Изразити генски рецептори сличних рецепторима и одговор глија у различитим регионима мозга природног сцрапие-а, 2. део

2.2. Неуропатолошке карактеристике хипокампуса оваца природно заражених серапијом

Код оваца инфицираних сцрапие и контролних оваца, четири следећа хипокампална подручја су детаљније испитана за све патолошке маркере: пирамидални слојеви ћелија ЦА1, ЦА3 и ЦА4 и СЛМ (Слика 3).

Недавне студије су показале да пирамидални слој ћелија игра важну улогу у памћењу. Пирамидални ћелијски слој је неуронски у мозгу који је углавном одговоран за перцепцију спољашњег окружења и складиштење меморије.

Током учења и памћења, слој пирамидалних ћелија ослобађа неке неуротрансмитере, који могу стимулисати комуникацију између неурона, чиме се побољшава складиштење и враћање меморије. Поред тога, слој пирамидалних ћелија такође може да прегледа и интегрише информације у процес учења и памћења, помажући нам да брзо савладамо нова знања и вештине.

Студије су такође откриле да функција и здравље слоја пирамидалних ћелија имају велики утицај на перформансе памћења. Ако је слој пирамидалних ћелија оштећен или под великим стресом, памћење може бити значајно погођено. Због тога морамо да обратимо пажњу на здравље и одржавање слоја пирамидалних ћелија да бисмо одржали добре способности учења и памћења.

Препоруке за здравље и одржавање слоја пирамидалних ћелија укључују исхрану, вежбање и сан. На пример, исхрана богата масним киселинама и антиоксидансима може помоћи у промовисању здравља слоја пирамидалних ћелија; редовно вежбање може побољшати функцију и отпорност нервног система; а добре навике спавања могу помоћи у смањењу стреса на слоју пирамидалних ћелија и подстицати консолидацију и враћање меморије.

Укратко, пирамидални слој ћелија игра важну улогу у учењу и памћењу. Треба да обратимо пажњу на здравље и одржавање слоја пирамидалних ћелија како бисмо побољшали наше способности учења и памћења.

Кликните на Знај краткорочну меморију како да побољшате

Истовремено, треба избегавати претерани умор и стрес, обезбедити мозгу адекватан одмор и време опоравка и омогућити да се наше памћење континуирано унапређује и усавршава.

Види се да треба побољшати своје памћење. Цистанцхе може значајно побољшати памћење јер има антиоксидативне, антиинфламаторне и анти-агинг ефекте, што може помоћи у смањењу оксидације и инфламаторних реакција у мозгу, чиме се штити здравље нервног система. Поред тога, Цистанцхе такође може да подстакне раст и поправку нервних ћелија, чиме се побољшава повезаност и функција неуронске мреже.

Ови ефекти могу помоћи у побољшању памћења, способности учења и брзине размишљања, а такође могу спречити појаву когнитивне дисфункције и неуродегенеративних болести.

Слика 3. Дистрибуција неуропатолошких лезија (ХЕ), таложења ПрПСц, астроглиозе (ГФАП) и микроглиозе (Иба1), у четири различита региона хипокампуса код овце инфициране сцрапие и контролне овце: слојеви пирамидалних ћелија ЦорнуАммонис (ЦА) 1, 3 и 4 , и стратум лацуносум-молекуле (СЛМ).

Графикони приказују полуквантитативне вредности процене за сваки анализирани параметар. (А) Уочене су благе спужвасте промене у свим анализираним регионима хипокампуса. (Б) Интранеуронски ПрПСц образац (Л42) у ЦА1, ЦА3 и ЦА4 и широко распрострањени фино грануларни ПрПСц образац у СЛМ. (Ц) Повећано бојење Иба1 код оваца заражених сцрапие у односу на контролне овце.

Увећане слике показују неке од уочених морфолошких разлика. (Д) Знаци умерене реактивне астроглиозе код оваца инфицираних сцрапие у поређењу са контролама. Резултати се крећу од 0 (негативно) до 5 (максимални интензитет).

Значајне разлике су утврђене коришћењем Студентовог т-теста или Манн–Вхитнеи У теста за нормално и ненормално распоређене податке, респективно. * п < 0.05, ** п < 0,01. Скала бар=200 µм.

Спонгиоза у хипокампусу је била веома блага, а повремене вакуоле су примећене у ЦА1, ЦА3 и ЦА4 и СЛМ (Слика 3А). Овај ограничени губитак неурона био је у супротности са ретким, али жаришно интензивним таложењем ПрПСц у ЦА1 и ЦА3 (слика 3Б).

Веома благо ПрПСц бојење је примећено у ЦА4 и СЛМ. У овим областима мозга примећени су различити обрасци ПрПСц (Слика С2). Док су интранеуронски и ПрПСц обрасци повезани са неуропилом преовлађивали у ЦА1 и ЦА3, интраглијална депозиција је била главни морфолошки образац примећен у СЛМ.

Благи интранеуронски и ПрПСц обрасци повезани са неуропилом доследно су примећени у ЦА4, иако је интензитет био нижи од оног уоченог у ЦА1 и ЦА3. Иба1 је био конститутивно изражен и ретко распоређен у контролним узорцима. Уз контраст, изражена микроглиоза је примећена код ЦА1, ЦА3 и ЦА4 и СЛМ код оваца инфицираних сцрапие.

Међутим, микроглијалне морфолошке карактеристике су се значајно разликовале између ових региона мозга. У пирамидалном слоју ЦА1, већина микроглијалних ћелија показала је кратке процесе са увећаним ћелијским телима, карактеристичним за хипертрофичну морфологију.

У ЦА4, микроглијалне ћелије су такође биле хипертрофичне, али су показивале дуже и тање гране од ЦА1 микроглијалних ћелија. У међувремену, хипертрофична микроглија у СЛМ-у показала је кратке и танке процесе са набреклим ћелијским телима. Насупрот томе, у ЦА3, приметили смо горе поменуту морфологију штапића-микроглије [42].

Ове микроглијалне ћелије су имале издужено ћелијско тело, са дугим паралелним примарним процесом оријентисаним окомито на слој пирамидалних ћелија ЦА3, и помоћним гранама које су биле краће од дугих примарних процеса.

ГФАП имунобојење је значајно повећано у слојевима пирамидалних ћелија ЦА1 и ЦА3 код оваца инфицираних сцрапие у односу на контролну овцу. Занимљиво је да су ПрПСц резултати били највиши у ЦА1 и ЦА3. Нису примећене разлике у ЦА4 пирамидалном ћелијском слоју или СЛМ.

2.3. Неуропатологија мишева инфицираних сцрапие тг338

Исти неуропатолошки маркери спонгиозе, таложења ПрПСц, микроглиозе и астроглиозе анализирани код оваца испитивани су у таламусу клинички погођених тг338 мишева који су интрацеребрално инфицирани сцрапие (Слика 4).

У поређењу са контролама, уочене су значајне разлике (п < 0.05) у спонгиози код таламуса мишева инфицираних сцрапие-ом, код којих су вакуоле биле ограничене на неуропил.

ПрПСц депозити су били широко распрострањени на нивоу цитоплазме и неуропила. Процена глиозе је открила значајне разлике у имунобојању Иба1 и ГФАП између мишева инфицираних сцрапие и контролних мишева, при чему су и астроцити и микроглија показали хипертрофичне морфологије.

Акумулацију ПрПрес-а је такође проценио ВБ код свих мишева инфицираних сцрапие-ом, откривајући константан образац траке од 19 кДа (Слика 5). Интензитет ПрПрес сигнала код тг338 мишева био је хомогенији међу појединцима него код оваца, као што се очекивало за експерименталну инфекцију у којој су контролисани доза, старост инокулације и време жртвовања.

Код контролних мишева инокулисаних нормалним хомогенатом мозга није детектован сигнал, што се не слаже са негативним резултатима ИХЦ.

Слика 4. Секције таламуса код контролних мишева инфицираних сцрапие-ом (интрацеребрална инокулација) и контролних мишева усклађених са узрастом тг338 који су имуно обојени да би се проценила спонгиоза (хематоксилин-еозин), таложење ПрПСц (Р486 антитело), ​​астроцити (глијални фибриларни кисели протеин; ГФАП), и ГФАП. -везујући адаптерски молекул-1; (А, Е) Тешке спонгиформне лезије лоциране углавном у неуропилу код мишева инфицираних сцрапие у односу на контролне мишеве. (Б, Ф) Неколико ПрПСц-позитивних неурона је евидентно код мишева инфицираних сцрапие, али их нема у контролама. (Ц, Г) Активирана микроглија која показује интензивније имунолошко бојење и густе процесе код мишева инфицираних сцрапие у односу на контроле. (Д, Х) Повећана астроглиоза са хипертрофичним ћелијским телима и процесима код мишева инфицираних сцрапие у односу на контроле. Резултати се крећу од 0(негативно) до 5 (максимални интензитет).

Значајне разлике су утврђене коришћењем Студентовог т-тестора Манн–Вхитнеи У теста за нормално и ненормално распоређене податке, респективно. * п < 0.05,** п < 0,01. Скала бар=200 µм.

Слика 5. Вестерн блот детекција акумулације ПрПрес у ЦНС клинички погођених тг338 мишева интрацеребрално инокулисаних сцрапие у поређењу са одговарајућим контролама.

Еквивалентне количине протеина су напуњене за адекватно поређење и имуноблотови су рађени коришћењем СХА31 моноклоналног антитела. Маркери молекулске тежине (кДа) су назначени на левој страни имуноблота.

Повећана регулација експресије ТЛР као одговор на Прпсц је раније пријављена у експерименталним ин виво и ин витро условима, стога смо, након карактеризације присуства главних неуропатолошких промена изазваних прионом у ЦНС-у у контексту природне и експерименталне болести, истражили да ли су ове промене у корелацији са променама у експресији ТЛР гена.

У ту сврху, извршили смо кПЦР користећи узорке из четири региона мозга оваца да проценимо експресију МиД8г и Триф, два главна адаптерска протеина укључена у ТЛР сигнализацију; ЦД36, рецептор за чишћење који сарађује са ТЛР; и ТЛР мРНА.

Поред тога, измерили смо нивое четири про- и анти-. инфламаторних цитокина у таламусу и хипокампусу оваца ради даље процене инфламаторног одговора. Код тг338 мишева измерили смо нивое мРНК МиД88 и ТЛР1-9 у таламусу.

Гени за које су уочене значајне разлике у погледу контрола, и одговарајуће промене набора, приказани су у табели $л, а вредности АЦт из контролне овце и овце заражене сцрапие-ом су представљене на слици $3.

Број измењених гена се смањио у каудално-ростралном правцу. Облонгата медулла код оваца инфицираних сцрапие је била област у којој су уочене највеће промене у експресији ТЛР гена (Слика 6). У овом региону, експресија ТЛР2, 3, 4, 6,7, 8, 9 и ЦД36 је била значајно већа (п < 0.01) код животиња заражених скрапијем у односу на контролне животиње.
У таламусу, ТЛР6, МиД88 и ЦД36 су били значајно повећани у групи инфицираној сцрапие (п < 0.0 5), док су ТЛР2 и ТЛР3 показали тенденцију ка повећању регулације (п < {{12} }.1). У фронталном кортексу (највише рострално подручје), ТЛР4 и ЦД36 су били једини прекомерно експримирани гени (п < 0,05).

Изванредно, контрастни обрасци експресије су пронађени у хипокампусу оваца заражених грејбом, код којих су ТЛР2 и МиД88 били смањени (п < 0.01) и ТЛР1 је показао тенденцију ка смањењу (п < 0,1) .

Поред тога, хипокампус је био једино подручје у којем експресија ЦД36 није повећана. Све у свему, ТЛР4 је био ген који је био највише регулисан код оваца инфицираних сцрапие у односу на контролне овце у сва четири региона мозга, иако нису примећене значајне разлике у таламусу или хипокампусу због интра-индивидуалне варијабилности.

Анализа нивоа цитокина је открила прекомерну експресију ТГФ-, ИЛ-10 и ИЛ-6 у таламусу код овце инфициране сцрапие у односу на контролне овце, али није било промена у хипокампусу (Слика 7).

Слика 6. Експресија гена ТЛР 1-10, МиД88, Триф и ЦД36 у продуженој мождини (А), таламусу (Б), фронталном кортексу (Ц) и хипокампусу (Д) контролних оваца и оваца заражених сцрапие .

Подаци су представљени као средњи број ± СЕМ повећање у вези са контролним овцама (изражено као резултат од 1). Средњи резултати су упоређени коришћењем Студентовог т-теста или Манн–Вхитнеи У теста за нормално и ненормално распоређене податке, респективно. # п < 0.1, * п < 0.05, ** п < 0,01.

Слика 7. Експресија гена антиинфламаторних цитокина ТГФ- и ИЛ-10, и проинфламаторних цитокина ТНФ- и ИЛ-6, у таламусу (А) и хипокампусу (Б) контролног и природног сцрапиа -заражене овце.

Подаци су представљени као средња вредност ± СЕМ путања промена у вези са контролама (изражена као резултат 1). Средњи резултати су упоређени коришћењем Студентовог т-теста или Манн–Вхитнеи У теста за нормално и ненормално распоређене податке, респективно. * п < 0.

Да би се испитало да ли су промене у експресији ТЛР-а у ЦНС-у у природној болести упоредиве са онима изазваним у моделу миша тг338 након интрацеребралне инфекције са скрапијем, процењени су нивои транскрипције ТЛР-а и МиД88 у таламусу мишева офтг338 (Слика 8). Нивои мРНА ТЛР1 и ТЛР2 су значајно повећани (п < 0.01) у поређењу са контролама, а постојала је и тенденција ка повећању регулације ТЛР7 (п< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

Слика 8. Експресија гена ТЛР1-7, ТЛР9 и МиД88 у таламусу клинички погођених тг338 мишева интрацеребрално инокулисаних инокулумом позитивним на сцрапие у односу на контроле (сцрапие-негативеиноцулум). Резултати су изражени као средња вредност ± СЕМ путања промена у вези са контролама (изражена као резултат 1). Средњи резултати су упоређени коришћењем Студентовог т-теста или Манн–Вхитнеи У теста за нормално и ненормално распоређене податке, респективно. # п < {{10}}.1, ** п < 0,01.

2.5. Процена нивоа ТЛР4 протеина потврђује повећање регулације откривено кПЦР-ом код оваца заражених сцрапие-ом

Да би се потврдило да се уочено повећање мРНК ТЛР4 преводи у промене у нивоу протеина, ТЛР4 је процењен од стране ВБ у продуженој мождини, таламусу, хипокампусу и фронталном кортексу четири овце заражене сцрапие и четири контролне овце (Слика 9).

У складу са резултатима кПЦР-а, нивои протеина ТЛР4 су значајно повећани (п < 0.05) у сва четири региона мозга оваца заражених сцрапие-ом.

Слика 9. Експресија ТЛР4 протеина у продуженој мождини (Мо), таламусу (Тх), хипокампусу (Хц) и фронталном кортексу (Фц) оваца инфицираних сцрапие у односу на контролне овце (н=4 по групи). -актин је коришћен као контрола оптерећења.

Графикон приказује вредности дензитометрије и указује на значајно повећање експресије ТЛР4 у свим регионима код оваца инфицираних сцрапие у односу на контролне овце. Подаци су изражени као средња вредност ± СЕМ. Средњи резултати су упоређени коришћењем Студентовог т-теста. * п < 0.05.

3. Дискусија

Последњих година, проучавање неуроинфламаторног одговора код прионских болести довело је до бољег разумевања основних механизама и последица.

Неуроинфламација укључује реактивну микроглиозу и астроглиозу [43], од којих се обе могу открити пре појаве клиничких знакова и претходе спонгиози и губитку неурона [7,8,18].

Остаје питање да ли је микроглијална активација код прионских болести корисна или штетна. Неки аутори тврде да микроглијална активација и пролиферација доприносе неуроинфламаторном процесу и последичној неуродегенерацији [8,18,44].

Међутим, други указују на укупну заштитну улогу микроглије, а ин витро студије показују да микроглија може интернализовати и деградирати ПрПСц [27,45]. У складу са овим налазима, ин виво експерименти су показали да деплеција микроглија смањује период преживљавања, вероватно због смањеног клиренса ПрПСц [46,47].

Стога је вероватно да током процеса болести постоји више реактивних микроглијалних фенотипова, који имају неуропротективни ефекат у раним стадијумима болести и, како болест напредује, уступају место проинфламаторном фенотипу који изазива штетне ефекте [9,10]. Једна хипотеза предлаже да ТЛР сигнализација посредује активацију глијалних ћелија код прионских болести.

Познато је да се узимање амилоидних влакана микроглије код Алцхајмерове болести подстиче активацијом ТЛР [48,49]. Дакле, док активација ТЛР-а на глијалним ћелијама може да игра улогу у уклањању агрегираних или абнормалних протеина (нпр. прионски протеин), хронична активација може бити штетна за домаћина, што доводи до неуротоксичности и смрти неуронских ћелија [50].

До данас су подаци о улози ТЛР-а у прионпатогенези веома ограничени. Неколико студија је мерило промене у експресији ТЛР у ЦНС-у на мишјим моделима, а једна је пријавила промене у експресији ТЛР у крви јагњади, при чему су у свим случајевима коришћене животиње експериментално инфициране прионском болешћу [22,26,30].

For more information:1950477648nn@gmail.com