Комбиновање микромехурића контрастног средства са пулсним ласерским зрачењем за трансдермално испоруку лекова, део 1

Апстрактан: Оптодинамички процес ласерски индуковане кавитације микромехурића (МБ) у течностима се користи у различитим медицинским применама. Међутим, ретко се процењује како инцидентно ласерско зрачење реагује са МБ као ултразвучним контрастним агенсом када течност већ садржи стабилне МБ. Ова студија је истраживала ефикасност ласерски посредоване кавитације МБ обложених албумином у побољшању трансдермалне испоруке лекова. Прво су процењени различити типови и услови ласерски посредоване инерцијалне кавитације МБ. ЦО2 фракциони импулсни ласер је одабран за комбиновање са МБ у ин витро и ин виво експериментима. Ин витро пенетрација -арбутина у кожу после 2 х била је 2 пута већа у групи која је комбиновала ласер са МБ него у контролној групи. У експериментима на малим животињама, ефекат избељивања на кожи Ц57БЛ/6Ј мишева у групи која комбинује ласер са МБ на кожи плус пенетрирајући -арбутин се повећао (значајно) за 48.{13}} процената 11. и 5. дана 0.0 процената 14. дана, а затим је имао тенденцију да се стабилизује током остатка 20-дневног експерименталног периода. Садашњи резултати указују на то да комбиновање ЦО2 ласера ​​са МБ обложеним албумином може повећати пропустљивост коже како би се побољшала испорука -арбутина како би се инхибирала меланогенеза код мишева без оштећења коже.

Према релевантним студијама,цистанцхеје уобичајена биљка позната као "чудотворна биљка која продужава живот". Његова главна компонента јецистанозид, који има различите ефекте као нпрантиоксиданс, антиинфламаторно, ипромоција имунолошке функције. Механизам између цистанче иизбељивање кожележи у антиоксидативном дејствуцистанцхе глицосидес. Меланин у људској кожи настаје оксидацијом тирозина коју катализујетирозиназе. Реакција оксидације захтева учешће кисеоника, тако да радикали без кисеоника у телу постају важан фактор који утиче на производњу меланина. Цистанцхе садржи цистанозид, који је антиоксидант и може смањити стварање слободних радикала у телу, такоинхибирање производње меланина.

Кликните на Цистанцхес Херба Фор Вхитенинг

за више информација:

david.deng@wecistanche.com ВхатАпп:86 13632399501

1. Представљање

Кавитација се односи на стварање шупљина у течности и обично се јавља када је течност подвргнута брзим променама притиска. Такве промене притиска могу се индуковати коришћењем много различитих метода, при чему се акустична кавитација покреће када амплитуда примењеног акустичног притиска пређе одређени праг [1]. Акустична кавитација укључује формирање, раст, пулсирање и колапс микромехурића (МБ) у течностима током ултразвучне обраде ултразвучним таласима високог интензитета (УС). Верује се да су ове појаве одговорне за мешање, фрагментацију, ерозију, влажење, сонокапиларне и друге ефекте који имају различите практичне индустријске примене [1].

Кавитација МБ контрастних агенаса изазвана САД такође игра важну улогу како у дијагностичкој тако и у терапијској медицинској примени. Контрастни агенси за САД су стабилизовани и обложени МБ који се убризгавају интраваскуларно да би се побољшала резолуција дијагностичког УЗ имиџинга [2]. Постоје докази из бројних студија да присуство МБ контрастних агенаса у крви може смањити праг за различите биолошке ефекте изазване УЗ, како ин витро тако и ин виво, као што су хемолиза, руптура капилара и сонопорација [3]. Неке студије су показале да присуство МБ контрастних агенаса у крви значајно смањује праг за превремене срчане контракције изазване УЗ [4,5]. Резонанција МБ (стабилна кавитација) резултира нелинеарним хармонијским емисијама које се могу користити у МБ-специфичним контрастним сликама. Инерцијална кавитација и деструкција МБ може изазвати јака механичка напрезања која повећавају пропустљивост ћелијских мембрана и крвно-мождану баријеру за побољшање испоруке терапеутских агенаса. У нашим претходним студијама, применили смо инерцијску кавитацију МБ изазвану од стране САД да бисмо побољшали трансдермалну испоруку лекова (ТДД), пошто је утврђено да инерцијална кавитација доводи до далеко већег повећања пермеабилности стратум цорнеума у ​​поређењу са стабилном кавитацијом [6–8] .

Ласерско зрачење је алтернативни приступ за побољшање пермеације лека и тиме олакшавање уношења лека у или преко коже. Када је ласерски импулс са интензитетом изнад одређеног прага фокусиран на течност, експлозивно испаравање течности такође може да изазове МБ кавитацију [9,10]. Агресивна природа кавитације изазване ласером довела је до тога да се она користи у широком спектру примена укључујући лизу ћелија, порацију ћелијске мембране и хирургију ока [11]. Стратегије за безбедно побољшање изгледа постоперативних, атрофичних ожиљака и ожиљака од акни недавно су демонстриране коришћењем фракционих аблативних и неаблативних ласера ​​[12]. Аблативно ласерско обнављање коже пружа највећа клиничка побољшања, али постоперативни опоравак траје неколико недеља [13]. Неаблативни ласерски поступци могу бити погоднији за пацијенте који не могу или не желе да толеришу продужено постоперативно зарастање. Међутим, претходна инфекција херпес симплексом може се реактивирати након неаблативног ласерског ремоделирања коже због интензивне топлоте коју производи ласер или други извор светлости [13].

Развијене су неке методе за смањење топлоте произведене ласерским зрачењем, као што је употреба насадника за хлађење контакта или динамичких криогених уређаја који могу да испоруче млазове расхладног спреја променљивог трајања [14]. Међутим, још увек не постоји консензус о томе који начин хлађења је најефикаснији током лечења. Штавише, за разлику од САД, механизам који лежи у основи ефеката ласерски изазване кавитације са стабилизованим обложеним МБ у течностима остаје нејасан.

2. Материјал и методе

2.1. Производња МБ обложених албумином

МБ са албуминском љуском припремљени су према процедури коришћеној у нашим претходним студијама [7,15]. Укратко, МБ обложени албумином су генерисани ултразвуком у 10 мЛ раствора који садржи 140 мг албумина (Оцтапхарма, Беч, Аустрија) и гас перфлуороугљеника у физиолошком раствору (пХ 7,4, { {21}}.9 процената натријум хлорида) користећи соникатор (Брансон Ултрасоницс, Данбури, ЦТ, САД) у трајању од 2 мин. Број МБ албумина испуњених перфлфлуороугљеником у раствору мерен је помоћу уређаја МултиСизер ИИИ (Бецкман Цоултер, Фуллертон, Калифорнија, САД) са сондом са 30- µм отвором и границама мерења од 0,6–20 µм. Расподела величине у суспензији је мерена на основу динамичког расејања светлости (Зетасизер Нано, ЗС90, Малверн, УК), што је открило да МБ обложени албумином имају пречник од 1,02 ± 0,11 µм (средња вредност ± СД) и концентрацију од 1,40 × 108 МБс/мЛ.

2.2. Ласерски индуковани МБ поремећај 

Претходне студије су сугерисале да је поремећај МБ посредован САД (тј. инерцијална кавитација) неопходан за ефикасан ТДД [8,16,17]. Ова студија је мерила ефикасност поремећаја МБ при коришћењу различитих типова ласера ​​у различитим условима. Концентрација МБс је подешена на 2,8 × 107 МБс/мЛ (петоструко разблаживање) и 1,4 × 107 МБс/мЛ (десетоструко разблаживање) у Еппендорф епрувети, а зрачење је обезбеђено помоћу четири типа ласера: Ваздушно хлађени аргон-јонски ласер (515 нм, континуирани талас), ласер са суперконтинуумом (1064 нм, пулсни талас), Нд: ИАГ ласер (532 нм, пулсни талас) и ЦО2 фракциони ласер (10 600 нм, пулсни талас). Детаљни услови за различите типове ласера ​​су наведени у табели 1.

Пример оптичког подешавања је приказан на слици 1. Промена температуре током ласерског зрачења мерена је помоћу термометра (Оптрис ЛС, Оптрис, Берлин, Немачка). Затим, након излагања ласеру, 100 µЛ раствора МБ је додато на микроскопско стакло за посматрање. Број МБ-ова на сликама светлосне микроскопије пре и после ласерског зрачења претворен је у 8-битне слике сивих тонова коришћењем МАТЛАБ-а (Тхе МатхВоркс, Натицк, МА, САД) да би се олакшало запажање поремећаја МБ. Стопа уништења МБ-а је квантификована према оштећеним подручјима коришћењем следеће једначине:

2.3. Дубина продирања у свињску кожу

2.4. Ин витро пенетрација у кожу раствором -арбутина

Узорак свињске коже дебљине {{0}} мм је сабран помоћу Хумби ножа, пажљиво очишћен ПБС-ом и исечен на квадратне комаде (2 цм × 2 цм). Кружне области на узорцима коже пречника 1,5 цм и висине 5 мм опкољене су гелом да би се спречило цурење када је узорак напуњен са 5{{30}}0 µЛ МБ. Након седам пута озрачивања узорка (услови су наведени у табели 1) ЦО2 фракционим ласером, пенетрација у кожу је тестирана помоћу статичких Франз дифузионих ћелија на површини од 2,14 цм2 према експерименталном дизајну који смо претходно описали [7]. Температура дифузионог склопа је одржавана на 37 ◦Ц. -арбутин (30 мг/мЛ, 500 µЛ, 4-хидроксифенил- -Д-глукопиранозид, молекулска маса=272.25 Да; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) је нанети на епидермалну страну коже и зачепити парафилмом (Пецхинеи Лаборатори Сафети Продуцтс анд Аппарел, Цхицаго, ИЛ, УСА). Одељак за дифузију рецептора окренут ка дермалној страни је напуњен са 12 мЛ ПБС (пХ 7,4), који је мешан магнетном шипком која се ротирала при 600 рпм. Тест раствори који нису садржали МБ су филтрирани кроз филтер микропора од 0.2-µм (Налгене, Роцхестер, НИ, УСА) или филтер са микропорама од 0.22- µм (Миллек, Дармстадт, Немачка). Аликвоти (200 µЛ) раствора рецептора су узети у 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 и 24 х и замењени истом запремином свежег раствора рецептора.

2.5. ХПЛЦ анализа -арбутина

Инспире™ Ц18 колона (250 мм × 4,6 мм, величина честица 5 µм; Дикма Тецхнологиес, ​​Лаке Форест, Калифорнија, САД) је коришћена за мерење концентрација -арбутина. ХПЛЦ систем је опремљен бинарном пумпом (ПУ-2089, Јасцо, Токио, Јапан), а таласна дужина ултраљубичастог (УВ) детектора (УВ-2075, Јасцо) је подешена на 280 нм. Мобилна фаза се састојала од метанола: дестиловане воде (пХ 5,5, 70:30 в/в) [18] са споредном брзином од 0,6 мЛ/мин. Сви узорци за анализу су убризгани у запремини од 20 µЛ. Време задржавања -арбутина је било око 4,3 мин.

2.6. Анимал Треатментс

Садржај меланина у органоидима је испитиван на моделу миша Ц57БЛ/6Ј [19]. Петонедељни мишеви тежине 20–25 г добијени су од Био Ласцо (Тајпеј, Тајван). Експериментални протокол је одобрио Комитет за институционалну негу и употребу животиња Медицинског центра националне одбране, Тајпеј, Тајван. Процедуре за негу животиња биле су у складу са институционалним смерницама и прописима (одобрење бр. ИАЦУЦ-17-092). Током експеримената, животиње су биле смештене у кавезима од нерђајућег челика у климатизованој просторији са температуром одржаваном на 25–28 ◦Ц и са наизменичним циклусима светлости и таме од по 12 х.

Животиње су аклиматизоване 7 дана пре експеримента. Након што им је длака уклоњена са површине од 2 цм × 2 цм, боја коже је мерена помоћу хромометра (ЦР-400, Коница Минолта Сенсинг, Токио, Јапан). Животиње су затим изложене ултраљубичастом Б (УВБ) зрачењу (Г8Т5Е, Санкио, Токио, Јапан) да би изазвале хиперпигментацију (укупна доза енергије по експозицији=1 Ј/цм2, таласна дужина=306 нм, три пута по недељу током 2 недеље), а затим је поново мерена боја коже.

Животиње су подељене у следећих пет група (н {{0}} по групи, третман се примењује једном свака 3 дана током 20 дана): (1) без третмана (група Ц); (2) примена самог пенетрантног -арбутина (300 µг/мЛ, 0,2 мЛ/цм2) (група А); (3) ласерско зрачење коже директно уз примену пенетрационог -арбутина (300 µг/мЛ, 0,2 мЛ/цм2) (група Л плус А); (4) ласерско зрачење коже прекривене физиолошким раствором и применом пенетрационог -арбутина (300 µг/мЛ, 0,2 мЛ/цм2) (група Л плус С плус А); и (5) ласерско зрачење коже у комбинацији са МБ на кожи и уз примену пенетрантног -арбутина (300 µг/мЛ, 0,2 мЛ/цм2) (група Л плус МБ плус А). Промена боје коже изазвана сваким од третмана је процењена у унапред одређеним временима коришћењем хромометра. Индекс осветљености, Л [20], израчунат је сваког дана мерења пре и после третмана.

2.7. Хистолошка студија

Узорци ткива коже (приближно 8 мм × 8 мм) узети су из области третмана одмах након експеримената и чувани у 10-постотном раствору формалина. Примењено је бојење хематоксилином и еозином (ХЕ; Сигма-Алдрицх), а узорке је анализирао стручни дерматопатолог (ХВГ). Неки други узорци су обојени Фонтана-Массон сребрним нитратом (Којима Цхемицал, Касхивабара, Јапан) 30 минута на 60 ◦Ц, а затим испрани дестилованом водом и фиксирани у 5% раствору натријум тиосулфата (Дуксан, Сеул, Кореја) током 2 мин, пре поновног прања дестилованом водом. Узорци су затим обојени нуклеарним брзим црвеним раствором (Флука, Буцхс, Швајцарска) током 5 минута и два пута испрани дестилованом водом. Коначно, узорци су дехидрирани у 95 процената, затим са 100 процената етанола, а затим два пута испрани ксиленом (Дуксан) [21].

2.8. Статистичка анализа

Добијени подаци су статистички анализирани помоћу Студентовог т-теста. Вредност вероватноће п < 0.05 се сматрала индикативном за значајну разлику.

3. Резултати

3.1. Ласерски индуковани МБ поремећај

Микроскопске слике петоструко разблажених МБ без и са зрачењем 10,8 мВ континуираним (ваздушно хлађеним аргон-јонским) ласером и 10,8 мВ импулсним ласером (суперконтинуумско влакно) за 60, 120 и 180 с приказане су на слици 2. стопе разарања за пулсни ласер су порасле за 17,66 процената, 20,52 процената и 39,05 процената у поређењу са континуираним ласером на 60, 120 и 180 с, респективно. Слика 3 приказује ефикасност уништавања петоструко и десетоструко разблажених МБ када се користи Нд:ИАГ пулсни ласер на 60, 120 и 180 с. Стопе уништења петоструко и десетоструко разблажених МБ су биле 72,46 процената и 78,59 процената, респективно, за 60 с, 88,06 процената, 96,10 процената за 120 с, 85,22 процената и 98,80 процената за 180 с. Слика 4 показује ефикасност уништавања десетоструко разблажених МБ за зрачење један, три и седам пута клиничким ЦО2 фракционим пулсним ласером. Стопа разарања се повећавала са временом зрачења и била је близу 100 процената за седам пута зрачење, па је овај услов коришћен у наредним ин витро и ин виво експериментима.

за више информација: david.deng@wecistanche.com ВхатАпп:86 13632399501