхнологи Цо., Лтд.

1.2 Инструменти

Нанодроп 2000Ц спектрофотометар (Тхермо Фисхер Цомпани, САД); градијент ПЦР инструмент (Еппендорф Цомпани, Немачка); ЦФКС 96 флуоресцентни квантитативни ПЦР инструмент, УВП гел снимач, инструмент за гел електрофорезу, инструмент за електрофорезу протеина (БиоРад Цомпани, САД) ; ЕнСпире

Читач микроплочица (ПеркинЕлмер Цомпани, САД); инкубатор константне температуре (Схангхаи Јингхонг Екпериментал Екуипмент Цо., Лтд.); ДХЗ-Д осцилатор пуног капацитета великог капацитета (Фабрика експерименталне опреме Таицанг); ТХЗ-82Осцилатор константне температуре воденог купатила (Јиангсу Кеки Инструмент Цо., Лтд.); АИРТЕЦХ ултра чист радни сто (Сузхоу Антаи Аир Тецхнологи Цо., Лтд.); парни стерилизатор високог притиска (ТОМИ Цомпани, Јапан); Милли К инструмент за чисту воду (Миллипоре, Сједињене Државе); ЛЦ-20Хроматограф течне фазе високе ефикасности (Схимадзу Цомпани, Јапан); УПЛЦ-К-Екацтиве-Орбитрап масена спектрометрија високе резолуције (Тхермо Фисхер Цомпани, САД); ФВ1200 ласерски конфокални микроскоп (Олимпус Цомпани, Јапан).

2 Експерименталне методе

2.1 Екстракција РНК и синтеза цДНК. Цветови цистанцхе десертицола су млевени у течном азоту, а затим подвргнути тесту екстракције РНК.

Укупна РНК је екстрахована помоћу комплета (Норген, Цат 17200), концентрација и квалитет РНК су детектовани помоћу НаноДроп 2000Ц, а узорци РНК са односом А260/А280 између 1,8 и 2,1 су одабрани за синтезу цДНК реверзне транскрипције. М-МЛВ реверзна транскриптаза (Промега, М170Б) је коришћена за реверзну транскрипцију квалификоване укупне РНК у цДНК. Експерименталне операције су изведене према упутствима.

2.2 Клонирање ЦтЦХС гена

На основу података о транскриптому цвета Цистанцхе десертицола наше истраживачке групе [16], ЦтЦХС са комплетним отвореним оквиром читања је скриниран, а софтвер СнапГене је коришћен за дизајнирање специфичних прајмера на основу секвенце гена (Табела 1). ПЦР амплификација је изведена коришћењем цДНК цвета Цистанцхе десертицола као шаблона. Систем амплификације је био 2×Пханта Мак пуфер 25 μЛ, дНТП Мик (10 ммол/Л) 1 μЛ, узводни и низводни прајмери ​​(10 μмол/Л) по 2 μЛ, цДНК 2 μЛ, Пханта Мак Супер-Фиделити

ДНК полимераза 1 μЛ, ддХ2О 17 μЛ. Услови реакције су били: пре-денатурација на 95 степени у трајању од 3 мин; 25 циклуса денатурације на 95 степени у трајању од 15 с, жарење на 55 степени у трајању од 15 с и продужење на 72 степена у трајању од 1 мин; и продужавање реакције на 72 степена током 5 мин. ПЦР производ је детектован електрофорезом 1% агарозног гела, а комплет за пречишћавање ДНК (Новизан, Цат ДЦ301-01) је коришћен за опоравак гела, а затим је добијена ДНК пречишћена комплетом за брзо клонирање (Новизан, Цат Ц601-01). Фрагмент ДНК је повезан са пЦЕ2 ТА/Блунт-Зеро вектором, трансформисан у Есцхерицхиа цоли ДХ5 компетентне ћелије, и након култивисања преко ноћи на 37 степени, одабрани су појединачни клонови сојеви и послати компанији на секвенцирање.

Табела 1 Прајмер секвенце

2.3 Биоинформатичка анализа

Користите онлајн софтвер ПротПарам за анализу физичких и хемијских својстава протеина; користите онлајн алатку Прот Сцале за анализу хидрофилности/хидрофобности протеина; користите онлајн алат СОПМА за предвиђање секундарне структуре протеина; користити софтвер за онлајн анализу СВИСС-МОДЕЛ за предвиђање терцијарне структуре протеина; користите онлајн софтвер ТМХММ Предвидите трансмембранску структуру протеина; користите ДНАМАН софтвер да упоредите хомологију ЦтЦХС са секвенцама аминокиселина ЦХС других врста; користите МЕГА-Кс софтвер за конструисање филогенетског стабла, користећи спајање суседа (Њ) и Поиссонову корекцију. Еволуциона удаљеност се израчунава коришћењем Боотстрап методе, а број Боотстрап понављања је 1000 пута.

За даљу детекцију је коришћен УПЛЦ-К-Екацтиве-Орбитрап МС. Услови течне фазе су били Ватерс Ацкуити УПЛЦ БЕХ Схеилд РП18 колона (100 мм × 3.0 мм, 1,7 μм), температура колоне 40 степена, нарингенин , халкон и нарингенин. Запремина пуњења контролне супстанце је 4 μЛ, а запремина пуњења производа ензимске реакције је 7 μЛ. Вода (А)-ацетонитрил (Б) се користи као мобилна фаза. Градијент елуирања је: 0 до 5 мин, 30% Б; 5 до 15 мин. , 30%~60% Б; 15~20 мин, 60%~100% Б; 20~25 мин, 100% Б; 25~31 мин, 100%~30% Б. Волуметријски проток је 0,3 мЛ/мин. Услови масене спектрометрије су електроспреј јонски извор, азот као гас носач, притисак гаса у омотачу 3,5 МПа, притисак помоћног гаса 1,0 МПа, притисак распршивања 3500 В, температура капилара 350 степени, температура загревања помоћног гаса 200 степени, позитивни и негативни јонски режими, скенирање опсег јона м/з је 100-1500, пуна МС резолуција је 35 000, дд-МС2 резолуција је 17 500, (Н)

ЦЕ/степпед нце постављено на 35, 60.

2.6 Субцелуларна локализација ЦтЦХС протеина

На основу ЦтЦХС секвенце и принципа бешавног клонирања, дизајнирани су прајмери ​​са местима за сечење ензима Кпн Ⅰ и БамХ Ⅰ, а одговарајући циљни фрагменти су амплификовани ПЦР-ом. ПЦАМБИА1300-35С-ГФП плазмид је дигестиран са рестрикцијским ендонуклеазама Кпн Ⅰ и БамХ Ⅰ, а циљни фрагмент и вектор су повезани преко комплета за бешавно клонирање (Новизан, Цат Ц115-01), а затим пребачени у Е. цоли ДХ5 компетентне ћелије. , одабрати појединачне клонске сојеве за секвенцирање и издвојити плазмиде из тачних сојева. Плазмиди пЦАМБИА1300-35С-ГФП-ЦтЦХС и пЦАМБИА 1300-35С-ГФП су трансформисани у протопласте Арабидопсис тхалиана коришћењем ПЕГ4000 и култивисани при слабом осветљењу 8 до 10 сати. Субцелуларна локализација ЦтЦХС протеина је примећена под ласерским конфокалним микроскопом.

2.7 Анализа узорка експресије ЦтЦХС

На основу ЦтЦХС секвенце, ДНАМАН је коришћен за дизајнирање квантитативних прајмера за флуоресценцију у реалном времену, са Ф-боксом као интерним референтним геном. Секвенце прајмера су приказане у Табели 1. Релативна експресија ЦтЦХС у цветовима Цистанцхе десертицола различитих боја је детектована квантитативним ПЦР-ом флуоресценције у реалном времену. Користите ТрансСтарт Греен кПЦР СуперМик (пуно злато, АК101-02) за мерење методом СИБР Греен флуоресцентне боје, реакциони систем: 2×ТрансСтарт Греен кПЦР СуперМик 5 μЛ, узводни и низводни прајмери ​​(10

μмол/Л) {{0}}.2 μЛ сваки, цДНК шаблон 0,5 μЛ, вода без нуклеотидазе 4,1 μЛ, за реакцију је коришћена метода у два корака, а поступак реакције је заснован на методи од Донг Ксиањуан ет ал. [18]. Сваки узорак је садржао 3 биолошке реплике, а експеримент је поновљен три пута. Експериментални подаци су анализирани помоћу програма Екцел до 2

Релативна експресија ЦтЦХС је израчуната коришћењем −ΔΔЦт методе, а ГрапхПад Присм 8 је коришћен за анализу значајности и цртање хистограма.