Поређење два дијагностичка теста за детекцију серум неутрализирајућег антитела на вирус свињске епидемије дијареје

Апстрактан:

Лактогени имунитет је важан за заштиту прасади од многих патогена, укључујући вирус епидемије дијареје свиња. Циркулишући нивои неутрализујућих антитела у серуму крмача могу помоћи да се утврди да ли детектан имуни одговор може пружити заштиту прасадима. Неутрализирајућа антитела могу се открити различитим дијагностичким тестовима. Ова студија је проценила дијагностичке карактеристике два теста неутрализујућих антитела на антитела која неутралишу вирус свињске епидемије дијареје у серуму изазваних назимица. Четири групе за третман, контролне, невакцинисане, вакцинисане пре изазивања и вакцинисане после изазивања, састојале су се од 20 назимица. Узорци серума су сакупљени од сваке назиме пре и после изазивања вируса епидемије дијареје свиња. Узорци су процењени на присуство неутрализујућих антитела путем теста неутрализације флуоресцентног фокуса и теста неутрализације високог протока. Дијагностичка осетљивост и специфичност за неутрализацију флуоресцентног фокуса и тестове неутрализације високог протока за ову студију оптимизовани су на граничној вредности разблажења од 80 и 80% флуоресцентне редукције респективно и показали су умерено слагање засновано на капа статистици. Фокусна флуоресцентна неутрализација и тестови неутрализације високе пропусности могу се користити за праћење статуса неутрализујућих антитела унутар животиња или популације животиња. Тест високе пропусности има предности у односу на фокус флуоресцентни тест у томе што има већу специфичност на назначеној граничној вредности и природа резултата омогућава већу дискриминацију између појединачних резултата.

бенефиције додатка цистанцхе-повећавају имунитет

Кључне речи: ПЕДВ; неутрализирајуће антитело; дијагностички тест

1. Представљање

Вирус епидемије дијареје свиња (ПЕДВ) је алфакорона вирус који је постао ендемски у Америци након појаве у Сједињеним Државама 2013. [1–3]. Мере биосигурности су усмерене на задржавање патогена као што је ПЕДВ из крда свиња како би се ублажио утицај болести [4]. Серолошко тестирање је користан алат за утврђивање да ли су свиње претходно биле изложене и заражене патогеном. Изложеност се може десити природно (нпр. гутање материјала оптерећеног вирусом) или намерно (нпр. мешање са животињама које се сејају, орално-назална инокулација или испирање желуца). За потребе ове студије, изложеност је постигнута намерним изазивањем ПЕДВ-позитивног хомогената ткива из потврђеног, клиничког избијања ПЕДВ. Сонг и др. [5] су показали да се титри неутрализујућих антитела у серуму не разликују између крмача којима је примењена орална или интрамускуларна ПЕДВ ДР13 вакцина са ослабљеним Веро ћелијама. Ова студија је такође показала да су крмаче орално вакцинисане имале нижу смртност прасади у поређењу са интрамускуларном вакцинацијом. Поред тога, де Арриба ет ал. [6] су показали корелацију између ћелија које луче ИгА и ИгГ антитела (АСЦ) у крви и лимфоидном ткиву повезаном са цревима. Дифузна, епителиохоријска плацента крмача спречава преношење имуних ћелија и антитела на прасад ин утеро чинећи свиње агамаглобулинемичним при рођењу [7]. Имунитет мајке се преноси са крмача на прасад преко секрета дојке и игра кључну улогу у заштити од ентеричних патогена као што су ПЕДВ, ТГЕВ и ротавирус. Због тога се прасад за заштиту од ових патогена ослања на колострум и антитела на млеко. Серумски имуноглобулини су велики допринос колоструму, док се имуноглобулини у млеку производе у млечној жлезди [8]. Према томе, тестови неутрализујућих антитела могу помоћи да се утврди да ли детектан имуни одговор у серуму крмача пре порођаја може обезбедити заштиту прасадима. Механизми неутрализације антитела укључују агрегацију, инхибицију уласка вируса у циљну ћелију и инхибицију репликације вируса унутар циљне ћелије [9]. Развијени су дијагностички тестови за откривање неутрализујућих антитела за ПЕДВ укључујући неутрализацију вируса (ВН), неутрализацију флуоресцентног фокуса (ФФН) и тест неутрализације високе пропусности (ХТНТ) [2,10–13]. Како су описали Сарменто ет ал. [2], ФФН тест је побољшање у односу на ВН тест јер је тест осетљивији јер се тест заснива на детекцији вирусних антигена експримираних на површини инфицираних Веро ћелија, док се ВН тест заснива на цитопатском ефекту изазваном вирусом. Поред тога, резултати ФФН-а се могу добити брже од резултата ВН-а јер је потребно дуже да се посматра цитопатски ефекат у поређењу са везивањем вируса са ФФН-ом. ХТНТ тест је даље побољшање у односу на ФФН тест пошто се ХТНТ тест ослања на дигиталну цитометрију слике, а не на тумачење техничара да би се добили резултати. На тај начин, омогућавајући очитавање целе плоче за мање од 3 минута, производећи квантитативно мерење флуоресцентног интензитета и могућност чувања слика за преглед. Стога се чинило да је ХТНТ погодан за употребу у комерцијалним крдима свиња. Ова студија упоредила је дијагностичке карактеристике (осетљивост и специфичност) и позитивне и негативне предиктивне вредности, два теста неутрализујућих антитела за ПЕДВ, ФФН и ХТНТ тестове. Ово се надовезује на рад Сармента ет ал. [2] тестирањем наивних, инфицираних и вакцинисаних животиња како би се помогло у валидацији теста за употребу у дијагностичкој лабораторији високог протока. На основу резултата Сарменто ет ал. [2], наша нулта хипотеза је да нема разлике у дијагностичким карактеристикама два теста за откривање неутрализујућих ПЕДВ антитела у серуму назимица изазваних ПЕДВ.

бенефиције додатка цистанцхе-повећавају имунитет

2. Материјал и методе

2.1. Извори и селекција свиња

Као што су раније описали Бровн ет ал. [14], ова студија је користила 4 групе третмана које се називају Контролна, НВ (невакцинисана), Пре (вакцинисана пре изазивања) и Пост (вакцинисана након изазивања). Свака група је у почетку била састављена од 20 комерцијалних, укрштених, назимица. Укупно 60 назимица је прикладно одабрано са комерцијалне фарме свиња у централној Ајови која није имала историју ПЕДВ. 20 назимица из контролне групе поново је коришћено за НВ групу. НВ група се састојала од само 18 свиња пошто су две назимице уклоњене из студије због компликација које нису повезане са ПЕДВ изазовом.

Као додатни доказ о ПЕДВ негативном статусу, 12 мЛ крви је сакупљено путем југуларне вене пункције помоћу 16-мерача, игле од 15- инча и шприца од 12 мЛ. Серум је сакупљен из узорака крви центрифугирањем на 1.500 × г током 8 минута (мин), подељен у аликвоте од 1 мЛ и чуван на -80 ◦Ц. Узорци серума су тестирани помоћу вв-ЕЛИСА у лабораторији за ветеринарску дијагностику Државног универзитета у Ајови (ИСУ-ВДЛ, Амес, ИА, САД) [15].

2.2. Додељивање животиња групама за третман

Шездесет назимица је равномерно подељено у 3 групе, од којих се свака састојала од 20 комерцијалних, укрштених женки. Да би се формирале четири групе за третман, 20 назимица је коришћено узастопно за две групе третмана, ЦОНТРОЛ и НВ. Поновна употреба 20 назимица омогућила је развој и контролу групе ПЕДВ-позитивних назимица које су биле изложене ПЕДВ-у и смањила укупан број животиња коришћених у студији. Преосталих 40 назимица чиниле су ПРЕ и ПОСТ групе, са по 20 назимица у свакој групи. Временски оквир догађаја по групама третмана описан је у Бровн ет ал. [14]. Укратко, појединачни узорци крви су сакупљани једном недељно у свакој групи третмана након изазова. Даља разрада је разматрана у одељцима 2.4 и 2.5. Назимице третиране групе "ПРЕ" су вакцинисане пре доласка у објекат ван локације. Назимице третиране групе "ПОСТ" нису вакцинисане тек након изазивања.

2.3. Смештај и брига о свињама

По доласку у истраживачку установу, назимице су биле смештене у групи за третман: свих 20 назимица у групи за третман било је у једном обору са храном и водом ад либитум. Све оловке су биле у истој просторији. Једна оловка је остављена празна између НВ ПРЕ ​​и ПОСТ група да би се контаминација свела на минимум. Храна, вода, високе и ниске температуре у просторији, као и високе и ниске влажности су праћене како би се осигурала конзистентност са стандардима производње. Здравствена запажања су спроведена и забележена једном дневно да би се проценила покретљивост, летаргија, конзистенција фекалија и други клинички знаци болести. Ушна маркица (Интегра Хог, Аллфлек, Даллас, ТКС, УСА) стављена је у десно ухо сваке назимице за индивидуалну идентификацију животиње.

2.4. Орал Цхалленге

Након 4-дневног периода аклиматизације, свака назимица у ЦОНТРОЛ-у је орално била изложена ПЕДВ-у коришћењем хомогената ткива сакупљеног из потврђене клиничке епидемије ПЕДВ-а на комерцијалној фарми. Хомогенат је секвенциониран од стране Лабораторије за ветеринарску дијагностику Државног универзитета у Ајови и утврђено је да је то амерички прототип соја, геногрупе Г2б. Десет милилитара хомогената је помешано са 590 мЛ физиолошког раствора пуферованог фосфатом и 30 мЛ мешавине је иронично дато свакој назимици. Инокулум је потврђен ПЕДВ позитиван ланчаном реакцијом полимеразе реверзне транскриптазе у реалном времену са ЦТ вредношћу од 19,6 и 14,23 × 107 геномских копија по мЛ и развојем дијареје код назимица након изазивања. Појединачни узорци крви су сакупљени сваких 7 дана након изазивања путем југуларне венепунктуре као што је горе описано до 42. дана након изазивања. Серум је сакупљен и ускладиштен као што је горе описано, а узорци су достављени ИСУ ВДЛ за детекцију неутрализујућих антитела помоћу теста фокусне флуоресцентне неутрализације и теста неутрализације вируса високог протока. Дана 60. након почетног изазова ЦОНТРОЛ-а, преосталих 40 назимица је доведено у истраживачку установу, а 18 ЦОНТРОЛ назимица је постало НВ. Две назимице су уклоњене из КОНТРОЛЕ због услова који нису повезани са студијом. Након 3-дневног периода аклиматизације након доласка, 18 назимица је поново изазвано (НВ) и 40 назимица (ПРЕ и ПОСТ) је изазвано, узорци крви су сакупљени, сакупљени серум и узорци достављени на тестирање како је овде описано .

2.5. Вакцинација назимица

Четрдесет назимица је остало на фарми порекла и доведене су у истраживачки објекат 8,5 недеља након доласка ЦОНТРОЛ-а. Двадесет назимица је вакцинисано 5 и 2 недеље пре изазова, како је препоручила компанија која производи вакцину, комерцијално доступном, убијеном ПЕДВ вакцином, геногрупа Г2б, (Вакцина против епидемије дијареје код свиња, Зоетис, Инц., Флорхам Парк, Њ , САД) који чине ПРЕ групу. Преосталих двадесет је вакцинисано истом вакцином, 1 и 3 недеље након ПЕДВ изазова који је чинио ПОСТ групу. Осамнаест од првобитних двадесет ЦОНТРОЛ назимица остало је у студији и чинило је НВ групу и није примило вакцину против ПЕДВ

цистанцхе биљке које повећавају имуни систем

2.6. Тестови неутрализације антитела

2.6.1. Процедура неутрализације флуоресцентног фокуса (ФФН).

ФФН је изведена у лабораторији за ветеринарску дијагностику Универзитета Ајова, стандардна оперативна процедура 9.5324 [16]. Укратко, Веро 76 ћелије су припремљене испирањем и инкубацијом са трипсин-етилендиаминтетрасирћетном киселином (ЕДТА) током 5 минута на 37 ◦Ц. Направљено је 1:20 разблаживање ћелија и медијума за размножавање ћелија и додато је 200 µЛ у сваки бунар 96- плоче и инкубирано 48 х. Плоче су бачене и испране медијумом за инокулацију вируса. Узорци серума су топлотно инактивирани у воденом купатилу на 56 ◦Ц током 30 минута, а затим разблажени у 2- пута серијском разблажењу почевши од 1:10 у плочи. Основни вирус је разблажен до 100-200 јединица које формирају жаришта по 100 µЛ и 100 µЛ је додато у сваки бунар и инкубиран 60 минута на 37 ◦Ц са 5% угљен-диоксида (ЦО2). Тест плоча је бачена, испрана и 150 µЛ мешавине серума/вируса је додато у одговарајуће бунарчиће и инкубирано 60 мин на 37 °Ц. Смеше серума/вируса су избачене, а бунари су испрани медијумом за инокулацију вируса. 150 µЛ медијума за инокулацију вируса је додато у сваки бунар и инкубирано 24 х на 37 ◦Ц и 5% ЦО2. Медијум је уклоњен са плоче и ћелије су фиксиране додавањем 80% ацетона, који је охлађен у леденом купатилу, 15 мин. Ацетон је одбачен и плоча је осушена на ваздуху. Припремљено је 1:100 разблажење ФИТЦ коњугованог ПЕДВ НП моноклонског антитела разблаженог у ПБС (пХ 7,2) и додато је 50 µЛ у све базенчиће и инкубирано на 37 °Ц током 60 мин. Плоча је испрана са ПБС, а затим очитана помоћу флуоресцентног микроскопа (Олимпус БКС51, 10Кс објектив, ФИТЦ филтер). Позитивни бунари не показују флуоресцентне плакове, а негативни показују зелене плакове. Титри неутрализујућих антитела су изражени као највеће разблажење серума са 90% смањењем репликације вируса у поређењу са контролом вируса. Узорци са титром већим или једнаким 20 класификовани су као позитивни на ПЕДВ-неутралишућа антитела. Већи титар указује на већу концентрацију неутрализујућих антитела у узорку. Примери позитивних и негативних узорака серума доступни су у додатним материјалима.

2.6.2. Процедура теста флуоресцентне неутрализације високе пропусности (ХТНТ).

ХТНТ је извршила Ветеринарска дијагностичка лабораторија Државног универзитета у Ајови, стандардна оперативна процедура 9.5324, верзија 2 [17]. Узорци серума су топлотно инактивирани у воденом купатилу на 56 ◦Ц током 30 мин. Залиха вируса је серијски разблажена 10- пута у медијуму за инокулацију вируса (ДМЕМ са 2 µг/мЛ Трипсин-ТПЦК), пренета у Веро 81 ћелије (АТТЦ® ЦЦЛ-81™) и инкубирана на 37 ◦Ц са 5% ЦО2 током 5 дана. Последње разблаживање у коме је примећен цитопатски ефекат коришћен је за одређивање средње инфективне дозе културе ткива (ТЦИД50) применом Спеарман и Карбер методе [18]. Сто микролитара ћелијског раствора (медиј за размножавање ћелија, трипсин-ЕДТА и Веро 81 ћелије) је разблажено са 100 µЛ медијума за размножавање ћелија (ДМЕМ са 10% ФБС и 1% пеницилин-стрептомицина) да би се направило разблаживање 1:1 . Хемоцитометар је коришћен за бројање и израчунавање разблажења да би се добило 5 × 104 ћелија/бунарићу и додат је у сваки бунар црне 96- плоче са провидним дном (ЦеллБинд микроплоча са 96 бунара, Сигма) и инкубиран 48 х на 37 ◦Ц са 5% ЦО2 да би се ћелије спојиле (100% конфлуентне). Свака плоча је имала позитивну контролу, негативну контролу и јажице за контролу вируса. Затим је пет микролитара топлотно инактивираних контрола и узорака стављено у дупле јажице да би се направило разблаживање 1:40 прво 1:20 додавањем 95 µЛ медијума за инокулацију вируса, затим 100 µЛ 1:10 разблаженог ПЕДВ вируса (3,16 × 105 ТЦИД50/мЛ). Смеша серум/вирус је инкубирана 1 х на 37 ◦Ц са 5% ЦО2. Сви ћелијски бунари тест плоче су испрани 3 пута са 150 µЛ медијума за прање ћелија (ДМЕМ са 1% пеницилин-стрептомицина), а 150 µЛ мешавине серума/вируса и контрола вируса је пребачено на тест плочу и инкубирано 90 мин. на 37 ◦Ц. Смеша серум/вирус је одбачена и плоче су једном испране медијумом за испирање ћелија, као што је горе описано, а затим једном медијумом за инокулацију вируса. Медијум за инокулацију вируса (150 µЛ) је додат у сваки бунар и инкубиран 24 х на 37 ◦Ц са 5% ЦО2. Медијум за инокулацију вируса је одбачен и плоча је испрана са ПБС пХ 7,4. Ћелије су фиксиране додавањем 4 °Ц, 80% ацетона у сваки бунар и инкубиране на собној температури 15 мин. Затим је уклоњен ацетон и плоча је сушена на ваздуху 30 мин. Сваки бунар је испран са ПБС пХ 7,4. 50 µЛ ФИТЦ-коњугованог ПЕДВ НП моноклонског антитела (СД6-29 клон, Медгене Лабс) разблаженог 1:100 у ПБС пХ 7,4 је додато у сваки бунар и инкубирано 60 минута на 37 °Ц. Плоча је испрана четири пута са ПБС пХ 7,4, остављајући последње прање у плочи 5 минута, а затим је одбачена и замењена са 100 µЛ ПБС пХ 7,4. Плоче су затим очитане са СпецтраМак и3× коришћењем СофтМак Про 6.5 (Молецулар Девицес, Сан Јосе, ЦА, УСА) коришћењем времена експозиције од 30 мс и подешавања фокуса од 20 ум за 541 таласну дужину. Узорци са тоталном редукцијом флуоресценције (%ФР) већим или једнаким 85% класификовани су као позитивни на неутрализујућа антитела [2]. Укупна редукција флуоресценције је израчуната као 100 − ([Просечан интензитет укупног флуоресценције узорка/просечан интензитет укупне флуоресценције негативне контроле]) × 100). Веће смањење укупне флуоресценције указује на веће концентрације неутрализујућих антитела у узорцима. Примери позитивних и негативних узорака серума доступни су у додатним материјалима.

2.7. Дијагностичке карактеристике: осетљивост и специфичност и позитивне и негативне предиктивне вредности

Дијагностичка осетљивост и специфичност израчунате су за ХТНТ коришћењем граничне вредности %ФР од 70, 75, 80, 85 и 90 и ФФН коришћењем граничних вредности разблажења узорка од 20, 40, 80 и 160 да би се одредила оптимизована граница. Оптимизовано је дефинисано као граница где је дијагностичка специфичност максимизирана уз минималан губитак дијагностичке специфичности. Подскуп од седамдесет шест познатих ПЕДВ-негативних узорака је одабран из прве две тачке узорковања за ЦОНТРОЛ и ПОСТ групе. 36 познатих ПЕДВ-позитивних узорака је одабрано из последње две тачке узорковања за НВ групу. Граница већа од 85 коришћена је за дефинисање позитивних узорака, у складу са ИСУ ВДЛ стандардном оперативном процедуром за тест [17]. Дијагностичка осетљивост је процењена дељењем броја познатих позитивних узорака који су били позитивни са укупним познатим позитивним узорцима. Дијагностичка специфичност је процењена дељењем броја познатих негативних узорака који су били негативни са бројем познатих негативних узорака. За поређење теста одабрана је граница која је оптимизовала дијагностичку специфичност и осетљивост. За потребе овог истраживања максимизиране су дијагностичка специфичност (ДСп) и осетљивост (ДСе), при чему је апсолутна вредност разлике између вредности осетљивости и специфичности најмања. Позитивна предиктивна вредност (ППВ) је процењена дељењем броја познатих позитивних узорака који су били позитивни (ТП) са укупним тест позитивним узорцима (ТП плус лажно позитивним [ФП]). Негативна предиктивна вредност (НПВ) је процењена дељењем броја познатих негативних узорака (ТН) који су били негативни са укупним негативним узорцима на тесту (ТН плус лажно негативним [ФН]).

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

2.8. Статистичка анализа

У овој студији није било неодређених резултата или података који недостају. Сви подаци су анализирани коришћењем САС верзије 9.4 (САС Инстит. Цари НЦ). Коришћено је 609 запажања од 6{{10}} свиња које припадају једној од 4 групе. Две могуће граничне вредности (40 и 80) за ФФН тест су размотрене и упоређене са граничном вредност од 85 за ХТНТ. За сваки, линеарни модел мешовитих ефеката је био погодан да објасни ефекат групе на слагање ФФН и ХТНТ тестова, са случајним ефектом специфичним за свиње. Урађене су све анализе парног поређења група. Даље, за две од три граничне вредности које су коришћене за ФФН тест, израчунат је Коенов Капа коефицијент да би се одредила укупна сагласност ФФН и ХТНТ тестова. Капа коефицијенти су тумачени на следећи начин: мањи од 0.0, „лош” договор; између 0.0 и 0.20, „благи“ договор; између 0.21 и {{30}}.40, "фер" споразум; између 0,41 и 0,60, "умерено" слагање; између 0,61 и 0,80, "суштински" договор; и између 0,81 и 1,0, "скоро савршено" слагање [19]. Значајност је постављена на п мање или једнако 0,05. Кутија и бркови су развијени коришћењем Р софтвера.

3. Резултати

Табела 1 приказује дијагностичку осетљивост и специфичност за ФФН и ХТНТ тестове на одабраним граничним вредностима. Дијагностичка осетљивост и специфичност за два теста за ову студију су оптимизоване на граничној вредности разблажења од 80 и 80% ФР респективно.

Табела 1. Дијагностичка осетљивост (ДСе), дијагностичка специфичност (ДСп), позитивна предиктивна вредност (ППВ) и негативна предиктивна вредност (НПВ) за ХТНТ и ФФН тестове коришћењем различитих граничних вредности наведених у другом реду табеле. На пример, за ХТНТ тест на граничној вредности од 70, ДСе=0,97 (97%), ДСП=0,91 (91%), ППВ=0,83 ( 83%) и НПВ=0.95 (95%). У=недефинисано.

Слика 1 приказује дијаграме кутија и бркова резултата ХТНТ по данима након изазивања по групама за третман студије. Узорци из ЦОНТРОЛ и ПОСТ група (н=76) су класификовани као негативни у данима −4, 0 и 7 као што се очекивало због претходног статуса свиња. НВ група је развила анамнестички одговор након изазова. Дошло је до смањене варијабилности међу резултатима ХТНТ, што је приказано смањењем опсега вредности у обе вакцинисане групе (ПРЕ и ПОСТ) након изазова са ПЕДВ. Ова смањена варијација се може приметити на Слици 1 како су бркови и крајњи делови ПОСТ и ПРЕ дијаграма постали краћи 14 дана након изазова. Слика 2 приказује дијаграме кутија и бркова природног лог трансформисаног ФФН резултата по данима након изазивања по групама третмана, који имају сличне резултате као и ХТНТ тест. И ХТНТ (Слика 1) и ФФН (Слика 2) резултати показују одговор на изазов и вакцинацију као што се види са повећањем % ФР и титара из оба теста. Иако сличне по величини, варијација резултата сваког теста је смањена након хомологног изазова (НВ). Смањена варијација се такође десила након вакцинације (ПРЕ и ПОСТ). Ова варијација вредности неутрализујућих антитела до недеље након излагања опада после вакцинације и хомологног изазова са ПЕДВ (Слике 1 и 2). Постојала је слична тенденција у смањењу варијације неутрализујућих антитела уочена у резултатима оба теста вакцинисаних и хомологно изазваних група третмана. Хомологни изазов ПЕДВ и друге вакцинације произвео је анамнестички одговор који је генерисао виши ниво неутрализујућих антитела са смањеним варијацијама између свиња у поређењу са вредностима пре и после вакцинације које су мерене оба теста (Слика 1). На основу анализе дијагностичке осетљивости и специфичности, граничне вредности од 80 (титар) и 85 (%ФР) су одабране за анализу слагања тестова за ФФН и ХТНТ тестове респективно. Капа тест је показао "умерено" слагање од 0,5257 са интервалом поверења од 95% од 0,461, 0,5904 тестова за граничну вредност 80 (титар) и 85 (%ФР) за ФФН и ХТНТ тестови.

Слика 1. Графичке кутије и бркова криве одговора ХТНТ антитела према данима након изазивања за сваку третирану групу. Средња трака представља средњу вредност резултата по недељама. Шарке (горњи и доњи део кутије) представљају први (К1) и трећи (К3) квартил. Осенчени регион представља интерквартилни опсег (ИКР). Бркови се одређују на следећи начин: Горњи бркови=К3 + 1.5∗ИКР; Доњи бркови=К1 + 1.5∗ИКР. Ако ниједна тачка података није на израчунатој вредности, следећа тачка података најближа К1 или К3 је граница бркова. Отворени кругови (◦) означавају изузетке. Рез од 85 је означен испрекиданом линијом на 85 на и оси.

Слика 2. Графичке кутије и бркова криве одговора ФФН антитела према данима након изазивања за сваку третирану групу. Средња трака представља средњу вредност резултата по недељама. Шарке (горњи и доњи део кутије) представљају први (К1) и трећи (К3) квартил. Осенчени регион представља интерквартилни опсег (ИКР). Бркови се одређују на следећи начин: Горњи бркови=К3 + 1.5∗ИКР; Доњи бркови=К1 + 1.5∗ИКР. Ако ниједна тачка података није на израчунатој вредности, следећа тачка података најближа К1 или К3 је граница бркова. Отворени кругови (◦) означавају изузетке. Рез од 40 је означен испрекиданом линијом на лн(40) на и-оси.

4. Дискусија

Претпостављамо да су смањена варијација и анамнестички одговор повезани са хомогеним имунитетом стада и заштитом од болести, иако су клинички знаци још увек примећени у ПРЕ групи као што је претходно описано [14]. Клинички утицај и тежина болести код ових животиња нису процењени за потребе ове студије. Болест се различито манифестује код одраслих и новорођенчади са тежим клиничким знацима и смрћу код новорођенчади у односу на одрасле животиње [1,20]. Иако циркулишући нивои неутрализујућих антитела сами по себи не пружају заштиту [21], они се могу користити за процену одговора антитела након намерног излагања или примене вакцинације у крдима. Док је одсуство виремије карактеристично за ПЕДВ, виремија је пријављена код прасади старости до 4 недеље [22,23]. Дакле, циркулишућа неутрализујућа антитела могу утицати на клинички ток болести [21]. Међутим, лактогени имунитет, посебно ИгА у млечним секретима, био би прецизније мерење заштите за прасад [21]. Тестови описани у овој студији могли би да се користе за праћење серум неутрализујућих антитела након примене вакцинације у групама крмача или назимица поред сакупљања млечног секрета за тестирање лактогеног/секреторног ИгА. Било би корисно када би подаци добијени овим тестовима могли да предвиде количину и стабилност лактогеног имунитета који се ствара након вакцинације. Међутим, то није анализирано у овој студији. Показало се да одговори на серумска ИгГ антитела након вакцинације предвиђају колострални ИгГ одговор, али није постојала корелација између антитела која неутралишу серум и антитела млечних жлезда [15]. Иако није постојала корелација између серум неутрализирајућих антитела и антитела млечних жлезда, показало се да вакцинисане животиње имају већа неутрализујућа антитела у секрету дојке у поређењу са контролним животињама [15]. Стога, како то подржавају, Бјустром-Крафт, ет ал. [15], ако су антитела која неутралишу серум висока, онда ИгГ и ИгА у млечним секретима такође могу бити повећани. Дакле, сакупљање узорака серума пре премештања женки у прасилиште би минимизирало стрес и бол изазване током перипартурног сакупљања крви и млечних секрета који могу негативно утицати на крмачу и легло [24]. За кориснике је важно да разумеју како гранична вредност може утицати на дијагностичку осетљивост и специфичност теста. Повећање граничне вредности ће смањити број лажно позитивних резултата и повећати број лажно негативних резултата. Обрнуто, смањење граничне вредности ће повећати број лажно позитивних резултата и смањити број лажно негативних резултата. Ово знање омогућава кориснику да одабере коју граничну вредност да користи за своју специфичну ситуацију. За ову студију, на основу резултата ове студије и претходних резултата које су објавили Сарменто ет ал. [2], изабрали смо 80% ФР за ХТНТ и разблаживање од 80 ФФН. На овим граничним вредностима дијагностичка специфичност је већа за ХТНТ (97%) у поређењу са ФФН (76%) и пружа већу позитивну предиктивну вредност од ХТНТ у поређењу са ФФН. Такође се мора разумети да предиктивне вредности зависе од преваленције болести [25,26]. У овој студији, на основу класификованих узорака, преваленција је била 32,1% (36 позитивних и 76 негативних узорака). Како се преваленција повећава, ППВ би се такође повећао јер је већа вероватноћа да ће тестирана животиња (узорак) бити позитивна; како се преваленција смањује, НПВ би се смањивао. Слике 3А и Б илуструју ово за ХТНТ и ФФН тестове на различитим граничним вредностима процењеним у овој студији према методама које је описао Ерб [25]. Стога, када се разматрају дијагностички резултати, треба узети у обзир дијагностичку осетљивост и специфичност теста и разумети преваленцију унутар групе ако се користе предиктивне вредности.

Слика 3. (А). Позитивне предиктивне вредности за ХТНТ (црне линије) и ФФН (сиве линије) тестове на различитим границама. Граница од 90 није представљена за ХТНТ. (Б). Негативне предиктивне вредности или тестови ХТНТ (црне линије) и ФФН (сиве линије) на различитим границама. Граница од 20 није представљена за ФФН тест.

ХТНТ има супериорну дијагностичку осетљивост и специфичност у поређењу са ФФН. Када се анализирају резултати антитела, ово је идеално да се минимизира број лажно позитивних и лажно негативних резултата. На пример, када смо користили граничну вредност од 80 за ФФН, приметили смо осетљивост од 97% и специфичност од 76%. То значи да би било мало лажно негативних резултата, али би постојао велики број лажно позитивних. Ако су резултати лажно категорисани као позитивни, онда то може довести до погрешног тумачења да стадо има антитела на ПЕДВ, а у ствари их нема. Пошто ХТНТ има већу дијагностику и специфичности у различитим граничним вредностима, он је пожељнији тест за детекцију ПЕДВ антитела. Резултати Сарменто ет ал. [2] показао је много веће дијагностичке специфичности за ФФН и упоредиве осетљивости и специфичности за ХТНТ. Ови дијагностички тестови су показали умерено слагање према капа статистици (κ). Једна слабост κ је да се један тест мора сматрати златним стандардом. Када се упореде два несавршена теста, ово може искривити тумачење κ. За ову студију, проценили смо дијагностичке перформансе тестова у вези са κ да бисмо утврдили да се тест слаже, али да може имати другачију корисност. Додатна предност ХТНТ у односу на ФФН тест је да се резултати ХТНТ израчунавају из континуираних података у поређењу са категоричким вредностима (титрацијама) из ФФН. Континуирана природа ХТНТ података омогућава већу дискриминацију резултата узорка како би се описао статус неутрализујућих антитела крмача. Како су известили Сарменто ет ал. [2], ХТНТ има краће време читања плоче са 96 јажица на мање од 4 минута, што омогућава бржи преокрет у резултатима. Циркулишућа системска антитела могу допринети заштити прасади од ПЕДВ инфекција [21]. Међутим, не постоји литература о томе која би количина циркулишућих неутрализујућих антитела у крмачама обезбедила ПЕДВ заштиту прасадима. Високи нивои циркулишућих антитела доводе до виших концентрација у колоструму и пружају повећану заштиту. Даља процена је оправдана да би се утврдила повезаност између, када током гестације да се сакупе узорци, и заштите колостралних антитела против ПЕДВ инфекције. Лактогени и мукозни имунитет је од виталног значаја за преживљавање свиња изложених ПЕДВ. Антитела се скупљају у млеку преко црева-МГ-сИГА осе и преносе се до прасади како би им пружила заштиту. Лангел и др. [27] су открили да назимице изложене током другог тромесечја имају значајно више нивое циркулишућих ИгА, ИгГ и неутрализујућих антитела у поређењу са назимицама у првом и трећем триместру. Поред тога, Лангел ет ал. [27] су открили да прасади назимица изложених ПЕДВ-у у другом тромесечју имају стопу преживљавања од 100% у поређењу са мање од 87,2% у другим тромесечјима, што сугерише да су високи серумски ИгА, ИгГ и неутрализујућа антитела повезани са преживљавањем прасади у односу на ПЕДВ. Иако серумска антитела не пружају заштиту за ПЕДВ, резултати наше студије сугеришу да су нивои антитела који неутралишу серум повезани са заштитом од ПЕДВ инфекције. Као што су раније известили Браун ет ал. [14], ПЕДВ се излучује у измету након хомологног изазивања и вакцинације назимица. Ова студија је користила узорке истих животиња као и Бровн ет ал. [14]. даље показује да повећано антитело за неутрализацију серума након излагања изазову или вакцинације не утиче на образац излучивања вируса пошто се нивои антитела повећавају након изазивања и вакцинације. Даље студије су оправдане да би се потврдило да ли је количина вируса избаченог у фецесу повезана са количином неутрализујућих антитела које је присутно у серуму [21].

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

5. Закључци

Нул хипотеза ове студије била је да нема разлике у дијагностичким карактеристикама два ПЕДВ-неутрализирајућа антитела, ФФН и ХТНТ. Резултати показују да се ови тестови умерено слажу на основу капа статистике, док постоје варијације у њиховим дијагностичким карактеристикама и предиктивним вредностима на основу граничне вредности за тест. Ови тестови се могу користити за мерење одговора на вакцинацију стада. Неуспех да се одбаци нулта хипотеза показује да је ХТНТ пожељан тест за детекцију ПЕДВ-неутрализујућих антитела у серуму. Након вакцинације у групама ПРЕ и ПОСТ, ова студија је показала да је већина резултата позитивна. У ПРЕ групи, смањене варијације међу резултатима такође су пратиле изазов. Ови резултати сугеришу да би свињари могли да измере антитела која неутралишу серум како би утврдили да ли се ПЕДВ вакцине правилно примењују у стаду.

Референце

1. Саиф, Л.; Ванг, К.; Власова, А.; Јунг, К.; Ксиао, С. Коронавируси. У Болести свиња, 11. изд.; Зиммерман, ЈЈ, ур.; Вајли Блеквел: Хобокен, Њ, САД, 2019.

2. Сарменто, ЛВ; Поонсук, К.; Тиан, Л.; Мора-Диаз, ЈЦ; Маин, РГ; Баум, ДХ; Зиммерман, ЈЈ; Гименез-Лирола, ЛГ Детекција антитела за неутрализацију вируса свињске епидемије дијареје коришћењем цитометрије за снимање високе пропусности. Ј. Вет. Диагн. Инвестиг. 2020, 32, 324–328. [ЦроссРеф]

3. Стевенсон, ГВ; Хоанг, Х.; Сцхвартз, КЈ; Бурроугх, ЕР; Сун, Д.; Мадсон, Д.; Цоопер, ВЛ; Пиллатзки, А.; Гаугер, П.; Сцхмитт, БЈ; ет ал. Појава вируса епидемије дијареје свиња у Сједињеним Државама: клинички знаци, лезије и вирусне геномске секвенце. Ј. Вет. Диагн. Инвестиг. 2013, 25, 649–654. [ЦроссРеф]

4. Ким, И.; Ианг, М.; Гоиал, СМ; Цхееран, МЦ; Торреморелл, М. Евалуација биосигурносних мера за спречавање индиректног преноса вируса свињске епидемије дијареје. БМЦ Вет. Рес. 2017, 13, 89. [ЦроссРеф]

5. Песма, ДС; Ох, ЈС; Канг, БК; Ианг, ЈС; Моон, ХЈ; Иоо, ХС; Јанг, ИС; Парк, БК Орална ефикасност соја ДР13 вируса епидемије дијареје свиња ослабљених Веро ћелија. Рес. Вет. Сци. 2007, 82, 134–140. [ЦроссРеф] [ПубМед]

6. де Арриба, МЛ; Царвајал, А.; Позо, Ј.; Рубио, П. Мукозни и системски изотип-специфични одговори антитела и заштита код конвенционалних свиња изложених вирулентном или атенуираном вирусу епидемије дијареје свиња. Вет. Иммунол. Иммунопатхол. 2002, 85, 85–97. [ЦроссРеф] [ПубМед]

7. Фурукава, С.; Курода, И.; Сугииама, А. Поређење хистолошке структуре плаценте код експерименталних животиња. Ј. Токицол. Патхол. 2014, 27, 11–18. [ЦроссРеф] [ПубМед]

8. Боурне, ФЈ; Цуртис, Ј. Пренос имуноглобина ИгГ, ИгА и ИгМ из серума у ​​колострум и млеко код крмаче. Имунологија 1973, 24, 157–162. [ПубМед]

9. Паррен, ПВ; Буртон, ДР Антивирусна активност антитела ин витро и ин виво. Адв. Иммунол. 2001, 77, 195–262. [ЦроссРеф]

10. Бјустром-Крафт, Ј.; Воодард, К.; Гименез-Лирола, Л.; Ротоло, М.; Ванг, Ц.; Сун, И.; Ласлеи, П.; Зханг, Ј.; Баум, Д.; Гаугер, П.; ет ал. Детекција вируса епидемије дијареје свиња (ПЕДВ) и одговор антитела код комерцијалних свиња које расту. БМЦ Вет. Рес. 2016, 12, 99. [ЦроссРеф]

11. Ох, ЈС; Песма, ДС; Ианг, ЈС; Сонг, ЈИ; Моон, ХЈ; Ким, ТИ; Парк, БК Поређење ензимског имуносорбентног теста са тестом неутрализације серума за серодијагностику инфекције вирусом дијареје епидемије свиња. Ј. Вет. Сци. 2005, 6, 349–352. [ЦроссРеф]

12. Окда, Ф.; Лиу, Кс.; Сингреи, А.; Цлемент, Т.; Нелсон, Ј.; Цхристопхер-Хеннингс, Ј.; Нелсон, ЕА; Лавсон, С. Развој индиректне ЕЛИСА, блокирајуће ЕЛИСА, имуноесеја флуоресцентне микросфере и теста неутрализације флуоресцентног фокуса за серолошку процену изложености северноамеричким сојевима вируса свињске епидемије дијареје. БМЦ Вет. Рес. 2015, 11, 180. [ЦроссРеф] [ПубМед]

13. Цхен, К.; Ли, Г.; Сташко, Ј.; Тхомас, ЈТ; Стенсланд, ВР; Пиллатзки, АЕ; Гаугер, ПЦ; Сцхвартз, КЈ; Мадсон, Д.; Иоон, КЈ; ет ал. Изолација и карактеризација вируса свињске епидемије дијареје повезаних са избијањем болести код свиња у Сједињеним Државама 2013. Ј. Цлин. Мицробиол. 2014, 52, 234–243. [ЦроссРеф]

14. Бровн, Ј.; Радемацхер, Ц.; Бакер, С. Ефикасност комерцијалне вакцине против вируса епидемије дијареје свиња у смањењу трајања вирусног излучивања код назимица. ЈСХАП 2019, 27, 256–264.

15. Бјустром-Крафт, Ј.; Воодард, К.; Гименез-Лирола, Л. Одговори антитела на серум и млечну секрецију код свињских назимица са имунитетом против епидемије дијареје након вакцинације против епидемије дијареје свиња. ЈСХАП 2018, 26, 34–40.

16. Државни универзитет Ајове. Процедура за тест неутрализације флуоресцентног фокуса (ФФН) вирусом епидемије дијареје свиња (ПЕДВ). Серологија 2017, 1–7.

17. Државни универзитет Ајове. Процедура за тест неутрализације вируса епидемије свињске дијареје (ПЕДВ) високог протока (ХТНТ). Серологија 2017, 1–16.

18. Хиерхолзер, ЈЦ; Киллингтон, РА; Кангро, ХО; Махи, БВЈ Вирологи Метходс Мануал; Ацадемиц Пресс: Лондон, УК, 1996; стр. 21.

19. Тхрусфиелд, М. Ветеринарска епидемиологија, 2. изд.; Блацквелл Сциенце ЛТД: Хобокен, Њ, САД, 1995; стр. 479.

20. Лее, Ц. Вирус епидемије дијареје свиња: Епизоотски свињски вирус који се појављује и поново се појављује. Вирол. Ј. 2015, 12, 193. [Унакрсна референца]

21. Поонсук, К.; Гименез-Лирола, ЛГ; Зханг, Ј.; Арруда, П.; Цхен, К.; Цорреа да Силва Царрион, Л.; Магтото, Р.; Пинеиро, П.; Сарменто, Л.; Ванг, Ц.; ет ал. Да ли циркулирајућа антитела играју улогу у заштити прасади од вируса епидемије дијареје свиња? ПЛоС ОНЕ 2016, 11, е0153041. [ЦроссРеф]

22. Ниедервердер, МЦ; Нитфелд, ЈЦ; Баи, Ј.; Педдиредди, Л.; Бреазеале, Б.; Андерсон, Ј.; Керриган, МА; Ан, Б.; Оберст, РД; Цравфорд, К.; ет ал. Локализација ткива, излучивање, пренос вируса, одговор антитела и аеросолни пренос вируса епидемије дијареје свиња након инокулације 4-недељних свиња. Ј. Вет. Диагн. Инвест. 2016, 28, 671–678. [ЦроссРеф]

23. Мадсон, ДМ; Арруда, ПХ; Магстадт, ДР; Бурроугх, ЕР; Хоанг, Х.; Сун, Д.; Бовер, ЛП; Бхандари, М.; Гаугер, ПЦ; Стевенсон, ГВ; ет ал. Карактеризација вируса епидемије дијареје свиња изолује инфекцију САД/Иова/18984/2013 у прасади без колострума лишених 1-једнодневног царског реза. Вет. Патхол. 2016, 53, 44–52. [ЦроссРеф]

24. Маинау, Е.; Мантеца, Кс. Бол и нелагодност узроковани порођајем код крава и крмача. Аппл. Аним. Бехав. Сци. 2011, 135, 241–251. [ЦроссРеф]

25. Ерб, ХН Претходна вероватноћа (најбоља претпоставка пре теста) утиче на предиктивне вредности дијагностичких тестова. Вет. Цлин. Патхол. 2011, 40, 154–158. [ЦроссРеф] [ПубМед]

26. Тенни, С.; Хоффман, МР Преваленција. У СтатПеарлс; СтатПеарлс Публисхинг: Треасуре Исланд, ФЛ, САД, 2022. 27. Лангел, СН; Паим, ФЦ; Алхамо, МА; Буцклеи, А.; Ван Геелен, А.; Лагер, КМ; Власова, АН; Саиф, Љ Фаза гестације код свињске епидемије дијареје. Инфекција гравидних свиња утиче на имунитет мајке и лактогену имунолошку заштиту новорођенчади. Фронт. Иммунол. 2019, 10, 727. [ЦроссРеф] [ПубМед]