Различити антивирусни системи квасца спречавају смртоносну патогенезу узроковану ЛА миковирусом

Недавне студије показују да су антивирусни системи изузетно очувани од бактерија до сисара, показујући да се јединствени увид у ове системе може стећи проучавањем микробних организама. Међутим, за разлику од бактерија, где инфекција фагом може бити смртоносна, није позната никаква цитотоксична вирусна последица код квасца који пупа Саццхаромицес церевисиае иако је хронично заражен дволанчаним РНК миковирусом који се зове ЛА. Ово остаје случај упркос претходној идентификацији конзервираних антивирусних система који ограничавају репликацију ЛА. Овде показујемо да ови системи сарађују како би спречили бујну репликацију ЛА, што узрокује смртност у ћелијама које се узгајају на високим температурама. Користећи ово откриће, користимо екран прекомерне експресије да идентификујемо антивирусне функције за хомологе квасца протеина који се везује за полиА (ПАБПЦ1) и протеина Ларп1 који садржи Ла-домен, који су оба укључена у вирусни урођени имунитет код људи. Користећи приступ комплементарног губитка функције, идентификујемо нове антивирусне функције за конзервиране РНК егзонуклеазе РЕКС2 и МИГ1; регулаторни комплекси хроматина САГА и ПАФ1; и ХСФ1, главни регулатор транскрипције одговора на протеостатски стрес. Кроз истраживање ових антивирусних система, показали смо да је патогенеза ЛА повезана са активираним протеостатским одговором на стрес и акумулацијом цитотоксичних протеинских агрегата. Ови налази идентификују протеотоксични стрес као основни узрок патогенезе ЛА и даље унапређују квасац као моћан модел система за откривање и карактеризацију очуваних антивирусних система.

Сви лабораторијски сојеви и већина изолата квасца С. церевисиае у животној средини заражени су дволанчаним РНК (дсРНА) вирусом који се зове ЛА (1, 2). ЛА припада широко распрострањеној породици ендогених дсРНА вируса Тотивиридае. Као и сви вируси ове породице, геном ЛА дсРНА је упакован у вирион који га штити од варења посредованог домаћином. Рупе у вириону дозвољавају екструзију РНК транскрипата у цитосол који кодира капсидни протеин, Гаг, који чини већину честице. ЛА транскрипт такође кодира Гаг-пол фузиони протеин, произведен на много нижим нивоима од Гаг протеина, који поседује активност РНК-зависне РНК полимеразе. Сваки вирион садржи Гаг-пол протеин, који је одговоран за ЛА репликацију и транскрипцију унутар честице. Инкапсулација вирусних транскрипата унутар честица у настајању и синтеза негативног ланца РНК помоћу Гаг-пола да би се формирао дсРНА геном завршава циклус репликације ЛА (2). Да би произвео ове протеине, ЛА користи карактеристике типичне за РНК вирусе пронађене код људи, укључујући механизам „хватања капе“ који даје ЛА транскрипте са 5′-метил капом и рибозомални механизам померања оквира за производњу Гаг и Гаг-пол фузионих протеина из један препис (3, 4).

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Недавне студије бактеријских антивирусних система показале су да они деле изузетну еволуциону конзервацију са људима, откривајући потенцијал микробних организама да пруже нови увид у вирусни урођени имунитет (5–11). Заиста, ране студије које су укључивале ЛА довеле су до открића два антивирусна система за које се касније показало да доприносе урођеном имунитету против различитих РНК вируса код сисара (12–17). Први од ових антивирусних система укључује гене СКИ2, 3 и 8, који кодирају подјединице конзервираног комплекса повезаног са рибозомима који се супротставља превођењу транскрипата који немају поли(А) репове попут оних које кодира ЛА (18–23). Одвојени пут слабљења ЛА се јавља преко Ксрн1 (такође познат као СКИ1), 5′-3′ егзорибонуклеазе која разграђује неограничене мРНК (24–26).

Недавно смо открили да митохондријска ДНК/РНА ендонуклеаза Нуц1 потискује акумулацију ЛА у спорулирајућим ћелијама, што представља нови антивирусни пут квасца (27). Нуц1 је хомолог ендонуклеазе Г (ЕндоГ) који се налази у свим еукариотима и многим прокариотима и најпознатији је по својој улози у промовисању фрагментације генома током програмиране ћелијске смрти сисара, истакнутог механизма последњег решења вирусне одбране (28, 29). Интригантно, програмирана ћелијска смрт је својствена спорулацији квасца, а Нуц1 фрагментира ДНК од умирућих мејотских производа током овог процеса, поред своје улоге у смањењу нивоа вируса ЛА који су наслеђени преживелим спорама (27, 30, 31).

Упркос свеприсутном присуству ЛА у лабораторијским сојевима, није било последица које му се приписују фитнесу и стога се ЛА углавном сматра безопасним комензалом. Овде показујемо да је инфекција ЛА у ствари смртоносна за квасац и да мора бити активно ослабљена кроз вирусни урођени имунитет да би се очувала одрживост. Конкретно, код сојева који немају паралелно делујући НУЦ1 и СКИ антивирусни путеви, број копија ЛА је значајно повећан, што доводи до смртности на високим температурама.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Закључили смо да би даља карактеризација ЛА и фактора који одржавају његову репликацију на ниском нивоу могла открити нове антивирусне системе. Идентификовање услова који доводе до патогенезе ЛА омогућило нам је да користимо биоинформатичке и напредне приступе генетском скринингу за откривање нових антивирусних гена. Користећи скрин за прекомерно експримиране гене који потискују условну смртност нуц1∆ ски3∆, идентификујемо антивирусне функције за хомологе квасца поли(А)-везујућег протеина (ПАБПЦ1) и протеина Ларп1 који садржи Ла-домен, који су обоје укључени у урођени вирус имунитет код људи (32, 33). Штавише, генетске студије губитка функције идентификовале су дванаест нових антивирусних гена. Међу њима су високо конзервирани САГА транскрипциони коактиваторски комплекс и неколико РНА егзонуклеаза, укључујући РЕКС2 и МИГ1, од којих обе имају различите, али лоше карактерисане хумане и бактеријске хомологе (34–37).

Коначно, карактеришемо патогенезу ЛА користећи ћелијске биолошке методе и откривамо да високо вирусно оптерећење изазива протеостатски стрес. Пошто је добро познато да висока температура погоршава протеостатски стрес, ова запажања сугеришу да је катастрофални протеостатски стрес узрок смртности изазване ЛА. У складу са овом хипотезом, показујемо да нуц1∆ ски3∆ мутанти показују осетљивост зависну од ЛА на азетидин-2-карбоксилну киселину (АЗЦ), аналог пролина за који је познато да изазива ортостатски стрес (38). Даље, демонстрирамо антивирусну функцију за ХСФ1, конзервирани фактор транскрипције који осећа и усмерава одговор на ортостатски стрес. Занимљиво је да хумани Хсф1 такође игра важну улогу у репликацији и/или патогености различитих вируса укључујући ХИВ, САРС-Цов-2 и вирус денга грознице, иако су механизми нејасни (39). Ова открића пружају нове примере очувања урођеног имунитета од микроба до људи и додатног осветљења квасца као моћног модела система за откривање нових антивирусних система.

Резултати

НУЦ1, СКИ и КСРН1 антивирусни системи квасца сарађују како би спречили ЛА патогенезу.

Наше претходне студије НУЦ1 биле су фокусиране на мејотичке ћелије (27). Да бисмо истражили антивирусну функцију НУЦ1 у вегетативно растућем квасцу, испитали смо број копија ЛА у митотичким хаплоидним ћелијама у референтној позадини соја БИ4742. Приметили смо нивое ЛА дсРНА користећи етидијум бромид бојење електрофорезе РНК и открили да двоструки мутант нуц1∆ ски3∆ показује велико повећање ЛА дсРНА (слика 1А). Ове налазе смо потврдили коришћењем имунофлуоресцентне микроскопије са антителом на дсРНА које се користи за откривање реплицирајућих РНК вируса (40, 41). Ове слике су показале да се ЛА дсРНА акумулира у жариштима, што подсећа на места репликације вируса „фабрика вируса“ уочена у људским ћелијама (слика 1Б и СИ додатак, слика С1) (42). У складу са претходним налазима код других сојева (24, 27, 43), вестерн блоттинг је показао да су нивои Гаг протеина повишени у нуц1∆ и ски3∆ мутантима (слика 1Ц). Штавише, показали смо да је двоструки мутант нуц1∆ ски3∆ акумулирао масивно повишене нивое Гаг (слика 1Ц). Ови подаци показују да НУЦ1 и СКИ3 учествују у одвојеним антивирусним путевима и да губитак оба пута доводи до значајног повећања ЛА вирусног оптерећења.

Да бисмо утврдили да ли високо ЛА вирусно оптерећење утиче на кондицију ћелија, испитали смо раст квасца користећи тестове раста на месту. Суптилни дефекти раста појединачних мутаната нуц1∆ и ски3∆ примећени су на 37 степени када су ћелије узгајане са глицеролом, а не са глукозом као извором угљеника, услов под којим се квасац ослања на митохондријално дисање (слика 1Д). Изванредно, иако су дупли мутанти нуц1∆ ски3∆ нормално расли на 30 степена, показали су условну смртност на 37 степени без обзира на извор угљеника (слика 1Д). Као што се очекивало, виталност на високој температури је враћена нуц1∆ ски3∆ двоструком мутанту помоћу плазмида који експресује НУЦ1- који је изазвао одговарајуће смањење нивоа Гаг (Слике 1 Ц и Д). Да бисмо потврдили да је дефект раста двоструког мутанта нуц1∆ ски3∆ изазван ЛА, конструисали смо изогени сој излечен од ЛА (ЛА0) и испитали његов раст на високим температурама. Открили смо да је дефект раста потпуно ублажен, што имплицира да је условна смртност резултат неограничене репликације ЛА (слика 1Д). Да бисмо проценили ефекте великог броја копија ЛА на способност ћелија у оптималним условима раста, измерили смо стопе пролиферације у течној култури. Ове студије су откриле смањену стопу раста код двоструких мутаната нуц1∆ ски3∆ у поређењу са дивљим типом на 30 степени који је био обрнут у Л-А0 сојевима, показујући да је високо оптерећење ЛА штетно за кондицију чак и у ћелијама без стреса (СИ додатак, сл. С2).

цистанцхе биљке које повећавају имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

Да бисмо даље окарактерисали како НУЦ1 интерагује са познатим антивирусним путевима, тестирали смо његову везу са КСРН1. Открили смо да је двоструки мутант нуц1∆ крн1∆ акумулирао знатно повишене нивое Гаг у поређењу са једним мутантом и показао условну смртност зависну од ЛА на високој температури (СИ додатак, слике С3 А и Б), што сугерише да НУЦ1 и КСРН1 делују у паралелни путеви за слабљење ЛА. Одражавајући њихове кључне нередундантне улоге у регулацији масовне мРНА, двоструки мутант крн1∆ ски3∆ је неизводљив, чак и код сојева којима недостаје ЛА (44). Да бисмо утврдили да ли КСРН1 представља антивирусни систем независан и од НУЦ1 и од СКИ3, користили смо плазмид са великом количином копије за прекомерну експресију КСРН1 у двоструком мутанту нуц1∆ ски3∆. Заиста, приметили смо значајно смањење нивоа Гаг и супресију условне леталности нуц1∆ ски3∆ коришћењем прекомерне експресије КСРН1 вођене плазмидом (Слике 1 Ц и Д). Закључујемо да се Нуц1, Ски3 и Ксрн1 конвергентно супротстављају репликацији ЛА и да је масовно повећано ЛА вирусно оптерећење у нуц1∆ ски3∆ или нуц1∆ крн1∆ мутантима изазвало смртоносну патогенезу на високим температурама (слика 1Е).

Генетски екран заснован на биоинформатици идентификује нове антивирусне факторе.

ЛА-зависна условна смртност двоструких мутаната нуц1∆ ски3∆ подигла је могућност да се други антивирусни фактори могу идентификовати кроз комбинаторне студије мутаната. Да бисмо идентификовали нове кандидате за антивирусне факторе, претражили смо курирану базу података генетских интеракција за делеције гена које су изазвале синтетички дефект раста када се комбинују са нуц1∆ у најмање две студије скрининга високе пропусности (45). Поред очекиваног присуства КСРН1 и СКИ делеција у овом скупу података, пронашли смо шеснаест додатних гена. Користили смо генетско укрштање да бисмо направили троструке мутанте комбинујући делеције сваког од ових шеснаест гена са нуц1∆ ски3∆ и потврдили шест који су изазвали озбиљне дефекте у расту (Табела 1). Утврдили смо да су синтетички фенотипови раста изазвани сваким од ових гена обрнути у ЛА0 сојевима, што сугерише да они кодирају антивирусне протеине (Табела 1). У наставку описујемо потврду неколико ових поготка на екрану као нове антивирусне факторе.

Један ген идентификован на нашем екрану, РЕКС2, кодира 3′-5′ РНК егзонуклеазу сачувану од бактерија до људи (35). И Рек2 и његов хумани хомолог РЕКСО2 локализовани су у митохондријама и садрже ЕКСОИИИ домен који се широко налази у прокариотским и еукариотским протеинима, укључујући интерфероном стимулисани антивирусни протеин ИСГ20 (36, 37, 46–48). Открили смо да је сој двоструког мутанта рек2∆ нуц1∆ акумулирао знатно повећане нивое Гаг у поређењу са једним мутантом и показао дефекте раста зависне од ЛА, укључујући смртност на високој температури (сл. 2 А и Б, и СИ додатак, сл. С2). Рек2∆ сингле-мутант сој је показао благи пораст нивоа Гаг, иако је овај ефекат био маргиналан (слика 2Б). Да бисмо ригорозно испитали последице рек2∆ за број копија ЛА, квантификовали смо ЛА РНК користећи РТ-кПЦР. Ова мерења су потврдила да сојеви рек2∆ нуц1∆ акумулирају значајно повећане нивое ЛА, иако су такође открила да рек2∆ појединачни мутант није акумулирао повећану ЛА РНК (слика 2Ц). Ови налази сугеришу да је антивирусна улога Рек2 очигледна само у одсуству функције НУЦ1. Занимљиво је да су троструки мутанти нуц1∆ ски3∆ рек2∆ и нуц1∆ крн1∆ рек2∆ били неодрживи у свим условима раста, а ови дефекти су поништени код Л-А0 сојева (слика 2Д). Ови налази показују озбиљан патогени потенцијал ЛА миковируса и идентификују нову антивирусну улогу за високо очувану митохондријално локализовану РНК егзонуклеазу.

Слика 1. Слабљење ЛА штити квасац од смртоносне патогенезе. (А) Приказан је гел укупне РНК, обојен етидијум бромидом, припремљен од наведених сојева, са 4,6 кб ЛА дсРНА траком означеном стрелицом. (Б) Имунофлуоресценција је коришћена за визуелизацију ЛА дсРНА (наранџаста) у ћелијама назначених генотипова. Ови сојеви су излечени од слабо заступљеног Л-БЦ дсРНА вируса да би се елиминисало позадинско бојење (Детаљи о методи). ДАПИ бојење ДНК је плаво. (Трака скале, 1 μм.) (Ц) Приказан је Вестерн блотинг нивоа протеина ЛА Гаг и 3-фосфоглицерат киназе (Пгк1) у назначеним сојевима. Маркери молекуларне тежине су назначени на десној страни. (Д) Спот тест тестови раста сојева из 1Ц су приказани. Сојеви су примећени на -Леу медијумима који садрже или глукозу или глицерол и узгајани су на назначеним температурама. (Е) Митохондријски протеин Нуц1 сарађује са цитосолним протеинима Ксрн1 и СкиЦ како би регулисао ниво протеина ЛА и осигурао кондицију ћелија.

Други ген идентификован на нашем екрану био је МИГ1, хомолог квасца гена 1 за пролиферацију хуманог меланоцита, 3′-5′ РНК егзонуклеазе која има хомологе у свим таксонима (34). Мутантни сојеви који комбинују миг1∆ и нуц1∆ показали су велика повећања Гаг протеина и ЛА РНК у поређењу са појединачним мутантима и показали озбиљне дефекте раста зависне од ЛА на високој температури и у течној култури (Слика 2Ц и СИ Додатак, Слике С2, С4 А и Ц). Као и код рек2∆, миг1∆ појединачни мутантни сој је показао мало повећање нивоа Гаг и није било промене у ЛА РНК (слика 2Ц и СИ додатак, слика С4Ц). Успели смо да повратимо нуц1∆ ски3∆ миг1∆ троструке мутанте, иако су они изузетно споро расли на 30 степена и акумулирали су још више нивое Гаг (СИ додатак, сл. С4 А и Ц). Ови дефекти раста су такође поништени код Л-А0 сојева (СИ додатак, слика С4А). МИГ1 стога представља нови антивирусни фактор, који делује паралелно и са НУЦ1 и са СКИ комплексом.

Табела 1. Идентификација нових кандидата за антивирусне факторе коришћењем биоинформатичког приступа

Мутације које доводе до прекомерне експресије хуманог МИГ1 повезане су са аутоимуним поремећајем витилигом, што сугерише да МИГ1 може играти одређену улогу у људском урођеном имунитету (49, 50). Истражили смо ову могућност користећи плазмид који експримира хумани МИГ1 под контролом конститутивног промотера квасца (34) и открили да је људски МИГ1 спасио условни дефект раста нуц1∆ миг1∆ мутанта (СИ Додатак, слика С4Д). Ови налази показују да антивирусну функцију квасца МИГ1 може постићи људски МИГ1, што сугерише потенцијалну антивирусну функцију за МИГ1 код људи.

Слика 2. Нови антивирусни фактори су идентификовани коришћењем патогенезе ЛА. (А) Приказана је тачкаста анализа сојева дефектних у НУЦ1 и РЕКС2. Сојеви су примећени на СЦ медијумима који садрже или глукозу или глицерол и узгајани на назначеној температури. (Б) Вестерн блотинг нивоа протеина ЛА Гаг и Пгк1 сојева на слици 2А. Маркери молекуларне тежине су назначени на десној страни. (Ц) ЛА РНК је квантификована кПЦР-ом и нормализована на ендогену АЦТ1 РНК. Приказани су средњи ниво РНК и СД. н=5. *П < {{10}}.05, **П < 0.01, ***П < 0,001 (неспарени Студентов т тест). (Д) Приказана је тачкаста анализа сојева дефектних у три паралелна антивирусна пута који садрже плазмид који експресује НУЦ1. Сојеви су примећени на -УРА медијуму или синтетичкој комплетној (СЦ) подлози са додатком 0,1% 5-флуорооротске киселине (5-ФОА).

Друга категорија гена идентификована коришћењем нашег биоинформатичког екрана била је експресија гена. ЦДЦ73 и СПТ3 кодирају подјединице конзервираних комплекса повезаних са хроматином ПАФ1 и САГА, респективно. И цдц73∆ и спт3∆ изазвали су смртност зависну од ЛА када су комбиновани са нуц1∆ ски3∆ (Табела 1). Пошто се показало да САГА (СптАда-Гцн5-ацетилтрансфераза) појачава експресију антивирусних гена у гљивици кестенове гљивице Црипхонецтриа параситица, ми смо даље истраживали овај комплекс (51). Двоструко мутантни сој спт3∆ нуц1∆ акумулирао је повећане нивое Гаг-а и показао смртност зависну од ЛА на високим температурама (СИ додатак, сл. С4 Б и Ц). САГА је велики протеински комплекс и потврдили смо да су делеције у неколико других гена који кодирају САГА подјединице имале исте фенотипске последице као спт3∆ (СИ Додатак, Табела С1 и С4Ц). Заједно са налазима Ц. параситица, ови резултати сугеришу да САГА комплекс контролише експресију антивирусних гена у различитим врстама гљивица.

Скрининг супресије високе копије идентификује антивирусне факторе квасца који су такође антивирусни код људи.

Пошто је прекомерна експресија КСРН1 потиснула дефекте раста соја нуц1∆ ски3∆, претпоставили смо да би прекомерна експресија других антивирусних фактора произвела сличан ефекат, који би се могао користити као екран за идентификацију нових антивирусних система. Користили смо екран за супресију плазмида са великом количином копија да бисмо открили гене чија је прекомерна експресија ублажила условну смртност соја нуц1Δ ски3Δ (Детаљи о методи). Користећи овај екран, идентификовали смо СРО9, СЛФ1 и ПАБ1 као супресоре велике копије нуц1∆ ски3∆, од којих сви кодирају протеине који се везују за РНК повезане са рибозомима (слика 3А) (52, 53). Сро9 и Слф1 су паралогни протеини који садрже домен лупуса аутоантигена (Ла), који се широко налазе у еукариотима. Значајно је да је њихов хумани хомолог, Ларп1, недавно идентификован у прегледима за протеине везане за САРС-Цов-2 плус ланац ссРНА или нуклеокапсид (32, 54). Ларп1 је био главни фокус у једној од ових студија и показало се да ублажава репликацију САРС-Цов-2 у људским ћелијама, иако његов механизам није познат (32). ПАБ1 кодира високо конзервирани ПолиА-везујући протеин, који је уобичајена мета вирусне инхибиције код људи кроз различите механизме (33). Открили смо да је прекомерна експресија ПАБ1 или СРО9 значајно смањила нивое Гаг у нуц1∆ ски3∆ мутанту, објашњавајући њихове фенотипове спасавања (слика 3Б). Занимљиво, иако је прекомерна експресија СЛФ1 спасила дефект раста нуц1∆ ски3∆ једнако добро као и СРО9, то није довело до било каквог смањења нивоа Гаг (Слике 3 А и Б). Ови налази сугеришу да ПАБ1 и СРО9 спасавају ћелије сузбијањем репликације ЛА и да СЛФ1 штити ћелије од патогених последица повишене вирусне репликације.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Велики број копија ЛА доводи до цитотоксичног протеостатског стреса.

Да бисмо стекли увид у дивергентне механизме Сро9 и Слф1 антивирусних активности, размотрили смо које би могле бити физиолошке последице патогенезе ЛА и како би СРО9 / СЛФ1 могао различито утицати на њих. Приметили смо претходну студију у којој су делеције гена НУЦ1 или СКИ-комплекса довеле до слабе индукције ГФП репортер гена контролисаног Хсф1 (55), очуваног транскрипционог фактора који осећа протеостатски стрес и активира одговор на експресију гена (56–58 ). Користећи проточну цитометрију са овим репортером (ХСЕ-ГФП), потврдили смо ове резултате и утврдили да је двоструки мутант нуц1∆ ски3∆ изазвао синергистичку и ЛА зависну активацију ХСЕ-ГФП (слика 3Ц и СИ додатак, слика С5). Претпоставили смо да је масивна производња Гаг примећена у нуц1∆ ски3∆ мутантима објаснила овај протеостатски одговор на стрес. У прилог томе, ХСЕ-ГФП активација двоструког мутанта нуц1∆ ски3∆ је поништена прекомерном експресијом ПАБ1 или СРО9, одражавајући последице ових гена на акумулацију Гаг (Слике 3 Б и Ц). Приметно, прекомерна експресија СРО9 паралога СЛФ1 није спречила активацију ХСЕ-ГФП. Еволуциона дивергенција паралогних гена СРО9 и СЛФ1 је тако резултирала различитим антивирусним механизмима, при чему СРО9 потискује акумулацију вирусних протеина и повезани протеостатски стрес, а СЛФ1 наизглед штити ћелије од токсичних последица вирусом изазваног протеостатског стреса.

Слика 3. Прекомерна експресија фактора контроле транслације ублажава патогенезу ЛА. (А) Приказани су тестови раста на лицу места за супресоре високе копије СРО9, СЛФ1 и ПАБ1. Сојеви су примећени на –ЛЕУ медијумима који садрже или глукозу или глицерол и узгајани су на назначеним температурама. (Б) Вестерн блоттинг за нивое протеина ЛА Гаг, Пгк1, Сро9 и Слф1 у сојевима из 3А. Маркери молекуларне тежине су назначени на десној страни. (Ц) Проточна цитометрија је коришћена за мерење експресије ХСЕ ГФП у назначеним сојевима (н {{10}}). Први и трећи квартил су означени сивим оквирима. Средњи интензитет ГФП-а је означен црним тракама унутар. *П < 0.05, **П < 0,01, ***П < 0,001 (неспарени Студентов т тест). (Д) Флуоресцентна микроскопија Хсп104-ГФП у назначеним сојевима. Ћелије су обојене са ДАПИ да би се визуелизовала језгра. (Трака скале, 1 μм.) Проценат ћелија са 3+ ГФП фокусима је приказан на десној страни. н=3. 75 до 140 ћелија је избројано за сваку реплику.

Протеостатски стрес је често повезан са акумулацијом цитотоксичних протеинских агрегата који се могу визуелизовати коришћењем ГФП фузионисаног са протеинском дезагрегазом Хсп104, директном метом активације транскрипције Хсф1 за коју се зна да се ко-локализује са протеинским агрегатима (59, 60). Да бисмо даље истражили протеостатске дефекте повезане са патогенезом ЛА, користили смо флуоресцентну микроскопију да бисмо визуелизовали Хсп104-ГФП жаришта у различитим сојевима. Као што се очекивало, ћелије дивљег типа узгајане на 30 степени ретко су акумулирале уочљиве Хсп104-ГФП жаришта. Док су појединачни мутанти нуц1∆ и ски3∆ личили на дивљи тип, запањујуће је да је двоструки мутант нуц1∆ ски3∆ показао више од 25% ћелија са три или више Хсп104-ГФП жаришта (слика 3Д). Као и код свих других фенотипова које смо приметили за нуц1∆ ски3∆, акумулација Хсп104-ГФП жаришта је зависила од присуства ЛА (слика 3Д). Ови налази показују да је високо вирусно оптерећење узроковано делецијом НУЦ1 и СКИ3 довело до акумулације Хсп104-ГФП жаришта што указује на агрегацију цитотоксичних протеина.

Пошто је патогенеза ЛА била у корелацији са протеостатским дефектима, претпоставили смо да ће Хсф1 функционисати као антивирусни фактор. Брисање ХСФ1 је смртоносно, па смо користили алел осетљив на температуру хсф1-848 који потиче из раније објављене колекције сојева (61). Алел хсф1-848 је показао одсуство раста на 39 степени, средњи фенотип раста на 37 степени, и без очигледног дефекта раста на 35 степени (слика 4А). Спот тест тестови су показали да су фенотипови раста хсф1-848 на 35 степени и 37 степени у великој мери побољшани када се комбинују са нуц1∆ или ски3∆ и да су ови дефекти раста поништени код сојева који немају ЛА вирус (слика 4А) . Као што се очекивало, неодрживост свих мутантних сојева хсф1-848 је опстала у ћелијама које су узгајане на 39 степени без обзира на присуство ЛА. Штавише, користећи тетрадне дисекције, показали смо да су хсф1-848 нуц1∆ ски3∆ троструки мутанти били неодрживи на дозвољеној температури ако су били заражени ЛА, али здрави ако су изведени из соја ЛА0 (СИ Додатак, слика С6). Користећи вестерн блоттинг, открили смо да су хсф1-848 нуц1∆ и хсф1-848 ски3∆ акумулирали повећане количине ЛА Гаг у поређењу са појединачним мутантима (слика 4Б). Заједно са нашим ћелијским биолошким студијама, ови налази сугеришу да Хсф1-регулисани протеостатски одговор на стрес функционише као антивирусни систем у квасцу, супротстављајући се патогеним последицама неограничене репликације ЛА.

Како је познато да се протеостатски дефекти погоршавају и доводе до цитотоксичности на високим температурама (59), једноставан модел приписује смртоносне последице патогенезе ЛА на високим температурама катастрофалном протеостатском стресу. Да бисмо даље тестирали овај модел, третирали смо сојеве са азетидин-2-карбоксилном киселином (АЗЦ), аналогом пролина који је уграђен у протеине што доводи до ортостатског стреса (38). Ови експерименти су показали да је нуц1∆ ски3∆ показао јаку осетљивост на АЗЦ на начин који зависи од ЛА вируса (слика 4Ц и СИ додатак, слика С6). Даље, открили смо да је нуц1∆ ски3∆ показао осетљивост на 5% етанола, стање које такође узрокује протеостатске дефекте, али не и на 0.5 М НаЦл, што изазива осмотски стрес (СИ Додатак, Слика С6). Ови налази сугеришу да су смртоносне последице патогенезе ЛА посебно последица огромног протеостатског стреса.

Слика 4. Одговор топлотног шока потискује патогенезу ЛА. (А) Приказана је спот анализа сојева дефектних у ХСФ1, НУЦ1 и СКИ3 са или без ЛА. Сојеви су примећени на СЦ медијумима који садрже глукозу и узгајани на назначеној температури. (Б) Вестерн блоттинг за нивое протеина ЛА Гаг и Пгк1 назначених сојева. Маркери молекуларне тежине су назначени на десној страни. (Ц) Приказана је тачкаста анализа сојева третираних протеотоксичним аналогом пролина, азетидин-2-карбоксилном киселином (АЗЦ). Сојеви су примећени на СЦ медијуму који садржи глукозу са додатком или без 0.1 мг/мЛ АЗЦ и узгајани на 30 степени.

Дискусија

Упркос његовом свеприсутном присуству у лабораторијским сојевима, студије ЛА дсРНА вируса су ограничене због његове наизглед бенигне природе. Овде показујемо да ЛА има дубоке последице за квасац када је његова репликација неконтролисана и да различити урођени имуни системи одржавају репликацију ЛА на подношљивом нивоу. Конкретно, показујемо да је код сојева који немају паралелно делујући НУЦ1 и СКИ3 антивирусни гени, репликација ЛА масовно регулисана, што доводи до ортостатског стреса и условне смртности на високим температурама. Користећи ово ново откриће, користили смо биоинформатичке и напредне генетске екране да идентификујемо нове гене квасца који функционишу да ограниче репликацију ЛА или заштите ћелије од патогених последица необуздане ЛА репликације. Пошто ови екрани нису били засићени, геном квасца вероватно кодира бројне друге антивирусне факторе. Многе проницљиве студије су спроведене на квасцу проучавајући репликацију егзогено уведених вирусних РНК из других организама и биће занимљиво утврдити да ли антивирусни фактори ЛА делују слично на ове вирусне РНК (62, 63).

С обзиром на јасан ризик од инфекције ЛА, збуњујуће је како она ипак опстаје упркос свеприсутној антивирусној активности. Објашњење за овај парадокс може бити да ЛА пружа противтежу. Једна могућа предност ЛА је то што омогућава неким сојевима да одржавају сателитске вирусе који кодирају излучене токсине који убијају суседне неинфициране ћелије. Међутим, ЛА је присутан у многим сојевима којима недостају сателити "убице", тако да је ово објашњење недовољно да би се објаснила перзистентност ЛА инфекције. Стога спекулишемо да ЛА може имати неку загонетну корист која је противтежа његовом штетном потенцијалу.

Наше откриће Рек2 као фактора атенуације вируса проширује арсенал познатих митохондријских антивирусних фактора изван Нуц1 и сугерише да су митохондрије кључно антивирусно чвориште у квасцу. Заиста, митохондрије имају централну улогу у одбрани од вируса као програмирани регулатор ћелијске смрти и као платформа за антивирусну сигнализацију код људи. Како митохондријалне нуклеазе ублажавају вирус који се налази у цитосолу квасца? Једна од могућности је да ови ензими, иако су циљани на митохондрије, ипак могу да се акумулирају до ниских, али довољних нивоа у цитосолу да директно постигну слабљење ЛА. У складу са овом хипотезом, раније смо показали да се Нуц1 акумулира у цитосолу мејотичких ћелија, иако наше методе нису могле да га открију у цитосолу митотичких ћелија (27). Друга хипотеза је да се неки аспект циклуса репликације ЛА јавља у блиској вези са митохондријама. На пример, ЛА транскрипти се могу повезати са митохондријама и евентуално проћи кроз њих, излажући их Нуц1 и/или Рек2. Наши резултати истичу потенцијални општи значај митохондрија за вирусни урођени имунитет код еукариота и позиционирају систем квасца-ЛА као моћан модел за даља проучавања ове теме.

Антивирусни СКИ комплекс повезан са превођењем рибозома и наша идентификација Паб1, Сро9 и Слф1 као супресора високе копије патогенезе ЛА даље откривају рибозом за превођење као кључно средиште антивирусне активности квасца. Налаз да ПАБ1 (полиА везујући протеин) потискује ЛА је изненађујући с обзиром на одсуство полиА репова у ЛА транскриптима, што сугерише да Паб1 не делује директно на ЛА. Претходни налази су показали да се ЛА транскрипти такмиче са полиА+ мРНК квасца за хватање 60С рибозомалних подјединица да би се формирали транслациони 80С комплекси (64). Један модел који објашњава наше налазе је да Паб1 побољшава транслацију мРНА које садрже полиА реп, што затим исцрпљује доступност 60С подјединица за ЛА транскрипте за транслацију. Улоге Сро9 и Слф1 у преводу су мање схваћене, али се њихове функције могу на сличан начин односити на конкуренцију ЛА транскрипата за 60С подјединице. Важно је да су хомолози Паб1 и Сро9/Слф1 укључени у људску вирусну одбрану и даља истраживања ових гена у квасцу ће бацити светло на антивирусне механизме сачуване од квасца до људи.

цистанцхе биљке које повећавају имуни систем

Идентификовали смо антивирусну улогу за очувани фактор транскрипције ХСФ1 заједно са одговором на протеостатски стрес изазван ЛА који укључује акумулацију Хсп104-ГФП фокуса, маркера цитотоксичних протеинских агрегата активираног ХСФ1-. Ови резултати подржавају модел у којем је патогенеза ЛА узрокована протеотоксичним стресом. Такође смо открили антивирусну функцију за САГА комплекс, за који се показало да делује као коактиватор индукције циљног гена Хсф1 након топлотног шока (65, 66). Ова запажања сугеришу да високи нивои ЛА доводе до САГА-зависне активације циљних гена Хсф1 који затим спроводе антивирусну функцију, осветљавајући потенцијални антивирусни програм експресије гена у квасцу који пупа. Овај модел даје многа тестирана предвиђања која могу бити релевантна за вирусну патогенезу у другим организмима. Заиста, хумани ХСФ1 такође контролише експресију протеолитичких регулаторних фактора. Док су антивирусне функције хуманог ХСФ1 описане, нејасно је какву улогу у томе игра ортостатски одговор на стрес (39). Наши налази осветљавају моћан систем за уочавање антивирусне функције Хсф1 у односу на његову улогу у активацији протеостатског одговора на стрес.

референце

1. Т. Накаиасхики, ЦП Куртзман, ХК Едскес, РБ Вицкнер, приони квасца [УРЕ3] и [ПСИ+] су болести. Проц. Натл. Акад. Сци. УСА 102, 10575–10580 (2005).

2. РБ Вицкнер, Т. Фујимура, Р. Естебан, Вируси и приони Саццхаромицес церевисиае. Адв. Вирус Рес. 86, 1–36 (2013).

3. Т. Фујимура, Р. Естебан, Механизам хватања капице у дволанчаном РНА вирусу квасца. Проц. Натл. Акад. Сци. УСА 108, 17667–17671 (2011).

4. ЈД Динман, Т. Ицхо, РБ Вицкнер, А -1 рибозомални померај оквира у дволанчаном РНК вирусу квасца формира гаг-пол фузиони протеин. Проц. Натл. Акад. Сци. УСА 88, 174–178 (1991).

5. А. Бернхеим ет ал., Прокариотски виперини производе различите антивирусне молекуле. Природа 589, 120–124 (2021).

6. А. Бернхеим, Р. Сорек, Пан-имуни систем бактерија: Антивирусна одбрана као ресурс заједнице. Нат. Рев. Мицробиол. 18, 113–119 (2020).

7. АГ Јохнсон ет ал., Бактеријски умови откривају древни механизам ћелијске смрти. Наука 375, 221–225 (2022).

8. БР Морехоусе ет ал., СТИНГ циклични динуклеотидни сенсинг потиче од бактерија. Природа 586, 429–433 (2020).

9. Г. Офир ет ал., Антивирусна активност бактеријских ТИР домена преко имунолошких сигналних молекула. Природа 600, 116–120 (2021).

10. КМ Славик и сарадници, цГАС-слични рецептори осећају РНК и контролишу 3'2'-цГАМП сигнализацију у Дросопхила. Природа 597, 109–113 (2021).

11. АТ Вхителеи ет ал., Бактеријски ензими слични цГАС-у синтетишу различите нуклеотидне сигнале. Природа 567, 194–199 (2019).

12. ХМ Бургесс, И. Мохр, Целлулар 5'-3' мРНА егзонуклеаза Ксрн1 контролише дволанчану акумулацију РНК и антивирусне одговоре. Микроб ћелије домаћина. 17, 332–344 (2015).

13. СЦ Ецкард ет ал., СКИВ2Л РНА егзосом ограничава активацију рецептора сличних РИГ-И. Нат. Иммунол. 15, 839–845 (2014).

14. М. Мииасхита, Х. Осхиуми, М. Мацумото, Т. Сеиа, ДДКС60, ДЕКСД/Х бокс хеликаза, је нови антивирусни фактор који промовише сигнализацију посредовану рецептором налик РИГ-И. Мол. Целл Биол. 31, 3802–3819 (2011).

15. ЦС Нг, ДМ Касумба, Т. Фујита, Х. Луо, Просторно-временска карактеризација антивирусне активности КСРН1-ДЦП1/2 агрегације против цитоплазматских РНК вируса ради спречавања ћелијске смрти. Целл Деатх Диффер 27, 2363–2382 (2020).

16. РЕ Ригби, Ј. Рехвинкел, РНК деградација у антивирусном имунитету и аутоимуности. Трендс Иммунол. 36, 179–188 (2015).

17. Ф. Схиромото ет ал., ИЛ-1бета/АТФ3-посредована индукција експресије Ски2 појачава деградацију вируса хепатитиса Б к мРНА. Биоцхем. Биопхис. Рес. Цоммун. 503, 1854–1860 (2018).

18. ЈТ Бровн, Кс. Баи, АВ Јохнсон, Антивирусни протеини квасца Ски2п, Ски3п и Ски8п постоје као комплекс ин виво. РНА 6, 449–457 (2000).

19. ДЦ Масисон ет ал., Заваравање система деградације кап-мРНА помоћу дволанчаног РНК вируса и надзор поли(А)-мРНК од стране антивирусног система квасца. Мол. Целл Биол. 15, 2763–2771 (1995).

20. Ц. Сцхмидт ет ал., Крио-ЕМ структура комплекса рибозом-Ски2-Ски3-Ски8 хеликазе. Наука 354, 1431–1433 (2016).

21. АМ Сеарфосс, РБ Вицкнер, 3' поли(А) је неопходан за превод. Проц. Натл. Акад. Сци. УСА 97, 9133–9137 (2000).

22. ЕА Тох, П. Гуерри, РБ Вицкнер, Хромозомски мутанти суперубице Саццхаромицес церевисиае. Ј. Бацтериол. 136, 1002–1007 (1978).

23. А. Зиновјев, РК Ајупов, ИС Абаева, ЦУТ Хеллен, ТВ Пестова, Екстракција мРНК из заустављених рибозома Ски комплексом. Мол. Целл 77, 1340–1349 е1346 (2020).

24. СГ Балл, Ц. Тиртиаук, РБ Вицкнер, Генетска контрола броја копија Ла и Л-(Бц) Дсрна у системима убица САЦЦХАРОМИЦЕС ЦЕРЕВИСИАЕ. Генетика 107, 199–217 (1984).

25. Р. Естебан, Л. Вега, Т. Фујимура, 20С РНК нарнавирус пркоси антивирусној активности СКИ1/КСРН1 у Саццхаромицес церевисиае. Ј. Биол. Цхем. 283, 25812–25820 (2008).

26. ПА Ровлеи, Б. Хо, С. Бусхонг, А. Јохнсон, СЛ Савиер, КСРН1 је фактор рестрикције вируса специфичан за врсту у квасцима. ПЛоС Патог. 12, е1005890 (2016).

27. Ј. Гао ет ал., Мејотичко ослабљивање вируса кроз апоптотички пут предака. Проц. Натл. Акад. Сци. САД 116, 16454–16462 (2019).

28. ЛИ Ли, Кс. Луо, Кс. Ванг, Ендонуклеаза Г је апоптотичка ДНаза када се ослобађа из митохондрија. Натуре 412, 95–99 (2001).

29. БЈ Тхомсон, Вируси и апоптоза. Инт. Ј. Екп. Патхол. 82, 65–76 (2001).

30. МД Еаствоод, СВ Цхеунг, КИ Лее, Ј. Моффат, МД Менегхини, Развојно програмирано нуклеарно уништавање током гаметогенезе квасца. Дев. Целл 23, 35–44 (2012).

31. МД Еаствоод, МД Менегхини, Развојна координација диференцијације гамета са програмираном ћелијском смрћу у спорулирајућем квасцу. Еукариотска ћелија 14, 858–867 (2015).

32. Н. Сцхмидт ет ал., Интерактом САРС-ЦоВ-2 РНА-протеина у инфицираним људским ћелијама. Нат. Мицробиол. 6, 339–353 (2021).

33. РВ Смитх, НК Греи, Поли(А)-везујући протеин (ПАБП): Уобичајена мета вируса. Биоцхем. Ј. 426, 1–12 (2010).

34. Р. Гровер и сарадници, Миг1 егзонуклеаза спаја нуклеарне и митохондријалне транслационе програме кроз обраду РНК. Нуклеинске киселине Рес. 47, 5852–5866 (2019).

35. ЕВ Кунин, Очувани древни домен придружује се растућој суперпородици 3'-5' егзонуклеаза. Цурр. Биол. 7, Р604–606 (1997).

36. М. Сзевцзик ет ал., Хуман РЕКСО2 контролише кратке митохондријалне РНК које се генеришу обрадом мтРНК и машинама за распадање како би се спречила акумулација дволанчане РНК. Нуклеинске киселине Рес. 48, 5572–5590 (2020).

37. И. Зуо, МП Деутсцхер, Екорибонуцлеасе суперфамилиес: Структурна анализа и филогенетска дистрибуција. Нуклеинске киселине Рес. 29, 1017–1026 (2001).

38. ЕВ Троттер, Л. Беренфелд, СА Краусе, ГА Петско, ЈВ Греи, погрешно савијање протеина и повећање температуре узрокују заустављање Г1 преко заједничког механизма који зависи од фактора топлотног шока код Саццхаромицес церевисиае. Проц. Натл. Акад. Сци. УСА 98, 7313–7318 (2001).

39. А. Реиес, АЈ Наварро, Б. Диетхелм-Варела, АМ Калергис, ПА Гонзалез, Постоји ли улога ХСФ1 у вирусним инфекцијама? ФЕБС Опен Био 12, 1112–1124 (2022).

40. Ф. Вебер, В. Вагнер, СБ Расмуссен, Р. Хартманн, СР Палудан, Дволанчану РНК производе РНК вируси са позитивним ланцима и ДНК вируси, али не у количинама које се могу детектовати помоћу РНК вируса негативног ланца. Ј. Вирол. 80, 5059–5064 (2006).

41. С. Велсцх ет ал., Састав и тродимензионална архитектура места репликације и састављања вируса денга грознице. Микроб ћелије домаћина. 5, 365–375 (2009).

42. И. Фернандез де Цастро, Р. Тенорио, Ц. Рисцо, Фабрике за склапање вируса у свету липида. Цурр. Опин. Вирол. 18, 20–26 (2016).

43. ИКС Лиу, ЦЛ Диецкманн, Прекомерна производња вирусних честица квасца од стране сојева са недостатком митохондријалне нуклеазе. Мол. Целл Биол. 9, 3323–3331 (1989).

44. АВ Јохнсон, РД Колоднер, Синтетичка смртност сеп1 (крн1) ски2 и сеп1 (крн1) ски3 мутаната Саццхаромицес церевисиае је независна од вируса убице и сугерише општу улогу ових гена у контроли транслације. Мол. Целл Биол. 15, 2719–2727 (1995).

45. Ц. Старк ет ал., БиоГРИД: Опште складиште за скупове података о интеракцији. Нуклеинске киселине Рес. 34, Д535–539 (2006).

46. ​​Л. Есперт ет ал., ИСГ20, нова интерфероном индукована РНКаза специфична за једноланчану РНК, дефинише алтернативни антивирусни пут против РНК геномских вируса. Ј. Биол. Цхем. 278, 16151–16158 (2003).

47. Т. Ханекамп, ПЕ Тхорснесс, ИНТ20, бајпас супресор име1 име2, кодира претпостављену 3'-5' егзонуклеазу локализовану у митохондријама Саццхаромицес церевисиае. Цурр. Генет 34, 438–448 (1999).

48. А. ван Хооф, П. Леннертз, Р. Паркер, Три очувана члана РНасе Д породице имају јединствене и преклапајуће функције у обради 5С, 5.8С, У4, У5, РНасе МРП и РНасе П РНК у квасцу . ЕМБО Ј. 19, 1357–1365 (2000).

49. М. Двиведи, НЦ Ладдха, Р. Бегум, Корелација повећане експресије МИГ1 и полиморфизма његовог промотера са прогресијом болести и већом осетљивошћу код пацијената са витилигом. Ј. Дерматол. Сци. 71, 195–202 (2013).

50. К. Кинго ет ал., МИГ1, нови ген везан за меланоците, има повишену експресију код витилига. Ј. Дерматол. Сци. 44, 119–122 (2006).

51. ИБ Андика, А. Јамал, Х. Кондо, Н. Сузуки, САГА комплекс посредује у транскрипционој уп-регулацији утишавања антивирусне РНК. Проц. Натл. Акад. Сци. САД 114, Е3499–Е3506 (2017).

52. СГ Собел, СЛ Волин, Два протеина квасца који садрже Ла мотив су протеини који се везују за РНК који се повезују са полирибозомима. Мол. Биол. Целл 10, 3849–3862 (1999).

53. А. Провеллер, ЈС Бутлер, Рибозомска асоцијација поли(А)-везујућег протеина у поли(А)-дефицитарном Саццхаромицес церевисиае. Ј. Биол. Цхем. 271, 10859–10865 (1996).

54. ДЕ Гордон и сарадници, Мапа интеракције протеина САРС-ЦоВ-2 открива циљеве за поновну намену лека. Природа 583, 459–468 (2020).

55. О. Брандман ет ал., Комплекс контроле квалитета везан за рибозоме покреће деградацију пептида у настајању и сигнализира стрес при транслацији. Целл 151, 1042–1054 (2012).

56. Ј. Анцкар, Л. Систонен, Регулација функције ХСФ1 у одговору на топлотни стрес: Импликације у старењу и болести. Анну. Рев. Биоцхем. 80, 1089–1115 (2011).

57. Ј. Ли, Ј. Лаббадиа, РИ Моримото, Ретхинкинг ХСФ1 у стресу, развоју и здрављу организма. Трендс Целл Биол. 27, 895–905 (2017).

58. ПК Соргер, ХР Пелхам, Пречишћавање и карактеризација протеина који везује елемент топлотног шока из квасца. ЕМБО Ј. 6, 3035–3041 (1987).

59. ЕЈ Солис ет ал., Дефинисање суштинске функције квасца Хсф1 открива компактни транскрипциони програм за одржавање еукариотске протеостазе. Мол. Целл 63, 60–71 (2016).

60. ЈР Гловер, С. Линдкуист, Хсп104, Хсп70 и Хсп40: Нови систем пратиоца који спасава претходно агрегиране протеине. Целл 94, 73–82 (1998).

61. З. Ли ет ал., Систематско истраживање есенцијалне функције гена квасца са мутантима осетљивим на температуру. Нат. Биотецхнол. 29, 361–367 (2011).

62. РИ Зхао, Квасац за истраживање вируса. Мицроб. Целл 4, 311–330 (2017).

63. Т. Панавас, Е. Сервиене, Ј. Брасхер, ПД Наги, Екран у целом геному квасца открива различите скупове гена домаћина који утичу на репликацију РНК вируса. Проц. Натл. Акад. Сци. УСА 102, 7326–7331 (2005).

64. И. Охтаке, РБ Вицкнер, Пропагација вируса квасца критично зависи од концентрације слободне 60С рибозомалне подјединице. Мол. Целл Биол. 15, 2772–2781 (1995).

65. СБ Кремер, ДС Гросс, САГА и Рпд3 комплекси за модификацију хроматина динамички регулишу структуру и експресију гена топлотног шока. Ј. Биол. Цхем. 284, 32914–32931 (2009).

66. МД Леацх ет ал., Хсф1 и Хсп90 оркестрирају глобално транскрипционо ремоделовање и архитектуру хроматина зависно од температуре у Цандида албицанс. Нат. Цоммун. 7, 11704 (2016).

67. ЦС Ситрон, ЈХ Парк, ЈМ Гиафаглионе, О. Брандман, Агрегација ЦАТ репова блокира њихову деградацију и узрокује протеотоксичност код С. церевисиае. ПЛоС Оне 15, е0227841 (2020).

68. Л. Магтанонг ет ал., Мреже генетичких интеракција за сузбијање дозе побољшавају функционалне дијаграме ожичења ћелије. Нат. Биотецхнол. 29, 505–511 (2011).

69. В. Биланцхоне ет ал., Ти3 ретротранспозон отима парењем тела за обраду РНК квасца како би инфицирала нове геноме. ПЛоС Генет. 11, е1005528 (2015).

70. Л. Руан ет ал., Цитосолна протеостаза кроз увоз погрешно савијених протеина у митохондрије. Природа 543, 443–446 (2017).