Ефекти Цистанцхе Десертицола на пролиферацију, апоптозу и миграцију Т-47Д ћелијске линије рака дојке регулацијом ЛнцРНА ЛИФР-АС1

[Апстрактан]Циљ Да се ​​испитају ефекти Цистанцхе десертицола на пролиферацију, апоптозу и миграцију ћелијске линије рака дојке Т-47Д и њену регулацију на дуголанчану некодирајућу (Лнц) РНК инхибиторни фактор леукемије рецептор антисенс РНК-1 (ЛИФР-АС1). Метода Т-47Д ћелије су култивисане у различитим концентрацијама (100, 200, 400 μ). Култивисати водени екстракт Цистанцхе десертицола у медијуму културе од г/мл током 24 сата, подељен у групе са ниским, средњим и високим дозама Цистанцхе десертицола. У исто време, нормалне култивисане ћелије су коришћене као контролна група. Трансфицирајте си-НЦ и си-ЛИФР-АС1 у Т-47Д ћелије и додајте 400 μ Култивишите са г/мл културе Цистанцхе десертицола медијум у трајању од 24 сата, укључујући Цистанцхе десертицола високе дозе плус си-НЦ групу и Цистанцхе десертицола високу дозу плус си-ЛИФР-АС1 групу.Флуоресцентна квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену (кРТ ПЦР) је коришћена за детекцију експресије ниво ЛИФР-АС1; Детекција пролиферације ћелија помоћу теста клонирања плоче; Коришћење проточне цитометрије за откривање ћелијског циклуса и стопе апоптозе; Способност миграције ћелија је тестирана сцратцх тестом. Резултати У поређењу са контролном групом, ниво експресије и стопа апоптозе ЛИФР-АС1 у средњим и високим дозама групе Цистанцхе десертицола значајно је повећан, број клонова је значајно смањен, удео Г0-Г1 ћелија је значајно повећан, а удео С ћелија и зарастања огреботина стопа је значајно смањена (П<0 05); Compared with Cistanche deserticola high-dose+si NC group, the number of clones formed in Cistanche deserticola high-dose+si LIFR-AS1 group was significantly increased, the proportion of G0-G1 cells and the apoptosis rate were significantly reduced, and the proportion of S cells and the scratch healing rate were significantly increased (P<0 05). Conclusion Cistanche deserticola can induce cell cycle arrest by up-regulating the expression of LIFR-AS1, thereby reducing the proliferation of breast cancer cells, inducing apoptosis, and inhibiting cell migration.

[Кључне речи] Цистанцхе десертицола; Дуголанчана некодирајућа (Лнц) РНК инхибиторни фактор рецептора леукемије антисенс РНК-1 (ЛИФР-АС1); Карцином дојке; Пролифератион; Апоптоза; трансфер

Рак дојке је један од честих малигних тумора у клиникама. Стопа инциденције рака дојке у Кини је чак 12,5 процената 2 процента, стопа излечења раног рака дојке је већа од 86 процената, али још увек не постоји ефикасан маркер за рану дијагнозу карцином дојке. Радиоцхемицал · 624 · Цхинесе Јоурнал оф Геронтологи Вол.43, јануар 2023, и други свеобухватни третмани могу побољшати ефекат лечења пацијената, али је прогноза пацијената лоша. Тренутно, патогенеза рака дојке није разјашњена. Претходне студије су показале да хиперозид, апигенин и други лекови имају ефекте против рака дојке, међутим, специфичан механизам његовог деловања још није разјашњен [1-4].

Ефекти Цистанцхе-Антитумор

Цистанцхе десертицола припада вишегодишњој биљци винове лозе из породице Рубиацеае, која има ефекте тонизирања јанга бубрега и распршивања вјетра и влаге. Истраживања су показала да Цистанцхе десертицола има фармаколошке ефекте као што су антитуморски и антиоксидативни ефекти [5]. Међутим, терапеутски ефекат Цистанцхе десертицола на рак дојке и његов могући механизам није разјашњен. Дуголанчана некодирајућа (Лнц) РНК инхибиторни фактор рецептора леукемије антисенс РНК-1 (ЛИФР-АС1) је ниско изражена код рака дојке и може да регулише пролиферацију и миграцију ћелија [6]. Међутим, није познато да ли се ЛИФР-АС1 може користити као терапеутска мета Цистанцхе десертицола против рака дојке. Ова студија је требало да истражи да ли Цистанцхе десертицола може утицати на пролиферацију, апоптозу и миграцију Т-47Д ћелија рака дојке регулацијом ЛИФР-АС1.

1 Материјал и методе

1.1 Материјали и реагенси

Цистанцхе десертицола (20190203) је купљен од Бозхоу Баицхуан Пхармацеутицал Цо., Лтд; Ћелија рака дојке Т-47Д је купљена од Гуангзхоу Саику Биотецхнологи Цо., Лтд.; Липофецтамине2000 (20190412) и комплет за детекцију апоптозе (20181223) су купљени од Беијинг Солаибао Тецхнологи Цо., Лтд.; Тризол реагенс (20181203) је купљен од Беијинг Куансхијин Биотецхнологи Цо., Лтд; Реагенси за детекцију реверзне транскрипције (20181103) и флуоресцентне квантитативне ланчане реакције полимеразе (ПЦР) (20181116) су купљени од Беијинг Тианген Биоцхемицал Тецхнологи Цо., Лтд; Си-НЦ и си-ЛИФР-АС1 су купљени од Схангхаи Јима Пхармацеутицал Тецхнологи Цо., Лтд; Анти-хумани Б-ћелијски лимфом зеца (Бцл) -2 и антитела везана за Бцл-2 Кс протеин (Бак) су купљена од компаније Санта Цруз у Сједињеним Државама; Козје анти-зечје ИгГ секундарно антитело обележено пероксидазом рена (ХРП) купљено је од Вухан Доцтор Биоенгинееринг Цо., Лтд. СтепОнеПлус квантитативни ПЦР инструмент за флуоресценцију у реалном времену је купљен од АБИ Цорпоратион у Сједињеним Државама; ФАЦС Цалибур проточна цитометрија је купљена од компаније Бецкман Курт Цомпани у Сједињеним Државама.

Здравствене предности праха Цистанцхе-Антитумор

Кликните овде да видите Цистанцхе производе

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

1.2 Експериментално груписање

Водени екстракт Цистанцхе десертицола [7]: Измерити 100 г лека Моринда оффициналис, потопити у воду 30 минута, а затим кувати 60 минута. Процедити водени изварак и поново кувати 45 минута. Филтрат се сакупи два пута и концентрује под сниженим притиском до запремине од 160 мл. Охладите га и инкубирајте у фрижидеру 24 сата. Након центрифугирања на 3000 о/мин, узети супернатант са концентрацијом лека од 2 г/мл. Разблажите раствор културе до потребне концентрације од 100, 200 и 400 μг/мл. Т-47Д ћелије су култивисане у различитим концентрацијама (100, 200, 400 μ). Култивисати водени екстракт Цистанцхе десертицола у медијуму за културу од г/мл током 24 сата, подељен у групе ниске, средње и високе дозе Цистанцхе десертицола. Истовремено, нормалне култивисане ћелије су коришћене као контролна група. Трансфицирајте си-НЦ и си-ЛИФР-АС1 у Т-47Д ћелије и додајте 400 μ медијум за културу г/мл Цистанцхе десертицола култивисан је током 24 сата, укључујући високо дозу Цистанцхе десертицола плус си-НЦ групу и високо дозу Цистанцхе десертицола плус си-ЛИФР-АС1 групу.

1.3 Детекција нивоа експресије ЛИФР АС1 користећи квантификацију флуоресценције у реалном времену (кРТ) - ПЦР

Укупна РНК Т-47Д ћелија у свакој групи је екстрахована коришћењем Тризол методе и реверзно транскрибована да би се синтетизовала цДНК. ДеРНА ензим (ДЕПЦ) је додат и разблажен 20 пута у води пре него што је чуван у фрижидеру од -20 степени. кРТ-ПЦР систем и реакциона процедура су функционисали у складу са упутствима комплета за квантитативно детекцију флуоресценције и детектована је релативна експресија ЛИФР-АС1 (интерна референтна ГАПДХ) у ћелијама.

1.4 Експеримент клонирања плоче

Инокулирајте Т-47Д ћелије у свакој групи на 6-плочу (1 × 103 ћелије/бунарићу), а затим их ставите у инкубатор за даљу култивацију током 14 дана. Исперите претходно охлађеним фосфатним пуфером (ПБС) и додајте метанол (500 μл) Ставите у фрижидер на -20 степени 20 минута, баците метанол и додајте 1 процентни раствор кристално љубичастог бојења (400 μл) Инкубирајте на собној температури 15 минута и испрати дестилованом водом. Након сушења, посматрајте број формираних клонова.

1.5 Експеримент детекције ћелијског циклуса

Т-47Д ћелије у свакој групи (1 × Инокулирајте 105 комада/мл на плоче са 96 бунарчића (100 μЛ/бунарић), центрифугирајте при брзини од 3000 о/мин 5 минута, одбаците супернатант и додајте пре -охлађене ПБС ресуспендоване ћелије (500 μл) Додати претходно охлађени етанол (70 процената) у ћелијску суспензију, одбацити супернатант и додати РНазуА (50 μл) Додати раствор за бојење пропидијум јодида (ПИ) (450) после { {13}}минутно водено купатило на 37 степени μ л) Инкубирајте га у фрижидеру од 4 степена 30 минута и анализирајте пропорцију ћелијских циклуса у свакој групи користећи ФАЦС Цалибур проточну цитометрију и софтвер Фловјои.

Пустињски живи цистанцхе

1.6 Детекција стопе апоптозе ћелије проточном цитометријом

Додајте претходно охлађени ПБС у Т-47Д ћелије ради испирања, одбаците супернатант и додајте 500 у ћелијски преципитат μ Ресуспендујте ћелије са пуферским раствором, радите према комплету за детекцију апоптозе и откријте брзину апоптозе ћелије.

1.7 Тест огреботина

Инокулирајте Т{{0}}Д ћелије на 6-плочу (1 × 103/бунарићу), након што се свака група обради, нацртајте линију у хоризонталном правцу на дно плоче за културу као референца. После 48 сати култивације, поново повуците линију и посматрајте ширину огреботине у две тачке да бисте израчунали брзину зарастања огреботине [(ширина огреботине 0 х - ширина огреботине 48 х)/ширина огреботине 0 х × 100 процената 〕.

1.8 Вестерн блот детекција експресије протеина Бак и Бцл-2

Након екстракције укупног протеина Т{{0}}Д ћелија, детектујте концентрацију протеина и узмите одговарајућу количину узорака протеина за СДС ПАГЕ реакцију. Након преноса мембране и заптивања, додајте први разблаживач антитела (1:1000) и други разблаживач антитела (1:5000) и користите аутоматски систем за снимање гела да анализирате сиву вредност сваке траке протеина. 1.9 Статистичка обрада помоћу СПСС 21 Извршите т-тест и једносмерни АНОВА користећи софтвер 0.

Експериментална студија о Цистанцхе десертицола

2 Ресултс

2.1 Ефекти Цистанцхе десертицола на Т-47Д пролиферацију и експресију ЛИФР-АС1

У поређењу са контролном групом, ниво експресије ЛИФР-АС1 у средњим и високим дозама групе Цистанцхе десертицола био је значајно већи, број клонова је значајно смањен, удео ћелија Г0-Г1 фазе је значајно већи. , а удео ћелија С фазе био је значајно мањи, а разлике сваког индекса између средњих и високих дозних група Цистанцхе десертицола десертицола биле су статистички значајне (све П<0. 01) 05), but there was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells among the groups (P>0 05), погледајте табелу 1.

2. 2 Ефекат Цистанцхе десертицола на Т-47Д апоптозу

У поређењу са контролном групом, стопа апоптозе и ниво Бак протеина у средњим и високим дозама Цистанцхе десертицола значајно су порасли, док је ниво Бцл-2 протеина значајно смањен. Разлике у различитим показатељима између средњих и високих доза групе Цистанцхе десертицола биле су статистички значајне (сви П<0. 05) 05), as shown in Table 1, Figure 1, and Figure 2

Табела 1 Ефекти Цистанцхе десертицола на формирање клонова Т-47Д ћелијског циклуса, експресију ЛИФР-АС1 и ћелијску апоптозу (к ± с, н=3)

У поређењу са контролном групом: 1) П<0 05; Compared with the low-dose group of Cistanche deserticola: 2) P<0 05; Compared with the medium and low dose group of Cistanche deserticola: 3) P<

Слика 1: Ефекат Цистанцхе десертицола на апоптозу Т-47Д у свакој групи

1-4: Контролна група, група ниске дозе Цистанцхе десертицола, група средње дозе Цистанцхе десертицола, група високе дозе Цистанцхе десертицола

Слика 2. Ефекат Цистанцхе десертицола на експресију Т-47Д апоптотичког протеина

2.3 Ефекат Моринда оффициналис на миграцију Т-47Д

У поређењу са контролном групом [({{0}} ± 1. 39) проценат поређења, групом средње дозе Цистанцхе десертицола [(43 56 ± 1.00 проценат, и Стопа зарастања огреботина у групи са високом дозом Цистанцхе десертицола [(23 87 ± 0,72 процента ] значајно се смањила, а група са високим дозама Цистанцхе десертицола била је значајно нижа од групе са средњом дозом Цистанцхе десертицола (П<0 05).

2.4 Ефекатометање ЛИФР-АС1 на пролиферацију Т-47Д третираног са Цистанцхе десертицола

У поређењу са групом Цистанцхе десертицола високе дозе плус си НЦ, број клонова формираних у групи Цистанцхе десертицола високе дозе плус си ЛИФР-АС1 значајно се повећао, удео Г0-Г1 ћелија се значајно смањио, а повећан удео С ћелија (П<0 There was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells between the two groups (P>0. 05) 05), видети табелу 2.

Табела 2 Ефекти ометања ЛИФР-АС1 на Т-47Д ћелијски циклус, клоногенезу, апоптозу и миграцију у третманима Цистанцхе десертицола (к ± с, н=3)

2. 5 Ефекат ометања ЛИФР-АС1 на Т-47Д апоптозу изазвану третманом Цистанцхе Десертицола

У поређењу са високом дозом плус си-НЦ групом Цистанцхе десертицола, стопа апоптозе, ниво Бак протеина и ниво Бцл-2 протеина у високој дози плус си-ЛИФР-АС1 групе Цистанцхе десертицола су значајно смањени (П<0 05), see Table 2, Figure 3, and Figure 4.

Ефекат интерференције 2.6 са ЛИФР-АС1 на миграцију Т-47Д и експресију ЛИФР-АС1 у ћелијама третираним Цистанцхе десертицола

У поређењу са високодозном плус си-НЦ групом Цистанцхе десертицола, стопа зарастања огреботина у групи Цистанцхе десертицола са високом дозом плус си-ЛИФР-АС1 је значајно повећана, а експресија ЛИФР-АС1 је значајно смањена (П<0 05), see Table 2.

Слика 3 Ефекат ометања ЛИФР-АС1 на Т-47Д апоптозу у лечењу Цистанцхе десертицола

1-2, Цистанцхе десертицола висока доза плус си-НЦ група, Цистанцхе десертицола висока доза плус група си-ЛИФР-АС1

Слика 4: Ефекат ометања ЛИФР-АС1 на експресију Т-47Д протеина апоптозе у лечењу Цистанцхе десертицола

3 Дискусија

Кинески биљни лек има антиинфекцијске, антитуморске и друге ефекте. Блага је и може ефикасно да ублажи неке симптоме код пацијената, али је патогенеза рака дојке сложенија. Молекуларни механизам кинеске биљне медицине против рака дојке још није разјашњен [8~10]. Цистанцхе десертицола има ефекте побољшања имунитета, антиоксидације и ефикасног лечења остеопорозе, али њен специфичан механизам деловања још није познат [11,12]. Резултати ове студије сугеришу да Цистанцхе десертицола може да смањи пролиферацију ћелија рака дојке изазивањем заустављања ћелијског циклуса и може да промовише апоптозу ћелија рака дојке и инхибира ћелијску миграцију ћелија рака дојке.

Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор

Смањење експресије ЛИФР-АС1 повезано је са лошим преживљавањем код рака желуца [13]. ЛИФР-АС1 инхибира инвазију и метастазе карцинома плућа не-малих ћелија преко оси миР-942-5п/протеина цинковог прста (ЗНФ) 471 [14]. Ови резултати сугеришу да ометање експресије ЛИФР-АС1 може значајно да преокрене ефекте Цистанцхе десертицола на пролиферацију, апоптозу и миграцију ћелија рака дојке.

Да сумирамо, Цистанцхе десертицола може да изазове заустављање ћелијског циклуса, ослаби способност пролиферације ћелија рака дојке, промовише ћелијску апоптозу и инхибирати миграцију ћелија. Његов механизам је повезан са регулацијом експресије ЛИФР-АС1.

Кинеска трава цистанцхе-Антитумор

4 Референце

1 Си Л, Фу Ј, Лиу В, ет ал. Силибинин инхибира миграцију и инвазију МДА-МБ-231 ћелија рака дојке путем индукције митохондријалне фузије〔Ј〕．Мол Целл Биоцхем, 2020; 463( 1-2): 189-201.

2 Киу Ј, Зханг Т, Зху Кс, ет ал. Хиперозид индукује апоптозу ћелија рака дојке преко ＲОС-посредованог НФ-κБ сигналног пута〔Ј〕．Инт Ј Мол Сци, 2019; 21( 1) : 131-41.

3 Вон ИС,Сео КИ. Лупивајтеон индукује апоптозу зависну од каспазе и независну апоптозу на људским ћелијама рака дојке путем инхибиције ПИ3К/Акт/мТОＲ пута〔Ј〕. Фоод Цхем Токицол, 2020; 135 ( 1 ) : 110863-9.

4 Бауер Д, Маззио Е, Солиман КФА. Целокупна транскриптомска анализа апигенина на ТНФ-имуно-активираним МДА-МБ-231 ћелијама рака дојке〔Ј〕．Цанцер Геномицс Протеомицс, 2019; 16( 6) : 421-31.

5 Лаи Манкианг, Руан Зхииан, Ксу Иипинг Напредак истраживања о фармаколошким ефектима тонизирања бубрега традиционалне кинеске медицине Цистанцхе десертицола [Ј]. Азијско-пацифичка традиционална медицина, 2017; 13( 1) : 63-4.

6 Ксу Ф,Ли Х,Ху Ц. ЛИФＲ-АС1 модулира Суфу да инхибира пролиферацију и миграцију ћелија миＲ-197-3п код рака дојке〔Ј〕．Биосци Ｒеп, 2019; 39( 7) : 1-9.

7 Илизати Кхалифу Ефекат воденог екстракта Цистанцхе десертицола на експресију ЕГФР и ХЕР-2 протеина у ћелијама остеосаркома ин витро [Д]. Пекинг: Медицински универзитет у Пекингу, 2019

8 Кусхваха ПП,Вардхан ПС,Капеванголо П,ет ал．Булбине фрутесценс пхитоцхемицал инхибира сигнални пут зарезивања и индукује апоптозу у троструко негативним и луминалним ћелијама рака дојке〔Ј〕．Лифе Сци,2019; 234( 1) : 116783-9.

9 Зхао З, Јин Г, Ге И и др. Нарингенин инхибира миграцију ћелија рака дојке путем сигналних путева ћелија упале и апоптозе 〔Ј〕．Инфламмофармацологи, 2019; 27( 5) : 1021-36.

10 Зан Л, Цхен К, Зханг Л, ет ал. Епигалокатехин галат (ЕГЦГ) потискује раст и туморигеност ћелија рака дојке смањењем регулације миＲ-25〔Ј〕．Биоенгинееред,2019; 10( 1) : 374-82.

11 Зханг Ксуекин, Ксиао Лиуиинг, Пан Јингкианг Ефекат Цистанцхе десертицола на пролиферацију туморских ћелија миша и експресију Бак и Бцл-2 протеина [Ј]. Традиционална кинеска медицина, 2011; 34( 4) : 598-601.

12 Ли Иимин, Цхен Јиан, Хе Јианкуан, ет ал. Ефекат серума са лековима Цистанцхе десертицола на експресију протоонкогена и мРНК фактора везивања језгра 1 у систему кокултуре остеобласта остеокласта ［Ј］. Кинески часопис за геронтологију, 2015; 35( 9): 2328-31.

13 Ванг ХФ, Лв ЈК, Ли ХХ, ет ал. Висока дуга некодирајућа експресија ЛИФＲ-АС1 корелира са лошим преживљавањем код карцинома желуца〔Ј〕. Еур Ｒев Мед Пхармацол Сци, 2020; 24( 10) : 5378-84.

14 Ванг К,Ву Ј,Хуанг Х,ет ал．лнцＲНА ЛИФＲ-АС1 потискује инвазију и метастазе не-ситноћелијског карцинома плућа преко осе миＲ-942- 5п /ЗНФ471〔Ј〕．Цанцер Целл Инт;,,Цанцер Целл Инт; 20( 1) : 180190.