Одређивање ехинакозида у воденом екстракту Цистанцхе Херба помоћу ХПЛЦ

КСУ Схансхан1 ,ВУ Кангиу2 ,ТУ Ксингминг2 （1. Трећи клинички медицински факултет Универзитета кинеске медицине Гуангџоу, Гуангџоу 510405 Гуангдонг, Кина; 2. Трећа придружена болница Универзитета кинеске медицине Гуангџоу,Гуангџоу 510378 Гуангдонг,Кина） 

Апстрактан: објективан Установљена је ХПЛЦ метода за одређивањеЕцхинацосидеу воденом екстракту Цистанцхе десертицола. МетодеЕхинакозид је одређен помоћу ХПЛЦ. Раздвајање је извршено на Инертсил ОДССП Ц18 колона са мобилном фазом се састојала од ацетонитрила（A）и 0.4 процента раствора фосфорне киселине（B）,градијентним елуирањем. Таласна дужина детекције је постављена на 333 нм,а температура колоне је била 30 степена. Брзина протока је била 1,0 мЛ·мин-1 а запремина ињекције је била 10 μЛ.РезултатиЛинеарни однос ехинакозида у опсегу концентрација од 44.939 7-539.276 4 уг ·мЛ- 1 био добар（r = 0.999 8）. Опоравак је износио 94,59 посто -105.31 посто（= 2.93 одсто,n = 9）. Садржај ехинакозида у воденим екстрактима Цистанцхе херба износио је 15.527,7.347,12.267 мг·г-1 . 

Закључак: Успостављена ХПЛЦ метода са добром поновљивошћу је тачна,једноставно и изводљиво. Погодан је за одређивање ехинакозида у воденом екстрактуЦистанцхе десертицола ма. 

Кључне речи:ХПЛЦ;водени екстракт одЦистанцхе десертицола;Ецхинацосиде;утврђивање садржаја

Цистанцхе десертицолаје тоник који се обично користи у традиционалној кинеској медицини у клиничкој пракси и има репутацију "пустињски гинсенг". Цистанцхе десертицола укључена у издање Кинеске фармакопеје из 2015. је осушена, љускава, месната стабљика биљке Оробацеае Цистанцхе десертицола ИЦ Ма или Цистанцхе тубулоса (Сцхенк) Вригхт. Топле је природе, слатког и сланог укуса, припада меридијанима бубрега и дебелог црева. Има ефекте тонизирања јанга бубрега, користи есенцији и крви, влаже црева и ублажава затвор [2]. 

Пустињски гинсенг

„Схеннонг Материа Медица Цлассиц“ наводи да може „неговати средину, хранити пет унутрашњих органа и ојачати јин и хранити суштину.“.Цистанцхе десертицола углавном садржи фенилетаноидне гликозиде, иридоиде и гликозиде, лигнане и гликозиде, полисахариде, естре и алкалоиде [3].Фенилетанол гликозидису главне активне компонентеЦистанцхе десертицола, међу којима су ехинацеа и поред базена компоненте индикатора за идентификацију и одређивање садржаја Цистанцхе десертицола у кинеској фармакопеји. 

Фенилетанол гликозид је главна активна компонента Цистанцхе десертицола

Фармаколошке студије [4] указују на то Цистанцхе десертицолаима различите фармаколошке ефекте као што су влажење црева и ублажавање затвора, заштита јетре, отпор остеопорози, антиоксидација, против старења и умора. Водени екстракт одЦистанцхе десертицоламоже промовисати морфогенетски протеин 2 костију остеобласта код пацова, као и киселу фосфатазу и остеокалцин отпорну на тартарат у серуму мишева са оваријектомијом, као и гена Смад1 и Смад5 и трансформишућих фактора раста у коштаној сржи- Експресија и др.ефекат против остеопорозе [5-6]. Ецхиносиде може промовисати пролиферацију остеобласта и промовисати диференцијацију мезенхималних матичних ћелија коштане сржи у остеобласте ин витро[7-9]. 

Ецхиносиде, главна хемијска компонента Цистанцхе десертицола

Кликните овде да видите производе Натурал Цистанцхе Ецхинацосиде

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Последњих година било је много извештаја о одређивању садржаја ехинакозида и базена у алкохолном екстракту Цистанцхе десертицола и његовим сложеним препаратима [10-12], али је мало извештаја о одређивању садржаја индикаторске компоненте у воденом екстракту Цистанцхе десертицола. У овој студији, течна хроматографија високих перформанси (ХПЛЦ) је коришћена за одређивање садржаја ехинакозида у воденом екстракту Цистанцхе десертицола.

1. Материјал

1.1 Апарат

ЛЦ-20АТ течна хроматографија високих перформанси, СПД-20А детектор, СИЛ-20Аутоматски узоркивач, ЦТО-10АСвп кутија за температуру колоне, ЛЦсолутион радна станица за течну хроматографију, Схимадзу Цорпоратион Јапана; МЕС125П-ОЦЕ-ДУ Електронска аналитичка вага, Сарториус, Немачка; СХЗ-Д (ИИИ) вишенаменска вакуум пумпа за циркулациону воду, Хенан Иухуа Инструмент Цо., Лтд;

1.2РЦ2БСО25 ротациони испаривач циркулациони систем за хлађење, РВ10ДС96 ротациони испаривач, ИКА, Немачка; ДК-С26 Електрично термостатско водено купатило, Схангхаи Јингхонг Екпериментал Екуипмент Цо., Лтд; Машина за ултра чисту воду серије УПР, Сицхуан Иоупу Ултра Пуре Тецхнологи Цо., Лтд.

1.2 Медицински материјали и реагенси

Медицински материјал за месо Ронг, набављен од Гуангзхоу Лингнан Традитионал Цхинесе Медицине Слицес Цо., Лтд., серијски број: 18010011806001, 181001. Осушене, љускаве, меснате стабљике биљке Леобацеае Цистанцхе десертицола коју је идентификовао главни кинески Тхиард А Тхиард А Хермингили Болница Универзитета традиционалне кинеске медицине у Гуангџоу се чува у соби за инспекцију лекова Треће придружене болнице Универзитета традиционалне кинеске медицине Гуангџоу; Референтна супстанца ехинозида, садржај 89,7 процената, Кинески институт за контролу хране и лекова, број серије: 111670-201706; Ацетонитрил је хроматографски чист (Мерцк, Немачка); Метанол и фосфорна киселина су аналитички чисти (Тиањин Фуиу Фине Цхемицал Цо., Лтд.); Вода је ултра чиста вода.

2. Методе и резултати

2.1 Припрема воденог екстракта из Цистанцхе десертицола

Узмицистанцхе прах, додајте 10 пута већу количину дестиловане воде, загрејте и рефлуксујте да бисте екстраховали два пута, сваки пут по 1 сат. Филтрирајте, комбинујте филтрат и користите ротациони испаривач да концентришете филтрат до садржаја сировог лека од 0.100 г · мЛ-1. Чувати на 4 степена у стању приправности. 2.2 Услови хроматографије и прикладност система Хроматографска колона: ИнертсилОДС СПЦ18 колона (150 мм × 4,6 мм, 5 μ м); Мобилна фаза: ацетонитрил (А) - 0.4 процента раствора фосфорне киселине (Б), градијент елуације: 0~ 5 мин, 17 процената А; 5 ~ 25 мин, 20 процената А; 25 ~ 30 мин, 17 процената А; Таласна дужина детекције: 333 нм; Температура колоне: 30 степени; Брзина протока: 1,0 мЛ · мин-1; Запремина убризгавања: 10 μ Л. Под овим хроматографским условима резолуција између пикова ехинацее и суседних компоненти је већа од 1,5, а теоретски број колона не би требало да буде мањи од 4000 за пикове ехинацее.Хроматограм је приказан на слици 1.

Слика 1 ХПЛЦ хроматограми ехинакозида (А) и воденог екстракта Цистанцхе херба (Б)

2.3 Припрема раствора

2.3.1 Референтно решење

Измерите одговарајућу количинуЕцхинацетинреферентну супстанцу, прецизно је измерити, ставите је у волуметријску тиквицу од 10 мЛ, додајте метанол да се раствори и учините да садржи 898,794 ехинацетина по милилитру μ Г референтног раствора, ускладиштеног на 4 степена за приправност.

Ецхиносиде оф Цистанцхе десертицола

2.3.2 Тест решење

Прецизно измерите 2.0 мЛ воденог екстракта Цистанцхе десертицола, испарите у воденом купатилу, растворите у метанолу, доведите до константне запремине у мерилној посуди од 10 мЛ, добро промућкајте, микропорозно од 0,22 μМ мембранска филтрација, наиме.

2.4 Истраживање линеарне везе

Прецизно измерите {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, и 3.00 мЛ референтног раствора под 2.3.1 и ставите их у волуметријску тиквицу од 5 мЛ, додајте метанол до константне запремине и добро протресите да бисте добили градијент концентрације од 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176,394 , и 539,2764 μГ · мЛ-1 референтног раствора, 0,22 μМ микропорозна мембранска филтрација. Извршити одређивање према хроматографским условима у 2.2 и забележити површину пика. Коришћењем масене концентрације референтне супстанце као апсцисе (Кс, μ Г · мЛ-1), површина пика је ордината (И), а добија се једначина линеарне регресије: И=13185. 0Кс-32273.0, р=0.9998. Резултати су показали да се ехинацеа кретала од 44,9397 до 539,2764 μ. Линеарни однос у опсегу концентрације од г · мЛ-1 је добар.

2.5 Тест прецизности

Узмите 539,2764 μГ · мЛ-1 референтног раствора, убризгајте узорак непрекидно 6 пута у складу са хроматографским условима у 2.2 и забележите површину пика. Резултати Динар површине пика ехинацее износио је 1,81 одсто, што указује на добру прецизност инструмента.

2.6 Испитивање стабилности

Прецизно измерите 2.0 мЛЦистанцхе десертицолаводени екстракт, испарити до сува у воденом купатилу, растворити у метанолу, довести до константне запремине у волуметријској посуди од 10 мЛ, добро промућкати, 0.22 μ Филтрирати са микропорозном мембраном, убризгати узорци за одређивање у 0, 2, 4, 8, 12 и 24 сата према хроматографским условима у 2.2 и забележити површину пика. Резултати Динар површине пика ехинацее био је 1,16 процената, што указује да је тест раствор имао добру стабилност у року од 24 сата.

2.7 Тест поновљивости

Прецизно измерите 6 порција од 2.0 мЛ воденог раствораекстракт Цистанцхе десертицола, припремити 6 порција раствора за испитивање паралелно према методи описаној у 2.3.2, убризгати узорке за одређивање према хроматографским условима описаним у 2.2 и забележити површину пика. Резултати Динар масене концентрације ехинацее износио је 1,28 одсто, што указује да је метода имала добру поновљивост.

Експеримент са цистанцхе десертицола

2.8 Тест опоравка додавања узорка

Прецизно измерите 9 порција од 1.0 мЛЦистанцхе десертицолаводеног екстракта, додати {{0}}.8, 1.0 и 1,2 мЛ референтног раствора (101,552 мг · мЛ - 1), испарити у воденом купатилу, растворити у метанол, и доведите до запремине у мЛ волуметријској тиквици; Добро протресите, 0,22 μ Филтер са м микропорозном филтерском мембраном да бисте припремили тест раствор високе, средње и ниске концентрације. Припремите 3 дела сваке концентрације паралелно, измерите у складу са хроматографским условима у 2.2, забележите површину пика и израчунајте опоравак од зависности од узорка. Резултати су приказани у табели 1.

2.9 Одређивање садржаја узорка

Прецизно измерите 3 порције од 2.0мЛводени екстракт из Цистанцхе десертицола, испарити до сува у воденом купатилу, растворити у метанолу, довести до константне запремине у волуметријској посуди од 10 мЛ, добро промућкати, 0,22 μ Филтер са микропорозном мембраном, мерити према хроматографским условима у 2.2, забележите површину врха и израчунајте садржај ехинацее. Резултати су приказани у табели 2.

Табела 1 Резултати тестова опоравка ехинакозида

Табела 2. Резултати одређивања садржаја ехинакозида у воденом екстракту Цистанцхе херба

3.Дискусија

3.1 Метода припреме испитног артикла

Водени екстракт одЦистанцхе десертицоласадржи различите хемијске компоненте као што су фенил етанол гликозиди и полисахариди, који изазивају одређене сметње са компонентама које треба тестирати. Ова студија је истраживала две различите концентрације растварача, 50 процената метанола и метанола. Резултати су показали да је ефекат раздвајања пикова у хроматограму тестираног производа коришћењем 50% метанола као растварача био лош између ехинацее и суседних компоненти; Коришћењем метанола као растварача, резолуција врха гликозида ехинацее је добра и нема сметњи од других врхова нечистоћа. Због тога је метанол изабран као растварач за тест раствор. Коришћењем метанола као растварача, водени екстракт Цистанцхе десертицола је упарен до сува у воденом купатилу. Коришћене су две методе третмана: растварање метанола, мућкање константне запремине и ултразвучно растварање метанола (10 мин). Резултати су показали да нема значајне разлике између ове две методе. Овај метод је изабран за припрему тестног раствора због једноставног поступка растварања метанола и мућкања константне запремине.

Кинеска трава цистанцхе

3.2 Избор мобилне фазе

У овој студији се помиње мобилна фаза (метанол-0.1 проценат мравље киселине) која се користи за одређивање садржаја Цистанцхе десертицола у кинеској фармакопеји (том И) (2015). Резултати су показали да се врх гликозида ехинацее проширио и да је постојао феномен водећих ивица, који може бити повезан са слабом способношћу елуирања мобилне фазе; Позивајући се на релевантну литературу [12-13], ацетонитрил-0.5 процената сирћетне киселине је коришћен као мобилна фаза, али је облик врха ехинацее био лош и постојао је феномен осипања. С обзиром на пХ вредност мобилне фазе, ацетонитрил-0.4 процентна фосфорна киселина је коначно коришћена као мобилна фаза. Као резултат тога, теоретски број пикова ехинацее био је већи од 4000, а резолуција између пикова ехинацее и суседних компоненти била је већа од 1,5. Облик врха је био симетричан, без сметњи од врхова нечистоћа, а основна линија је била стабилна. Стога је у овој студији коришћена ацетонитрил - 0.4 процентна фосфорна киселина као хроматографска мобилна фаза за одређивање садржаја ехинацее. У овој студији,ХПЛЦ метода је коришћена за одређивање ехинацее у воденом екстракту Цистанцхе десертицола.

Цистанцхе екстракт у праху

Метода је једноставна, тачна и поновљива. Погодан је за одређивање ехинацее у воденом екстракту цистанцхе десертицола и може се користити као метода контроле квалитета за водени екстракт цистанцхе десертицола.Ово истраживање само је утврдило садржај ехинацее у воденом екстракту Цистанцхе десертицола.Убудуће,планирано је да се одреди садржај ехинацее у сложеној децокцији Цистанцхе десертицола како би се истражио утицај различитих фактора на садржај ехинацее, пружајући референцу за контролу квалитета декокције која садржи Цистанцхе десертицола.

референца:

[1] Зхонг Пинг пустињски гинсенг и цистанцхе [Ј] Шума и људска бића, 2004, 24 (11): 25

[2] Фармакопеја Националне комисије за фармакопеју Народне Републике Кине (И део) [М] Пекинг: Цхина Медицал Сциенце анд Тецхнологи Пресс, 2015:135-136

[3] Цхен Феи, Цхен Зхуо, Ксинг Ксуефеи, ет ал Напредак истраживања у Цистанцхе десертицола [Ј] Студија о процени лекова, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Фанг Јиан Напредак у фармаколошком истраживању Цистанцхе десертицола [Ј] Гуангминг Традитионал Цхинесе Медицине, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Ксинг Ксиаоку, Лиу Зхонгјие, Хан Бо Ефекат воденог екстракта цистанцхе десертицола на експресију гена за морфогенетски протеин 2 кости у остеобластима пацова [Ј] Кина животињаСточарство и ветеринарство, 2013, 40 (1): 17-21

[6] ЛИАНГ Х, ИУ Ф, ТОНГ З, ет ал. Цистанцхес херба водени екстракт који утиче на нивое експресије БГП и ТРАП у серуму и Смад1 мРНА, Смад5 мРНА, ТГФ- 1 мРНК и ТИЕГ1 мРНК код болести остеопорозе[Ј]. Извештаји о молекуларној биологији, 2013, 40 （2）:757-763.

[7] Фанг Хаилин, Ли Јункао, Иао Сенминг и др. Опсервација о ехинозиду који промовише пролиферацију остеобласта пацова активацијом ЕРК/БМП-2 сигналног пута [Ј] Грассроотс Медицал Форум, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Тиан Иуан студија о диференцијацији мезенхималних матичних ћелија коштане сржи у остеобласте изазване ехиназидом и његовим механизмом [Д] Шењанг: Универзитет традиционалне кинеске медицине Лиаонинг, 2015.

[9] Веи Давеи, Ге Зииу, Лиу Иихан, итд. Студија о диференцијацији мезенхималних матичних ћелија коштане сржи у остеобластима изазвана ехинозидом [Ј] Фармакологија и Клиника традиционалне кинеске медицине, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Тиан Иубиао, Ианг Гуанг'ан, Хуанг Веијие, ет ал. Одређивање ехинозида и пилозида у микропрашку Цистанцхе десертицола помоћу ХПЛЦ [Ј] Пољопривредни универзитет Анхуи, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Ианг Суде, Ху Јунхуа, Ли Јиацхун, ет ал. Истовремено одређивање ехинозида, пилозида и изопилозида у капсулама тоталних гликозида Цистанцхе помоћу ХПЛЦ [Ј] Светска наука и технологија – Модернизација традиционалне кинеске медицине, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Ксу Ксиаокуе Фармакодинамичке и метабономске студије о ефектима Цистанцхе десертицола против остеопорозе и његових ефикасних компоненти [Д] Иинцхуан: Нингкиа Медицал Университи, 2017.

[13] Иан Иао, Менг Ксиниуан, Ксу Хуанхуан, ет ал. Одређивање ехинозида и пилозида у оралној течности Киронг Рунцханг помоћу течне хроматографије високих перформанси [Ј] Јоурнал оф Ксињианг Медицал Университи, 2018, 41 (7): 886-888892