Изложеност издувним гасовима дизела мења експресију мрежа укључених у неуродегенерацију у мозгу зебрице, 2. део

Припрема узорака протеина

Да би се припремили узорци протеина, главе од 80 до 100 анестезираних ларви (5 пдф) су пажљиво изоловане и испране са ПБС пре преношења у пуфер за лизу који се састојао од 15% претходно охлађеног ТЦА/ацетона који садржи 0,07% бета-меркаптоетанола (МЕ )и коктел инхибитора протеазе (потребан произвођач) у укупној запремини од 500 ул.

Последњих година постоји велико интересовање за ефекте протеинских узорака на памћење. Све више људи почиње да схвата значај исхране за здравље, посебно важну улогу протеина у људском телу.

Протеини су основни грађевински материјали људског тела и играју важну улогу у људском телу. Због тога су узорци протеина постали важан канал за многе људе у потрази за здрављем и лепотом. Поред изградње мишића и обликовања тела, узорци протеина такође могу побољшати памћење особе.

Неки научници су проучавали однос између протеина и памћења. Открили су да је дуготрајан унос довољно протеина користан за све аспекте физичког здравља, посебно за памћење. Све је више доказа да унос протеина у исхрани има важан утицај на функцију мозга и памћење.

Протеин је важна компонента неурона у људском мозгу, тако да дневни унос протеина има важан утицај на памћење и способност размишљања људи. Дуготрајни унос протеина не само да задовољава потребе организма за протеинима, већ и помаже мозгу да остане активан и здрав.

Поред тога, протеини такође могу помоћи телу да одржи равнотежу шећера у крви и одржи стабилно расположење. Ово је веома важно за одржавање памћења и способности размишљања. Стога, умерени унос протеина може помоћи у побољшању различитих когнитивних функција и емоционалних стања људског тела.

Све у свему, постоји јака веза између узорака протеина и меморије. Повећање уноса протеина помаже у одржавању здравља мозга и тела, побољшавајући вештине размишљања и памћење. За људе који треба да побољшају своје памћење, веома је неопходно да конзумирају одговарајућу количину протеина. Требало би да једемо протеинску храну на одговарајући начин и да обратимо пажњу на разумне оброке како бисмо одржали здраво тело и оштар ум. Види се да морамо побољшати памћење, а Цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење, јер Цистанцхе десертицола има антиоксидативна, антиинфламаторна и анти-агинг ефекта, што може помоћи у смањењу оксидације и инфламаторних реакција у мозгу, чиме се штити здравље нервног система. Поред тога, Цистанцхе десертицола такође може да подстакне раст и поправку нервних ћелија, чиме се побољшава повезаност и функција неуронских мрежа. Ови ефекти могу помоћи у побољшању памћења, учења и брзине размишљања, а такође могу спречити развој когнитивне дисфункције и неуродегенеративних болести.

Кликните на суплементе да бисте побољшали памћење

После кратке хомогенизације, протеини су преципитирани током 12 х на 20 степена, након чега је уследило центрифугирање на 12,000 рпм током 5 минута на 4 степена. Супернатант је уклоњен, а протеинска пелета је испрана два пута хладним ацетоном (који садржи 0.07% МЕ и коктеле инхибитора протеазе). Финални протеински пелет је растворен у пуферу за лизу који садржи 7,0 М урее, и 2,0 М тиоуреје ултразвучном обрадом на леду.

Узорци растворених протеина су центрифугирани на 15,000 рпм током 10 минута на 4 степена да би се исталожиле нерастворљиве честице, а концентрација коначних узорака протеина је мерена коришћењем Брадфорд методе.

Протеомичка анализа високе пропусности заснована на ТМТ-у

Узорци су редуковани, алкиловани и дигестирани узастопним додавањем трипсина и лис-Ц протеаза. Пептиди су затим обележени коришћењем 10-плекТМТ изобаричних ознака у складу са упутствима произвођача. Обележени узорци су помешани и затим фино фракционисани коришћењем високо пХ реверзне фазехроматографије.

Појединачне фракције су затим анализиране помоћу ЛЦ–МС/МС коришћењем онлајн реверзне фазне хроматографије и тандем масене спектрометрије на Тхермофсхер Фусион Лумос масеном спектрометру. Подаци су добијени коришћењем МС3 методе засноване на синхроној селекцији прекурсора, као што је претходно описано (МцАлистер и др. 20). Претраживање базе података и екстракција информација о ТМТ репортер јонима обављени су коришћењем софтверске платформе МакКуант (Цок анд Манн 2008).

Поређење ТМТ података у узорцима је извршено коришћењем МССтатс (Цхоиет ал. 2014). Транскриптомска анализа Приближно 80–100 глава је изоловано из анестезираних ембриона (120 х), испрано ПБС и подвргнуто тоталној екстракцији РНК коришћењем Тризолрицх (Сигма Саинт Лоуис Ал). , САД) реагенс према упутствима произвођача.

Квалитет и квантитет РНК су процењени коришћењем спектрофотометра НаноДроп2000 (Тхермо Сциентифиц, МА) и даље помоћу Агилент 2100 Биоанализер да би се обезбедила минимална концентрација од 50 нг/ул и број интегритета РНК (РИН) од 8. Припрема библиотеке је затим обављена коришћењем ХиСек Илумина. протокол: „Припремни радни ток ТруСекСтрандед Тотал РНА Либрари Либрари витхРибо-Зеро Голд“, а узорци су секвенционирани према следећим условима: „Упарени крај рада, Р1=75 циклуси (антисенсе ланац), Индекс=8 циклуси, Р2=75 циклуса (сенсе ланац).“

Анализа података

Оба скупа података за протеомске и транскриптомске студије су истовремено отпремљена и анализирана коришћењем онлајн алата Метасцапе, који омогућава означавање гена за различите врсте, укључујући Данио рерио (Зхоу ет ал. 2019). Да би се проценио допринос измене профила протеома или транскриптома, били су специфични путеви, подаци анализирано коришћењем софтвера Ингенуити Патхваис Аналисис (ИПА) (Крамер ет ал. 2014).

Скупови података који садрже идентификаторе гена или протеина и одговарајуће вредности експресије су учитани у апликацију. Сваки идентификатор је мапиран на свој одговарајући објекат у Ингенуити бази знања.

Граница промене експресије од 13- пута је постављена да идентификује молекуле чија је експресија различито регулисана. Функционална анализа је идентификовала биолошке функције и/или болести које су биле најзначајније за скуп података. За анализу су узети у обзир молекули из скупа података који су испунили граничну вредност и који су били повезани са биолошким функцијама. Деснорепи Фишеров тачан тест је коришћен за израчунавање п-вредности која одређује вероватноћу да је свака биолошка функција и/или болест додељена том скупу података само због случајности.

Анализа пута

Да би се проценио допринос било које промене профила протеома или транскриптома на специфичним путевима, оба скупа података су отпремљена у ИПА софтвер (Крамер ет ал. 2014). Главни значајни измењени канонски путеви су затим даље процењени и интерпретирани коришћењем ПЦР-а и вестерн блотинга као што је описано у наставку.

Вестерн блоттинг

Укупно 25 µг протеина је напуњено на 12% НуПАГЕ (Новек, ЦА) и пребачено на ПВДФ мембране (Новек, ЦА) како је описано (МахмоудианСани ет ал. 2017; Рафее ет ал. 2019). Мембране су блокиране са 5% обраног млека у Трис-пуферисаном физиолошком раствору и 0,01% Твеен 20 (ТБСТ пуфер) у трајању од 30 минута на собној температури, а затим инкубиране преко ноћи на 4 степена са поликлоналним анти-Цип1А1 (Абцам, ЦА) или мишјим моноклоном (Абцам, ЦА) Абцам, ЦА), разблажен у ТБСТ пуферу који садржи 1% обраног млека.

Након испирања у ТБСТ, мрље су инкубиране са секундарним магарећим анти-ХРП-ХРП (Абцам, ЦА) или козјим анти-мишјим-ХРП (Санта Цруз, ЦА) антителима током 2 х, након чега је уследио развој са Пиерце™ ЕЦЛ Плус вестерн блоттинг супстратом ( Тхермо Фисхер Сциентифиц, САД). Траке су визуелизоване снимањем помоћу ЛИ-ЦОР скенера и анализиране дензитометријом (ЛИ_ЦОР Биосциенцес,НЕ).

ПЦР у реалном времену

Укупна РНК је изолована из глава коришћењем ТРИзол реагенса (Сигма Алдрицх, Саинт Лоуис, УСА) према упутствима произвођача, а затим је мерена коришћењем НаноДроп 2000 спектрофотометра (Тхермо Сциентифиц, МА). Количина од 1 уг сваког узорка РНК је реверзно транскрибована коришћењем иСцрипт™ супермикса за реверзну транскрипцију (Био-Рад, ЦА), а ПЦР у реалном времену је изведен коришћењем СсоАдванцедУниверсал СИБР Греен супермикса (Био-Рад, ЦА), а прајмери ​​су наведени у додатној табели 1. Релативни нивои експресије су израчунати коришћењем 2-ΔΔЦТ методе, а статистички Т-тест је коришћен за процену значајних разлика.

Резултати и дискусија

Протеомске и транскриптомске анализе су два главна алата за разумевање молекуларних механизама у позадини процеса болести и одговора на стимулансе из околине (Дуан ет ал. 2017; Гарциа-Естрада ет ал. 2013; Јами ет ал. 2014а, б, 2015; Косалкова ет ал.2012) . Овде смо извршили дубоке анализе експресије и на транскриптомском и на протеомском нивоу у главама ембриона зебрице изложених ДЕПе.

Главе, састављене углавном од можданог ткива, изоловане су да би се елиминисали профили експресије других ткива јер смо заинтересовани за одређивање интринзичних патолошких путева ЦНС-а.

Профил експресије глава зебрафисхембриона

Анализа профила је дала 11.172 откривена протеина и 14.748 мета мРНА од више од 26 000 кодирајућих гена (Хове ет ал. 2013). Међу 11.172 протеина идентификованих из узорака обележених ТМТ (додатна табела 2), 141 протеин је био значајно повећан, а 607 је било смањено (додатна табела 3 и слика 1а). Слично томе, 367 транскрипата је регулисано навише, а 149 је смањено међу 14.748 транскрипата (додатна табела 4) откривених у РНА-сек анализи (слика 1б и додатна табела 5).
У већини случајева, налази из побољшане протеомске и транскриптомске анализе били су конзистентни. На пример, високо регулисани протеини укључују цитохром П450 Цип1а, Цип1ц1, гама подјединицу протеина који везује гваниннуклеотиде, анексин, кратку изоформу плексина Б2б, дехидрогеназу/редуктазу (фамилија СДР) 13-као 1, С-антиген гретине (аррестин) б и сулфотрансфераза6Б1.

Слично, гени са највећом транскриптомикурегулацијом укључују цитокром П450 (Цип1а), хемокин (Ц–Ц мотив) лиганд 27а, репресор рецептора арил-угљоводоника А, цитокром П450 (Цип1б) и гликопротеин Ц породице Рх, гликопротеин регулисане руке Довн и Довн. нису увек биле у високој корелацији.

На пример, комплексин 2, спектрин алфа, лаки ланац срчаног миозина-1, протеин који интерагује са СЕЦ23, подјединица мембране АТПсинтазе ЕА, цитохром б и НАД-зависна протеин деацетилаза спадају међу протеине са високим нивоом регулације, док мембрански протеин ретиналоутер сегмента 1а , породица носача раствора 5 (транспортер јодида), ФБЈ вирусни хомолог Б онкогена за остеосарком миша, комплексин 4ц, ФОС-слични антиген 1а, опсин 1 и в-фос показују највећу регулацију транскрипције (Табеле 1 и 2).

Антитела која препознају протеине зебрице су ограничена, али смо потврдили узорак ових промена коришћењем Вестерн блот анализе. Повећана регулација протеина Цип1А и ниска регулација комплексина 2 (ЦПЛКС2) су потврђени коришћењем ГАПДХ као контроле оптерећења (слика 2а). Виши нивои транскрипције ТАТ и УГТ1Б1 и нижи нивои ЦХНРБ и ТХ2 такође су потврђени кПЦР коришћењем Елф-алфа као интерне контроле (слика 2б).

Гене анотација

Постоји неколико онлајн биоинформатичких алата и софтвера који могу пружити корисне информације о белешкама о генима. Међу њима, Метасцапе, са могућношћу означавања гена за Данио рерио (Зхоует ал. 2019), коришћен је у овом раду.

Оба скупа података за протеомске и транскриптомске студије су истовремено учитана и анализирана коришћењем овог онлајн алата. Након комбиновања излаза и протеомских и транскриптомских промена у софтверу, неколико процеса као што су одговор на ксенобиотски стимуланс, метаболизам ксенобиотика помоћу цитохрома П450 експресије, пронађени су изазвани третманом ДЕПе (слика 3а).

Ова анализа је такође сугерисала потиснуте нивое биолошких процеса као што су „визуелна перцепција“, „фототрансдукција“ и „интернализација рецептора везаних за Г протеин“. Промене у експресијским профилима везаним за вид нису биле неочекиване пошто је третман ДЕПе током раног развоја резултирао мањим очима (подаци нису приказани).

Сигнализација метаболизма ксенобиотика

Ксенобиотици, који су страна природна или синтетичка хемијска једињења, могу покренути ћелијски одговор на стрес, што доводи до диференцијације, пролиферације, апоптозе или некрозе. Заиста, тело треба да се активно штити од ксенобиотика, као и токсичних ендогених једињења и њихових метаболита, путем експресије ензима и транспортера који учествују у њиховој елиминацији и детоксикацији.

Ови ензими су класификовани у три групе: ензими фазе И (ЦИП, АЛДХ, ФМО) који уводе поларитет у ксенобиотике; Ензими фазе ИИ (УГТ,ГСТ, СУЛТ) који уводе хидрофилност коњугацијом хидрофилних молекула као што су сулфат, глукуронска киселина и глутатион са ксенобиотицима; и ензими фазе ИИИ (МДР1, ОАТП2, МРП) који преносе ксенобиотике или коњугате ИИ формиране током Пха на екстрацелуларно подручје.

Ови ензими се индукују сигналним каскадама које укључују специфичне рецепторе (ЦАР, ПКСР, АХР) и МАПК посредовану активацију транскрипционих фактора (НРФ2, МАФ) (Омиецински ет ал. 2011).

У одсуству активатора, конститутивно активни рецептор (ЦАР) се налази у цитоплазми као комплексу са ЦЦРП и ХСП90. Али када је присутан активатор, ЦАР се транслоцира у језгро и везује се за РКСР да би формирао хетеродимер и даље се везује за неколико варијанти мотива понављања, као што су ДР3, ДР4, ЕР6 и ЕР8, и доприноси регулацији генске експресије (додатна табела 2).

Наша протеомичка анализа открила је активацију ксенобиотског метаболизма. Заиста, јасна регулација ЦИП1А1, ЦИП3А7, ХМОКС1 (хем оксигеназа 1), ЦАТ (каталаза) и ЦЕС1 (карбоксилестераза 1) показује индукцију метаболизма фазе И, док је повећана експресија УГТ1А1 (УДП глукуронозилтрансфераза) и 1 члана ГСТП породице А1. глутатионС-трансфераза пи 1) указује на активацију метаболизма фазе ИИ.

Занимљиво је да регулација сулфатних трансфераза као што су СУЛТ1А1 (члан 1 породице сулфотрансфераза 1А), СУЛТ1Ц2 (члан 2 породице сулфотрансфераза 1Ц) и СУЛТ2Б1 (члан 1 породице сулфотрансфераза 2Б) сугерише да се повећање хидрофилности у фази ИИ метаболизма по могућству јавља преко метаболизма глутане киселине, а да има тенденцију да се , али не и сулфатна коњугација (слика 4).

Резултати транскриптомске студије су прилично конзистентни, пошто су ЦИП1А, ЦИП1Б, ЦИП3А7, ГСТО1, ГСТП1 и УГТ1А1 сви појачано регулисани на нивоима РНК. Међутим, СУЛТ2Б1 показује повећање регулације на нивоу РНК (док је недовољно заступљен на нивоима протеина).

Ово може бити због укључивања других механизама који индукују деградацију или инактивацију ензима сулфат трансферазе након третмана са ДЕПе. Оно што је посебно изненађујуће је да су се ове промене у метаболизму ксенобиотика догодиле у главама (вероватно мозговима) риба. Експресија ксенобиотских гена је описана у нервном систему сисара, али ово је први извештај о њима у мозгу зебрице (МцМиллан анд Тиндале 2018).

Ови налази су у складу са сличном студијом коју су спровели Сханкар и сарадници који су тестирали ефекте различитих група еколошких полицикличних ароматичних угљоводоника (ПАХ) на развој ембриона и даље проценили утицај сваког режима лечења на профил транскриптома.

На целом телу од 48 ембриона након оплодње (хпф), они су показали да је регулација Цип1а на нивоу транскрипције и протеина рани поуздани биомаркер активације ксенобиотичког АХР-а и низводних транскриптомских промена (Сханкар ет ал. 2019).

НРФ2-посредовани одговор на оксидативни стрес

Оксидативни стрес може да изазове апоптозу и некрозу и верује се да је укључен у неуродегенерацију (Ахмадинејад ет ал. 2017; Јами ет ал. 2014б, 2015). Главни одбрамбени одговор ћелије на оксидативни стрес је индукција антиоксидативних и детоксикационих ензима.

Нуклеарни фактор-еритроидни 2-фактор 2(Нрф2) се везује за елементе антиоксидативног одговора промотера (АРЕ) и активира њихову транскрипцију. Неактивни Нрф2 је повезан са протеином Кеап1 који везује актин и задржава се у цитоплазми.

Покренут оксидативним стресом, Нрф2 је фосфорилисан као одговор на путеве протеин киназе Ц, фосфатидилинозитол 3-киназе и МАП киназе. Фосфориловани Нрф2 се затим може транслоцирати у језгро и везати АРЕ да би трансактивирао ензиме за детоксикацију и антиоксидансе (додатна табела 3) (Ма 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com